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文檔簡介
關于細胞增殖與分化的調控機制及異常細胞增殖是生命的基本特征,種族繁衍、個體發(fā)育、機體修復等都離不開細胞增殖。–初生嬰兒有1012個細胞,成人1014個,約200種類型。–成人體內每秒鐘有數百萬新細胞產生,以補償衰老和死亡的細胞。動物任何組織細胞進行分裂增殖,都受細胞周期調節(jié)系統的調節(jié),也受個體發(fā)育不同階段的發(fā)育調節(jié)。這些調節(jié)的基礎是基因按一定的時間和空間順序選擇性地進行表達。
第2頁,共136頁,2024年2月25日,星期天20世紀70年代LelandHartwell提出了“細胞周期檢驗點”(cellcycle
checkpoint)概念。最先找到了用于研究真核細胞周期的合適模型——酵母細胞,通過研究他進一步提出了細胞分裂基因的概念,即cdc(celldivisioncycle)基因。20世紀80年代TimHunt發(fā)現周期蛋白
(cyclin)。1990年,PaulNurse發(fā)現周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin-dependentkinase,CDK)。2001年10月8日美國人Leland
Hartwell、英國人PaulNurse、Timothy
Hunt因對細胞周期調控機理的研究而榮獲諾貝爾生理醫(yī)學獎。第3頁,共136頁,2024年2月25日,星期天第4頁,共136頁,2024年2月25日,星期天第一節(jié)生長因子信號轉導活化細胞周期進程是細胞增殖的分子機制第5頁,共136頁,2024年2月25日,星期天一、細胞經歷細胞周期而增殖
FigureA.1.CellCycle.第6頁,共136頁,2024年2月25日,星期天第7頁,共136頁,2024年2月25日,星期天G1期(firstgapphase):限制點(restrictionpoint,R點);繼續(xù)增殖,進入G0期,停止增殖。S期(syntheticphase):DNA復制,與組蛋白包裝成染色質,合成PCNA(proliferatingcellnuclearantigen)G2期(secondgapphase):染色質螺旋化,合成MPF。M期(mitoticphase):有絲分裂。MG1SG2G0cyclinD1,D2,D3+CDK2,4,5,6cyclinE+CDK2cyclinA+CDK2cyclinA,B+cdc2R第8頁,共136頁,2024年2月25日,星期天細胞周期的稽查點稽查點(checkpoint)限制點(restriction
point)細胞周期四個稽查點:
G1/SS/G2
G2/MM/G1第9頁,共136頁,2024年2月25日,星期天第10頁,共136頁,2024年2月25日,星期天二、有許多蛋白質參與調控細胞周期進程Cyclin周期素或周期蛋白Cdk:cyclin-dependentkinaseCKI:第11頁,共136頁,2024年2月25日,星期天(一)周期蛋白和周期蛋白依賴性激酶復合物驅動細胞周期進展ComplexofcyclinA(yellow)withcyclindependentkinase2.MoleculeATPishighlightedintheactivesiteoftheCDK2.
第12頁,共136頁,2024年2月25日,星期天Cyclin:周期蛋白或周期素1.受生長因子的誘導表達;2.泛素介導的其蛋白質降解;3.含有周期蛋白框(cyclinbox)的一致性共有序列,是周期蛋白依賴激酶Cdk的調節(jié)亞單位。
Cyclinbox:一段含有約100個氨基酸序列的區(qū)域,是介導周期蛋白與Cdk催化亞基結合的關鍵部位。第13頁,共136頁,2024年2月25日,星期天第14頁,共136頁,2024年2月25日,星期天Cdk是組成型表達的核內絲-蘇氨酸蛋白激酶。在細胞周期不同時相中,不同的cyclins的集聚與相應CDKs結合并被激活。CDK激活的底物主要有RB、轉錄因子、組蛋白、細胞結構蛋白等,具有促進細胞周期時相轉變、啟動DNA合成、運行細胞分裂、推進細胞周期運行的重要功能。第15頁,共136頁,2024年2月25日,星期天第16頁,共136頁,2024年2月25日,星期天CDK1;cyclinA,cyclinB
CDK2;cyclinA,cyclinE
CDK3
CDK4;cyclinD1,cyclinD2,cyclinD3
CDK5;CDK5R1,CDK5R2.CDKL5.CDK6;cyclinD1,cyclinD2,cyclinD3
CDK7;cyclinH
CDK8;CDK9;cyclinT1,,,cyclinK
CDK10
CDK11(CDC2L2)
;CDK12(CRKRS)
;CDK13(CDC2L5)
;AlistofCDKswiththeirregulatorprotein,cyclinorother第17頁,共136頁,2024年2月25日,星期天第18頁,共136頁,2024年2月25日,星期天StructureofpCDK2(ingreen)incomplexwithcyclinE1(incyan)withthe20-amino-acidsequence(residues230–249)thatareinvolvedincentrosomelocalisation(MatsumotoandMaller,2004)showninred.ThePSTAIRE(C-)helixandtheactivationsegment,thetwomajorregionsofcontactbetweenpCDK2andcyclinE1,areshowninmagenta.