細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)

關(guān)于細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)目錄基本原理1質(zhì)粒提取擴增234常見問題及解決方案5影響轉(zhuǎn)染實驗的因素轉(zhuǎn)染方法第2頁,共36頁，2024年2月25日，星期天基本原理1將外源分子如DNA，RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染——研究內(nèi)容：研究和控制真核細(xì)胞基因功能應(yīng)

用：基因功能、調(diào)控基因表達、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)試驗第3頁,共36頁，2024年2月25日，星期天常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)瞬時轉(zhuǎn)染外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過一些選擇性標(biāo)記，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細(xì)胞中可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動子和其它調(diào)控元件的分析。一般來說，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72小時內(nèi)（依賴于各種不同的構(gòu)建）分析結(jié)果，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測。第4頁,共36頁，2024年2月25日，星期天第5頁,共36頁，2024年2月25日，星期天脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理基于電荷吸引原理，先形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物，散布在細(xì)胞周圍，然后通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用，將目的基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)。第6頁,共36頁，2024年2月25日，星期天1.

promega公司

Promega轉(zhuǎn)染試劑產(chǎn)品適合于人HeLa，HepG2，293，K562，Jurkat；猴COS-7，CV-1；小鼠NIH3T3；倉鼠BHK，CHO；大鼠PC12；昆蟲S19等等細(xì)胞系的RNAi轉(zhuǎn)染。

2.

Invitrogen公司

Lipofetamine2000，適合于Hela，BHK，HEK，COS-7，PC12，NIH3T3等各種常用細(xì)胞系的RNAi轉(zhuǎn)染。

3.

轉(zhuǎn)染FAQs：轉(zhuǎn)染試劑的選擇脂質(zhì)體復(fù)合物與貼壁細(xì)胞的接觸機會比懸浮細(xì)胞高出很多倍，所以，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率要明顯低于貼壁細(xì)胞。懸浮細(xì)胞是用的電穿孔法。第7頁,共36頁，2024年2月25日，星期天質(zhì)粒提取擴增2質(zhì)粒是細(xì)胞內(nèi)的一種環(huán)狀的小分子DNA，是進行DNA重組的常用載體。將細(xì)菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，然后從大腸桿菌中收獲大量質(zhì)粒的過程?！獙①|(zhì)粒

DNA

導(dǎo)入細(xì)菌的過程1、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞在

CaCl

2

低滲溶液中膨脹為球狀（感受態(tài)細(xì)菌的制備，略）。質(zhì)粒

DNA

與

CaCl

2

形成抗

DNase

羥基

-

磷酸鈣復(fù)合物黏附于細(xì)菌表面，經(jīng)

42℃

短時間熱沖擊處理，促進細(xì)胞吸收

DNA

復(fù)合物。在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖。被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中，外源基因得到表達。BL21(DE3)一般用于外源基因的原核表達，DH5a，TG1