第19頁,共136頁,2024年2月25日,星期天(二)CKI抑制Cdk及Cyclin-Cdk復合物的活性Cyclin-dependentkinaseinhibitorsCKI分兩類:1.Cdk4/Cdk6抑制因子家族有P15、P16、P18、P19等。抑制CyclinD與Cdk4/Cdk6結合,及其復合物的激酶活性。2.Cip/Kip家族Cytokine-inducibleprotein/kinaseinteractingprotein有P21、P27、P57等。是細胞接受到接觸抑制、DNA損傷、低氧及某些細胞因子等信號后的產物;與Cyclin-Cdk復合物結合,抑制它們的活性。第20頁,共136頁,2024年2月25日,星期天1.Cdk4/Cdk6抑制因子家族2.Cip/Kip家族第21頁,共136頁,2024年2月25日,星期天(三)Rb蛋白與轉錄因子E2F-DP1的結合對G1期產生負調節(jié)作用Retinoblastomaprotein(pRbor
Rb)Pocketproteinfamilyconsistsofthreeproteins:RB(P105RB)、P107和P130。Rb蛋白第22頁,共136頁,2024年2月25日,星期天Rb/E2Ffamilies.ThereareonlytwomembersofE2Finfliescomparetoeightinmammals.第23頁,共136頁,2024年2月25日,星期天游離的E2F-DP1活化靶基因轉錄,包括:①核苷酸及DNA合成酶的基因;②周期蛋白D、E、A、Cdk2等;③某些癌基因;④E2F基因本身。第24頁,共136頁,2024年2月25日,星期天(四)使Cdk磷酸化和去磷酸化的酶也調節(jié)Cdk的活性第25頁,共136頁,2024年2月25日,星期天CDK1的調節(jié)與活化;CAK=CDK1-ActivitingKinase第26頁,共136頁,2024年2月25日,星期天(五)泛素-蛋白酶體介導蛋白質降解也起調節(jié)細胞周期的作用短命蛋白通過多泛素化途徑降解,如Cyclin、P21、P27、E2F、Weel等。第27頁,共136頁,2024年2月25日,星期天第28頁,共136頁,2024年2月25日,星期天參與細胞周期調控的泛素連接酶至少有兩類SCF(skp1-cullin-F-boxprotein,三個蛋白構成的復合體)負責將泛素連接到G1/S期周期蛋白(D、E)和p21、p27、E2F、Weel上;APC(anaphasepromotingcomplex)負責將泛素連接到M期周期蛋白(A、B)上。
第29頁,共136頁,2024年2月25日,星期天第30頁,共136頁,2024年2月25日,星期天第31頁,共136頁,2024年2月25日,星期天三、調控蛋白協同作用調控細胞周期(一)Cdk4/6和Cdk2的活化是限制點處調控的關鍵第32頁,共136頁,2024年2月25日,星期天(二)Cdk1活化是G2M關卡處關鍵調控因素CyclinB在G1后期胞漿中合成,并在胞漿-胞核間穿梭,在核內與Cdk1結合形成復合物也加入穿梭行列,此時Cdk被磷酸化,無活性。在G2-M轉折,Cdc25C被活化,使Cdk1的14位和15位氨基酸殘基去磷酸化,而活化CyclinB-Cdk1,后者磷酸化地物蛋白,如組蛋白1、核纖層蛋白、肌球蛋白等,使染色體致密,核膜解體,紡錘體開始形成等。第33頁,共136頁,2024年2月25日,星期天(三)APC介導的多泛素化蛋白降解是細胞離開M期進入G1期的關鍵調控因素第34頁,共136頁,2024年2月25日,星期天(四)DNA損傷關卡與G1及G2期停滯相關1.G2期的停滯涉及一系列的磷酸化過程Sensorproteins傳感蛋白ATMATR(ATMandRad3related)Chk(checkpointkinase)Cdc25C-14-3-3核內→胞漿核內的Cdk1不能被活化,停滯于G2。第35頁,共136頁,2024年2月25日,星期天第36頁,共136頁,2024年2月25日,星期天2.轉錄因子P53能使細胞停滯在G1期和G2期第37頁,共136頁,2024年2月25日,星期天四、生長因子等細胞外因素通過信號轉導調控細胞周期第38頁,共136頁,2024年2月25日,星期天(一)細胞從G0期進入細胞周期依賴多種生長因子的協同促進作用有的組織細胞在從分裂期向S期發(fā)展時,在G1期中斷,形成G0期細胞群的組織(水晶體上皮和膀胱上皮等),有的組織細胞在從S期向分裂期發(fā)展時,以G2期那樣的狀態(tài)中斷,形成G0期細胞群的組織(耳的上皮)。但是,即使幾乎完全失去分裂能力的已分化的組織細胞通常也可依靠人工培養(yǎng)、人工致癌等方法恢復其分裂能力。因此,所有的分化細胞都是G0期,G0期只不過是細胞周期中G1期或G2期的無限延長,而不是細胞周期中G1期或G2期的中斷和脫離。第39頁,共136頁,2024年2月25日,星期天(二)G1期的細胞也需要生長因子促進細胞周期的進程第40頁,共136頁,2024年2月25日,星期天第二節(jié)細胞增殖異常與疾病AbnormalCellProliferationandRelatedofDisease第41頁,共136頁,2024年2月25日,星期天裸鼠的結腸癌病理模型復制胃癌手術后腫瘤細胞轉移患者(患者處于惡液質狀態(tài))瘤細胞為什么會發(fā)生?第42頁,共136頁,2024年2月25日,星期天細胞增殖分化異常與相關疾病增殖異常分化異常增殖分化異常再生障礙性貧血肥胖癥惡性腫瘤白癜風遺傳性血紅蛋白病銀屑病前列腺肥大肌營養(yǎng)不良畸胎瘤動脈粥樣硬化先天畸形家族性紅細胞增多癥X-連鎖-球蛋白缺乏癥高IgM血癥細胞周期異常與疾?。ˋbnormalcellcycle&diseases)細胞過度增殖或不足的本質是細胞周期調控異常?!綝eregulationofcellcycle】■細胞周期的驅動失控(Cyclin、CDK和CDI表達異常)■監(jiān)控(檢查)機制受損(Theimpairmentofcheckpointsystem)細胞增殖異常第43頁,共136頁,2024年2月25日,星期天1.細胞周期驅動機制失控
■Cyclins的過表達(Overexpressionofcyclins)腫瘤的發(fā)生與cyclin(D、E)過量表達有關。
【CyclinD1(Bcl-1)過表達原因】(原癌基因)
▲基因擴增(CyclinD1過表達的主要機制)乳腺癌、胃癌、食道癌存在CyclinD1基因擴增過度。細胞增殖異常▲染色體倒位(Chromosomeinversion)CyclinD1基因倒位于甲狀旁腺啟動子控制下CyclinD1蛋白合成↑
▲染色體易位(Chromosometranslocation)甲狀旁腺腺癌Bcl-1t(11:14)(q13:q32)易位
CyclinD1受Ig重鏈基因增強子影響
CyclinD1表達↑(p15:q13)第44頁,共136頁,2024年2月25日,星期天■CDK表達異常主要見于CDK4、CDK6過表達。CDK4↑+cyclinD結合↑CDK4/cyclinD↑CDKs表達↑
pRbpRb磷酸化↑細胞增殖過度
E2F↑G1/S過渡加速【CyclinD過表達致腫瘤機制】CyclinD過表達+生長因子
CDKs瀑布效應↑細胞增殖過度易發(fā)生細胞癌變細胞增殖異常▲基因突變CyclinD1T286突變CyclinD1泛素化受阻CyclinD1↑可能第45頁,共136頁,2024年2月25日,星期天細胞增殖異?!鯟DI表達不足和突變
腫瘤細胞中常出現CDI(腫瘤抑制基因)表達不足或突變。
▲InK4失活
【p16InK4基因失活原因】
突變或缺失、染色體易位、p16InK4高度甲基化。
【Mechanism】p16InK4基因表達↓CDK4與cyclinD結合↓細胞周期處在“易于”被啟動狀態(tài)
易發(fā)生細胞癌變
可能第46頁,共136頁,2024年2月25日,星期天細胞增殖異常正常
【Mechanism】
p53基因突變P21cip1轉錄↓DNA受損細胞增殖↑▲
Kip/Cip含量減少(DeficientexpressionofKip/Cip)
P21cipl功能cyclins/CDKs活性↓細胞周期速度↓增殖細胞核抗原(PCNA)阻滯DNA復制2.細胞周期監(jiān)控機制受損(Impairmentofcheckpointsystem)
主要原因:G1/S、G2/M檢查點異常失察結果:探測DNA損傷功能降低
(如發(fā)現不了DNA損傷,會導致基因缺失、易位、染色體重排等)
第47頁,共136頁,2024年2月25日,星期天表人類腫瘤p53基因突變熱點和頻率腫瘤型突變頻率(%)突變熱點腫瘤型突變頻率(%)突變熱點肺癌56157,248,273前列腺癌30不確定結腸癌50175,245,248,273肝細胞癌45249食道癌45不確定膠質癌25175、248卵巢癌44273乳腺癌22175、248、273胰腺癌44273子宮內膜癌22248皮膚癌44248、278甲狀腺癌13248、273胃癌41不確定白血病12175、248頭頸鱗癌37248宮頸癌7273膀胱癌34280軟組織肉瘤31不確定細胞增殖異常第48頁,共136頁,2024年2月25日,星期天
■G2/M交界處失察
G2/M交界處
DNA雙鏈斷裂激活DNA損傷檢查點阻止細胞進入M期誘導修復基因轉錄完成斷裂的DNA修復
▲失去G2/M檢查點的阻滯作用染色體發(fā)生重排、丟失細胞增殖異常第49頁,共136頁,2024年2月25日,星期天原發(fā)性血小板增多癥(PT)■臨床癥狀:以巨核細胞增殖為主的骨髓增生性疾病。伴有血小板持續(xù)增多和血小板功能異常,有反復自發(fā)性出血及血栓形成?!霾∫蚺c機制:X染色體遺傳、TGF-
減少、輔助細胞缺乏等。良性前列腺增生■病因與機制:細胞凋亡出現下降,增殖不變,導致良性前列腺增生。銀屑病■病因與機制:表皮生長因子受體的增加和
受體的減少是引起表皮細胞增長過快的原因。第50頁,共136頁,2024年2月25日,星期天
第三節(jié)
細胞分化調控機制
細胞分裂后逐漸產生與來源細胞在結構和功能上有著穩(wěn)定差異的過程即為分化(differentiation)。一、細胞分化的特點1.穩(wěn)定性:一旦確立,分化狀態(tài)便穩(wěn)定存在。2.全能性:共同來源于受精卵,并保留全部信息。3.選擇性:基因表達呈選擇性開閉,是不同分化細胞表型差異的原因。二、細胞分化的機制
分化是細胞內不同基因在不同發(fā)育階段選擇性激活的結果,細胞內不同基因在時空上有序表達的結果。1.“決定”先于分化細胞“決定”(determination):有些基因永久性地關閉,另一些基因順序表達,使細胞具備有某一特定方向分化的能力。多能干細胞(pluripotentcell):具有多向分化潛能。第51頁,共136頁,2024年2月25日,星期天2.細胞質在細胞決定中的作用細胞質決定子(cytoplasmicdeterminant)某些特殊細胞發(fā)育途徑的決定往往首先由細胞質控制。3.核質的相互作用細胞分化的基礎是細胞核內基因組選擇性地表達,而核內基因的活性又受核所在胞質環(huán)境的影響,是核質相互作用的結果。4.細胞間相互作用位置效應:細胞所在位置,與其他細胞間的關系。(1)細胞間直接接觸進行信息傳遞;(2)細胞外基質、粘附分子、細胞因子的作用。第52頁,共136頁,2024年2月25日,星期天三、干細胞與分化干細胞(stemcell):是一類增殖較慢,能自我維持增殖的細胞,具有定向分化的潛能。專能干細胞:干細胞分裂產生的子細胞只能分化為某一類型的細胞。多能干細胞:子細胞可以產生兩種或兩種以上類型的細胞。造血多能干細胞造血定向干細胞血細胞造血干細胞庫第53頁,共136頁,2024年2月25日,星期天四、調控細胞分化的信號通路(一)Ras-MAPK信號傳遞途徑
1.RPTK介導的信號轉導
許多細胞因子受體具有酪氨酸蛋白激酶(RPTK)活性,多為單跨膜糖蛋白,目前已發(fā)現50多種,分為14個家族,以非活性形式結合于細胞表面,當與其配體結合后以不完一致的方式被激活。胞外只有一個配體結合部位的RPTK,如EGFR、FGFR,配體結合后受體構象改變和二聚化,導致膜內激酶的活化;PDGF可同時與兩個受體分子結合,因而同時發(fā)生二聚化與活化;胰島素受體本身由兩個α亞基和兩個β亞基聚集而成,兩個α亞基與配體結合引發(fā)β亞基構象改變,無需寡聚化就可活化。第54頁,共136頁,2024年2月25日,星期天
RPTK胞漿區(qū)至少有1-3個酪氨酸殘基,寡聚化后胞漿區(qū)激酶域相互靠近,發(fā)生自身磷酸化。自身磷酸化一方面使激酶活性顯著增大,有能力催化其它靶蛋白的磷酸化;另一方面Tyr-為多種有SH2或PTB結構域的下游信號傳遞分子提供識別和結合部位。RPTK活化后以兩種方式向細胞內傳遞信息:一是蛋白質磷酸化;二是蛋白質-蛋白質之間相互作用。無論何種方式,都對其靶蛋白的結構有嚴格的要求。正如圖17所示,RPTK活化后可結合SH2分子。第55頁,共136頁,2024年2月25日,星期天圖17活化的RPTK通過SH2/SH3分子傳遞信息不同機制(a)RPTK通過自身磷酸化而激活,與PLCγ的SH2結合,將其Tyr殘基磷酸化使之活化(b)活化的RPTK與PI-3K調節(jié)亞基p85的SH2結合,使其催化亞基p110從鈍化狀態(tài)變成活化構象;(c)通過接頭分子Grb2-SOS活化Ras-MAPK通路第56頁,共136頁,2024年2月25日,星期天2.Ras-MAPK信號傳遞途徑
RPTK介導的細胞因子信號主要經Ras-MAPK途徑傳遞??扇苄越宇^蛋白Grb2中部的SH2結構域與活化的RPTK中Y-結合,兩端的SH3結構域與一種鳥苷酸交換因子Sos富含Pro殘基的區(qū)域相結合,把它募集到質膜內側,促使鄰近的Ras-GDP轉變成Ras·GTP而活化?;罨腞as即可激活MAPKKK,啟動MAPK級聯反應。MAPKKK中的一種Raf是Ser/Thr蛋白激酶,它與一種14-3-3蛋白結合而處于非活化狀態(tài)。第57頁,共136頁,2024年2月25日,星期天Ras·GTP可促使14-3-3解離并與Raf結合,從胞質轉移至質膜,并發(fā)生Ser259自身磷酸化。膜中磷脂酰絲氨酸與Raf結合進一步活化。同時膜結合的一種非受體型酪氨酸蛋白激酶Src催化Raf中Tyr340和Tyr341磷酸化,使Raf完全活化。活化的Raf催化MAPKK上Ser磷酸而將其激活?;罨腗APKK是一種Thr/Tyr蛋白激酶,可催化MAPK中TXY模體中Thr和Tyr磷酸化。MAPK被激活后可進入細胞核,作用于許多轉錄因子,調節(jié)基因表達并促進細胞增殖。第58頁,共136頁,2024年2月25日,星期天
Ras是一個小分子的單聚體G蛋白,位于質膜的內表面,它在多種細胞內信號傳導途徑中起著非常重要的作用。象其它G蛋白一樣,Ras循環(huán)也在GDP結合的非活性形式和GTP結合的活性形式之間進行。
Ras的活性形式,能激活信號傳導途徑中位于其下游的效應分子。也和其它G蛋白一樣,Ras也具有內在的GTPase活性,將結合的GTP水解成為GDP,其作用就象一個開頭,關閉了Ras蛋白的活性。第59頁,共136頁,2024年2月25日,星期天
導致腫瘤形成的Ras基因突變可使Ras蛋白失去GTase活性。其結果是:Ras突變產物在細胞中始終處于活性狀態(tài),沿著信號傳導途徑持續(xù)將信號傳遞至下游,使細胞一直處于增殖狀態(tài)。另外,也發(fā)現一種Ras基因的突變產物不能結合GTP,導致細胞不能分裂。
Ras被認為參與了細胞內多種不同的信號傳導途徑,是這些信號傳導途徑的聚焦點。在將信號從細胞膜外傳遞至細胞核的過程中,Ras蛋白起著非常重要的作用。整個過程開始于生長因子(如EGF或PDFG)等與各自受體的細胞外功能域結合。
第60頁,共136頁,2024年2月25日,星期天
生長因子與RTK結合后,RTK胞漿部分由自動磷酸化反應生成的磷酸酪氨酸就成為了一個被稱之為Grb2(Growthfactorreceptorbindingprotein)的SH2底物蛋白分子結合點,然后Grb2在另一個叫做Sos(Sonofsevenless)的蛋白幫助下結合到細胞膜內表面,從這里開始Ras蛋白就參與進來了。在一個未激活的細胞內,Ras與GDP保持結合狀態(tài);當配體與RPTK結合后,吸引Grb2-Sos到細胞膜內表面,Sos蛋白與Ras蛋白結合,使GDP從Ras蛋白上脫離,由GTP取代,造成Ras蛋白被激活。Ras-GTP是最基本也可能是唯一的功能就是吸引另外一個叫做Raf的蛋白與之一同結合到質膜上。第61頁,共136頁,2024年2月25日,星期天Raf蛋白一旦定位在質膜上,就變成了一個有活性的蛋白激酶,激發(fā)一個稱之為MAP(Mitogen-activatedprotein)激酶的級聯式反應。MAP激酶級聯式反應與葡萄糖總動員中由cAMP觸發(fā)的級聯式反應相似,但是它更復雜。級聯式反應中的最后一個蛋白激酶MAPK(MAPkinase)進入到細胞核,將特異的轉錄因子磷酸化。這些被激活的轉錄因子可與被稱之為血清反應元件(SRE)的特異DNA序列結合。之所以稱之為血清反應元件是因為它們可由來自血清中生長因子所傳導的信號所激活。這幾個基因所編碼的蛋白被認為在細胞周期的激活中起著重要作用,最終可起動DNA合成,導致細胞分裂。
第62頁,共136頁,2024年2月25日,星期天第63頁,共136頁,2024年2月25日,星期天
細胞核并不是MAPK級聯式反應的唯一靶向地,最近的研究表明另一個靶向物是胞漿蛋白PHAS-1。
PHAS-1的非磷酸化狀態(tài),可與關鍵性起動因子之一的eIF4E結合。在真核細胞中,eIF4E可使核糖體錨定到mRNA分子上,開始蛋白質合成。當PHAS-1與該起動因子結合后,該因子就不能在蛋白質合成中發(fā)揮它的作用。在激活狀態(tài)下,MAP激酶使PHAS-1磷酸化,其構象會發(fā)生改變,使其失去結合eIF4E的能力;換言之,也就是使得該起動因子在翻譯過程中能夠發(fā)揮它的作用。由此可以看出,在靶細胞中,MAP激酶級聯式反應在轉錄和翻譯的調控上都起著重要作用。第64頁,共136頁,2024年2月25日,星期天第65頁,共136頁,2024年2月25日,星期天IFNaJAK1TYK2Kinase-receptorComplexSTAT1pSTAT1pp48IFNgJAK1JAK2STAT1pSTAT1ppGATA2STAT1ppGATA2ISRESTAT1pSTAT1pGAS,IREp48STAT1ppGATA2p48STAT1ppGATA2(二)JAK-STAT信號傳遞途徑
大多數造血細胞因子受體缺乏酪氨酸蛋白激酶活性,胞外區(qū)與配體結合后受體寡聚化,胞內區(qū)募集并激活胞漿中酪氨酸蛋白激酶,然后激活轉錄因子,調節(jié)基因的表達。第66頁,共136頁,2024年2月25日,星期天
造血細胞因子受體家族雖來自同一始祖基因,長期進化使各成員同源性并不高。除紅細胞生成素受體(EPOR)和生長激素受體(GHR)等少數例外,該家族多數成員都由幾個亞基組成,至少有一條配體結合鏈和一條信號轉導鏈,只有形成二聚體后才有功能。前者各不相同,專一地與配體結合,但親和力很低,且無信號轉導功能,又稱“私有鏈”;后者參與多種受體的信號轉導,但無配體結合能力,稱為“公有鏈”。第67頁,共136頁,2024年2月25日,星期天
按其結構特點將它們分為兩類:第一類至少有20多種,其配體分別為IL-2、IL-7、IL-11、IL-12、IL-15、EPO、GH、G-SCF、GM-SCF、LIF等。第二類成員較少,其配體分別為INF-α/β、INF-γ和IL-10。此類受體至少有兩個亞基參與信號轉導。
被活化的造血細胞因子受體召募的胞漿PTK稱為JAK,已發(fā)現JAK1、JAK2、JAK3和TyK2共4個成員,分子量120-140kDa。從C-端到N-端JAK分子中有7個高度保守的同源區(qū)。其中C-端的同源區(qū)1和2均為酪氨酸蛋白激酶活性區(qū),遂以神話中的兩面天神Janus命名為Januskinase,縮寫為JAK。第68頁,共136頁,2024年2月25日,星期天
被JAK磷酸化而激活的轉錄因子STAT(signaltransducersandactivatorsoftranscription)至少有7種,即STAT1-6,其STAT5有a和b兩種。
STAT分子量為84-113kDa,由734-851個氨基酸組成。STAT通過分子中SH2結構域與Tyr被磷酸化的受體結合,并被結合在相應受體上的JAK磷酸化。
不同受體與不同JAK偶聯可選擇性激活不同STAT。活化的STAT需形成同源二聚體或STAT1-STAT2、STAT1-STAT3和STAT5a-STAT5b等異源二聚體,才能進入細胞核。
STAT中部DNA結合區(qū)高度保守,可與DNA上被稱為IFN-γ活化位點(γinterferonactivationsite,GAS)的回文順序相結合。目前已發(fā)現十余種GAS序列,不同STAT二聚體識別不同GAS序列,表現出相對特異的功能。
第69頁,共136頁,2024年2月25日,星期天
干擾素γ受體(IFNGR)由兩種亞基組成,亞基1含472個氨基酸殘基,N-端1-228為胞外區(qū),C-端252-472為胞內區(qū),中間為跨膜區(qū);亞基2含315個氨基酸殘基,N-端1-226為胞外區(qū),C-端251-315為胞區(qū),中間為跨膜區(qū)。
IFNGR1胞內區(qū)近膜區(qū)有JAK1結合部位;IFNGR2胞內區(qū)近膜處有JAK2結合部位。當IFNγ二聚體與兩個IFNGR1結合時,產生兩個IFNGR2結合部位,形成受體活化形式四聚體。第70頁,共136頁,2024年2月25日,星期天
受體鏈寡聚化和構象變化促使締合在膜內區(qū)的JAK2和JAK1通過自身磷酸化相繼活化,隨即催化IFNGR1鏈Tyr440磷酸化,形成STAT1的識別和??课稽c。然后,兩個STAT1以其SH2結合于IFNGR1C-端區(qū),被JAK將其C-端附近的Tyr701磷酸化。活化的STAT1形成二聚體進入細胞核,被一種MAPK將其Ser727磷酸化,即可結合于專一的GAS元件并刺激基因轉錄(圖18)。第71頁,共136頁,2024年2月25日,星期天圖18干擾素γ信號轉導模式圖第72頁,共136頁,2024年2月25日,星期天敲除的基因表現型敲除的基因表現型JAK1圍產期死亡STAT4Th1分化障礙JAK2胚胎期死亡,造血缺陷STAT5a雌性乳腺發(fā)育受損JAK3重癥聯合免疫缺陷STAT5b雄性第二性征發(fā)育受損STAT1IFN信號轉導缺陷STAT6Th2分化障礙STAT2無法獲得胚胎STAT4和STAT6T細胞傾向Th1樣發(fā)育STAT3胚胎期死亡STAT5a和STAT5b雌性不育,體形變小,脾大,夭折表5
JAK/STAT基因敲除小鼠的表現型
通過JAK-STAT調控轉錄的基因很多,JAK-STAT的功能極其廣泛,表5列舉了幾種JAK-STAT基因敲除小鼠的表現型,或可為了解其生理意義提供有用的信息。第73頁,共136頁,2024年2月25日,星期天(三)干擾素-α信號轉導
干擾素(IFN)是細胞對相關刺激反應時所產生的細胞信號蛋白質,是細胞因子超家族中一個糖蛋白類同源細胞因子家族,稱為IFN家族。已鑒定出該家族中3個主要成員:IFN-α、IFN-β和IFN-γ。對IFN-α生物學效應和信號轉導機理的研究較為深入。IFN-α由白細胞和原始淋巴細胞分泌,現已經基因重組技術生產,并被廣泛應用于治療白血病、淋巴瘤、實體瘤及病毒、原蟲、寄生蟲和真菌感染,其治療策略包括使用IFN-α單一治療、輔助治療和維持治療。近期研究表明,IFN-α與其受體結合后,可激活多種信號轉導途徑,從而發(fā)揮其抗病毒、抗腫瘤(抗增殖)及免疫調節(jié)等多種生物學功能。第74頁,共136頁,2024年2月25日,星期天
1.JAK-STAT途徑
非受體性蛋白質酪氨酸激酶超家族中的Janus激酶(JAK)家族及信號轉導子和轉錄活化子(STAT)家族是細胞對IFN-α等細胞因子反應的一些基本蛋白質分子,構成IFN-α及白細胞介素(IL)等細胞因子信號轉導的經典途徑,稱為JAK-STAT途徑。
IFN受體通過JAK-STAT途徑轉導IFN的信號主要導致細胞生長抑制和抗病毒效應。IFN-α與其效應細胞的膜受體結合后,活化一類特殊的受體相關性酪氨酸蛋白激酶,即JAKs蛋白質?;罨腏AKs蛋白質即自身磷酸化并使受體復合物中其它成份磷酸化,并募集游離于胞漿的STATs并使其羧基端酪氨酸殘基磷酸化。磷酸化STATs蛋白質與受體-JAKs復合物分離并經同源或異型二聚化后位移至胞核內,與其效應基因序列中的應答性調控元件結合而參與靶基因的轉錄活化。第75頁,共136頁,2024年2月25日,星期天
研究JAKs突變的細胞株(γ2A細胞和U4C細胞)表明,在JAKs家族中,參與IFN-α信號轉導的主要成員是JAK1和JAK2。JAK1和JAK2的氨基末端區(qū)是結合受體和活化STATs的活性功能區(qū)域。不同的JAKs家族成員參與不同類型細胞因子信號轉導的主要原因在于,不同的JAKs家族成員與各類受體及JAKs下游信號轉導蛋白之間的分子結構及其相互作用的差異。
Abril等研究了一種對IFN刺激無反應的胃癌細胞株AGS,發(fā)現AGS細胞內STAT1表達水平特別低,其細胞核提取物缺乏與IFN刺激性反應元件(ISREs)的結合活性,作者認為STAT1缺乏即是AGS細胞對IFN刺激無反應的原因,且表明該類缺乏STAT1的細胞對病毒感染高度敏感;同時STAT1缺乏將使腫瘤細胞具有選擇性優(yōu)勢,即使之逃避IFN的細胞生長抑制效應和T-細胞的抗腫瘤效應。第76頁,共136頁,2024年2月25日,星期天
動物實驗表明,STAT1基因遭受破壞的小鼠喪失對IFN的反應性而極易受病毒和病原菌感染。Hung等研究發(fā)現,分化誘導劑丁酸鈉能增強IFN-α誘導的STAT1蛋白質磷酸化及其活化,以及磷酸化抑瘤基因表達產物Rb蛋白質的積累,并增強IFN-α誘導惡變細胞凋亡的效應。
Jaster等報道參與IFN-α信號轉導的轉錄因子主要是STAT1和STAT2,其中STAT1的作用更明確,而STAT5似乎并未參與介導IFN-α信號轉導過程。第77頁,共136頁,2024年2月25日,星期天
2.IRF途徑干擾素調節(jié)因子(IRF)是眾多經IFN誘導表達的蛋白質中一個轉錄調節(jié)因子家族,其中對IRF-1和IRF-2蛋白質的分子特性具有較多了解,近年研究發(fā)現該家族成員已超過10個。研究表明,IFN-α可誘導IRF表達上調,該效應不依賴于STAT活化途徑,而是經活化性核因子Kappab介導,被激活的IRF(主要為IRF-1或IRF-2)與其靶基因2′-5′寡聚腺苷酸合成酶(OAS)基因啟動子中IFN反應性元件結合而啟動2-5OAS基因表達。第78頁,共136頁,2024年2月25日,星期天
此外,活化性的IRF也可誘導p68激酶及RNA酶L(RNaseL)的表達,Northern印跡分析表明,經IFN-α治療或體外培養(yǎng)的慢性期或急變期慢粒白血?。–ML)患者的粒細胞、淋巴細胞及CD34+細胞中IRF-1、IRF-2、2-5oAS、p68激酶及RNA酶L的表達均增強。這些蛋白質均為IFN-α反應性基因產物,它們協同作用,介導IFN-α信號轉導而主要呈現出IFN-α的抗細胞增殖效應。第79頁,共136頁,2024年2月25日,星期天3.其它信號轉導分子
細胞被病毒感染能有效產生IFNs,先期研究發(fā)現,受IFN刺激的IFN受體(IFNR)與ISREs結合而激活IFN誘導性基因表達,且證實轉錄因子復合物—干擾素刺激性基因因子3(ISGF3)是IFN信號轉導的一類關鍵性介導復合因子。ISGF3由STAT1、STAT2和p48組成。近期研究表明,p48蛋白質基因被靶向性損毀的小鼠細胞中其病毒誘導性IFN-α/β基因表達量嚴重不足,缺乏IFN-α受體(IFN-αR)或STAT1的細胞中其病毒誘導性IFN-α/β基因的表達水平也明顯降低,因而證實這類新發(fā)現的信號轉導分子具有轉導IFN信號及調節(jié)IFN基因表達的雙重功能。進一步研究發(fā)現,ISGF3能與IFN-α/β基因啟動子序列中的病毒誘導性元件結合而啟始IFN基因表達。第80頁,共136頁,2024年2月25日,星期天
腺病毒E1A蛋白可抑制p48及STAT1α蛋白質的產生,并通過降低一種酪氨酸蛋白激酶—Lak-1蛋白質水平而抑制STAT1α蛋白質的磷酸化過程,從而阻礙IFN-α和IFN-γ的信號轉導。介導子p300和/或cAMP反應性元件結合蛋白(CBP)可與STAT2的羧基末端序列結合而活化STAT2,ELA通過抑制p300/CBP的活性而抑制STAT2轉導,進而阻礙IFN-α信號轉導。
Petricoin等研究表明,IFN-α通過T細胞受體(TCR)的信號轉導過程不依賴于JAK-STAT途徑,而是由酪氨酸激酶Lck、ZAP-70和酪氨酸磷酸酶CD45以及它們與IFN-α受體形成的信號轉導復合物參與而共同介導。Estes等研究表明,B細胞受體(BFR)及膜蛋白CD40均參與了IFN-α誘導的由免疫球蛋白IgM、IgG2及IgA介導的免疫學反應,且證實BCR與IFN-α交聯比BCR與IFN-α及CD40雙交聯能更有效地誘導IgG2介導的免疫學反應。第81頁,共136頁,2024年2月25日,星期天Miscia等采用IFNα處理Burkitt淋巴瘤細胞數小時發(fā)現,磷脂酰肌醇3(PI3)激酶過度表達,并伴有胞漿及核內P13激酶的磷酸化,提示P13介導了IFN-α在Burkitt淋巴瘤細胞內信號轉導過程中胞漿—胞核的交互對話過程。Miyachi等研究發(fā)現,IFNα可誘導人類CML細胞株K562細胞的S期積累,丁酸鈉明顯增強該效應,但丁酸鈉與IFN-γ聯合應用則并不導致K562細胞S期積累,Western印跡分析表明,丁酸鈉的效應依賴于IFN-α的信號轉導因子中的一種34kDa的蛋白質激酶cdc2的酪氨酸磷酸化。
Uddin等在研究造血細胞中IFN-α信號轉導時發(fā)現,src家族酪氨酸激酶Lyn通過其src同源區(qū)2(SH2)與Janus家族酪氨酸激酶Tyk-2偶聯,即IFN-α活化Tyk-2后,其信號經Tyk-2的下游信號轉導分子—Lyn轉導并呈現IFN-α的生物學效應,作者認為這很可能是IFN-α的另一種信號轉導途徑。第82頁,共136頁,2024年2月25日,星期天
Caraglia等研究發(fā)現,IFN-α增強人類表皮癌KB細胞內表皮生長因子受體(EGFR)的表達及其信號轉導,且增強熱休克蛋白(HSP)HSP-70,HSP-90及HSP-27的表達和激活氨基末端c-Jun激酶-1(JNK-1)以及激活由有絲分裂原p38活化的蛋白激酶,故認為EGF-R、HSP-70、HSP-90、HSP-27及JNK-1等均可能是IFN-α的信號轉導分子。在不同類型細胞中雖可能存在結構相同的IFN-α受體及其信號轉導的通用途徑,但基于IFN-α對不同類型細胞產生的生物學效應差異甚大,例如抗病毒、抗細胞增殖、抗原蟲、抗寄生蟲及抗真菌感染等,故可以認為IFN-α在不同類型細胞中的信號轉導將主要經與其生物學效應相匹配的途徑和依賴于多種信號轉導途徑的交互作用。第83頁,共136頁,2024年2月25日,星期天
如上所述,近年發(fā)現的參與IFN-α信號轉導的各類信號轉導因子及信號轉導途徑似乎尚有其獨立性,但隨著進一步的深入探討,則必將發(fā)掘出其間的相互作用及其復雜的網絡聯系,例如IFN-α可經Fas介導的信號轉導途徑而下調CML細胞特征性蛋白p210bcl-abl的表達并恢復CML細胞對程序性死亡的敏感性。
細胞因子(包括IFN-α)信號轉導途徑是一極其復雜的網絡系統,其研究雖已取得一些進展,但尚無實質性突破,將是后基因組時代的基礎性研究工作和具有挑戰(zhàn)性的研究課題。
第84頁,共136頁,2024年2月25日,星期天
(四)MAPKs信號轉導通路絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是細胞內一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。MAPKs信號轉導通路存在于大多數細胞內,在將細胞外刺激信號轉導至細胞及其核內,并引起細胞生物學反應,如細胞增殖、分化、轉化及凋亡等。研究表明,MAPKs信號轉導通路在細胞內具有生物進化的高度保守性,在低等原核細胞和高等哺乳類細胞內,目前均已發(fā)現存在著多條并行的MAPKs信號通路,不同細胞外刺激可使用不同MAPKs信號通路,通過其相互調控而介導不同細胞生物學反應。第85頁,共136頁,2024年2月25日,星期天1.胞外信號調節(jié)激酶(ERK)信號通路
1986年由Sturgill等人首先報道。最初其名稱十分混亂,曾根據底物蛋白稱之為MAP2K、ERK、MBPK、RSKK、ERTK等。此后,由于發(fā)現其具有共同結構和生化特征,而被命名為MAPK。近年來,隨著不同MAPK家族成員發(fā)現,又重新改稱為ERK。
在哺乳類動物細胞中,與ERK相關的細胞內信號轉導途徑被認為是經典MAPK信號轉導途徑,目前對其激活過程及生物學意義已有深入認識。第86頁,共136頁,2024年2月25日,星期天
研究證實,受體酪氨酸激酶、G蛋白偶聯受體和部分細胞因子受體均可激活ERK信號途徑。如:生長因子與細胞膜特異受體結合,可使受體形成二聚體,二聚化受體使其自身酪氨酸激酶被激活;受體上磷酸化的酪氨酸又與位于膜上的生長因子受體結合蛋白2(Grb2)SH2結構域相結合,而Grb2的SH3結構域則同時與SOS結合,后者使小分子鳥苷酸結合蛋白Ras的GDP解離而結合GTP,從而激活Ras;激活的Ras進一步與絲/蘇氨酸蛋白激酶Raf1的氨基端結合,通過未知機制激活Raf1;Raf1可磷酸化MEK1/MEK2上2個調節(jié)性絲氨酸,從而激活MEKs;MEKs為雙特異性激酶,可使絲/蘇氨酸和酪氨酸發(fā)生磷酸化,最終高度選擇性地激活ERK1和ERK2。第87頁,共136頁,2024年2月25日,星期天
ERKs為脯氨酸導向的絲/蘇氨酸激酶,可磷酸化脯氨酸相鄰的絲/蘇氨酸。絲裂原刺激后,ERKs接受上游信號,可轉位進入細胞核。因此,ERKs不僅可磷酸化胞漿蛋白,而且可磷酸化一些核內轉錄因子如c-fos、c-Jun、Elk-1、c-myc和ATF2等,從而參與細胞增殖與分化的調控。另外,ERK還可磷酸化ERKs通路的上游蛋白如NGF受體、SOS、Raf1、MEK等,進而對該通路進行自身的負反饋調節(jié)。還有研究發(fā)現,ERKs可磷酸化胞漿內的細胞骨架成份,如微管相關蛋白MAP1、MAP2和MAP4,參與細胞形態(tài)調節(jié)及細胞骨架重分布。
最近,國外學者又新克隆出ERK5及其上游激酶MEK5,這條MAPKs信號通路可被H2O2及高滲激活,其底物為c-Myc。此外發(fā)現還有ERK3及ERK4兩條通路存在,但目前對其激活信號、底物及生物學意義還不清楚。第88頁,共136頁,2024年2月25日,星期天
而MKK4則可同時激活JNK1和p38。JNKK上游激活物為MEKK,MEKK1在體外過表達時可激活MEK,但MEKK1在體內高度選擇性地磷酸化MKK4,從而激活JNK。MEKK2也可通過MKK4激活JNK和p38。
JNK/SAPK接受上游信號被激活后,可進一步使核內的轉錄因子c-Jun氨基末端63及73位的絲氨酸殘基磷酸化,進而激活c-Jun而增強其轉錄活性。c-Jun氨基末端的磷酸化還可促進c-Jun/c-Fos異二聚體及c-Jun同源二聚體形成,這些轉錄因子可結合到許多基因啟動子區(qū)AP-1位點,增加特定基因的轉錄活性。
此外,JNK/SAPK激活后還可使轉錄因子Elk1和ATF2發(fā)生磷酸化,并使其轉錄活性增強。第89頁,共136頁,2024年2月25日,星期天2.JNK/SAPK通路
c-Jun氨基端激酶(JNK)又稱應激活化蛋白激酶(SAPK),是哺乳細胞中MAPK另一亞類。目前,從成熟人腦細胞中已克隆了10個JNK異構體,它們分別由JNK1、JNK2和JNK3基因編碼,JNK1和JNK2在各種組織細胞中廣泛表達,而JNK3選擇性在腦細胞中表達。
JNK/SAPK信號通路可被應激刺激(如紫外線、熱休克、高滲刺激及蛋白合成抑制劑等)、細胞因子(TNFα,IL-1)、生長因子(EGF)及某些G蛋白偶聯受體激活。外界刺激可通過Ras依賴或非Ras依賴兩條途徑激活JNK,小分子G蛋白Ras超家族的成員之一Rho可能也是JNK激活的上游信號,Rho蛋白Rac及cdc42的作用可能是與p21激活的絲/蘇氨酸激酶PAK結合,使其自身磷酸化而被激活,而活化的PAK進一步使JNK激活。已有研究證實,雙特異性激酶JNK
Kinase(JNKK)是JNK/SAPK上游激活物,包括MKK4(JNKK1)、MKK7(JNKK2),其中MKK7/JNKK2可特異性地激活JNK。第90頁,共136頁,2024年2月25日,星期天3.p38MAPK通路
p38MAPK是1993年由Brewster等人在研究高滲環(huán)境對真菌的影響時發(fā)現。以后又發(fā)現它也存在于哺乳動物細胞內,也是MAPKs亞類之一,其性質與JNK相似,同屬應激激活的蛋白激酶。
目前已發(fā)現p38MAPK有5個異構體,分別為p38α、p38β1、p38β2、p38γ、p38δ。其分布具有組織特異性:p38α、p38β1、p38β2在各種組織細胞中廣泛存在,p38γ僅在骨骼肌細胞中存在,而p38δ主要存在于腺體組織。研究證實,p38MAPK通路激活劑與JNK通路相似。一些能夠激活JNK的促炎因子(TNFα、IL-1)、應激刺激(UV、H2O2、熱休克、高滲與蛋白合成抑制劑)也可激活p38,此外,p38還可被脂多糖及G+細菌細胞壁成分所激活。p38信號通路也由三級激酶鏈組成,其上游激活物為MKK3、MKK4及MKK6,與MKK4不同,MKK3、MKK6僅特異性激活p38。第91頁,共136頁,2024年2月25日,星期天
體外細胞轉染實驗表明,MEKK2。MEKK3可通過激活MKK4同時激活JNK和p38,而MEKK3通過激活MKK3特異性激活p38。不同的p38異構體對同一刺激可有不同的反應,IL-1對p38的激活明顯強于p38β,TNF1-α使p38活性達到高峰的時間明顯短于使p38β達到高峰的時間。不同的異構體對底物的作用也具有選擇性,p38β2對ATF2的磷酸化作用明顯強于p38,p38γ可以磷酸化ATF2,但卻不能激活MAPKAP-K2和MAPKAP-K3;不同的異構體與不同的上游激酶偶聯,MKK6可以激活p38α、p38β2、p38γ,而MKK3僅能激活p38α、p38γ。第92頁,共136頁,2024年2月25日,星期天
第四節(jié)細胞分化障礙與疾病
分化障礙是腫瘤細胞的基本特征。一、腫瘤細胞的誘導分化誘導分化:在誘導分化劑的作用下,腫瘤細胞的形態(tài)、生物學特性、生化標志等與正常細胞接近或相同,即由惡性表型轉為正常表型,又稱逆轉。分化誘導劑:能使腫瘤細胞分化,出現類似正常細胞表型及功能的物質。1.外源性分化誘導劑:機體自身不能合成,為非生理性。(1)極性化合物,如DMSO;(2)佛波酯類,如TPA;(3)抗生素類,如放線菌素D、阿霉素(高濃度時為毒性作用);(4)抗癌藥物類,如5-Fu等。第93頁,共136頁,2024年2月25日,星期天2.內源性分化誘導劑:機體自身可以產生,為生理性。(1)維生素類,如VitaminA、VitaminD;(2)激素類,如甾體激素、T3等(3)細胞因子,IFN、TGF
、EPO、GM-CSF、TPO等;(4)cAMP,激活PKA。臨床上,目前最為有效的誘導分化療法是RA治療粒系白血病。第94頁,共136頁,2024年2月25日,星期天二、癌基因與細胞癌變(一)癌基因的概念、分類和命名
1.概念及發(fā)現過程
Oncogene:指能引起腫瘤的基因,即這類基因表達時能使正常細胞轉化為惡性細胞。
1911年Rous發(fā)現了第一種逆轉錄病毒RSV,并證明雞肉瘤濾液
具致瘤性,推測RSV為致瘤因子。
1970年Martin發(fā)現一株溫度敏感RSV,即tsRSV。用tsRSV感染
雞胚成纖維細胞,35℃時可使之轉化,但41℃可又使之
恢復正常。
Vogt分離到一轉化缺陷突變株tsRSV,并證明所卻失的
序列位于3端的一段RNA片段,命名為v-src(病毒肉瘤
基因)。這是第一個發(fā)現的病毒癌基因。第95頁,共136頁,2024年2月25日,星期天1972年Bishop實驗室(法國學者Stehelin)首先制備出32p-src探針,并以此探針證明雞及其他禽類細胞以及人類細胞中均含有與v-src同源的序列,且具有真核基因的特點(含內含子及外顯子)。命名為細胞src(c-src),以后陸續(xù)發(fā)現了其他許多種細胞癌基因。目前,多數學者認為v-onc起源于c-onc。原癌基因(proto-oncogene)
正常細胞中存在著c-onc樣序列,與c-onc的同源性很大
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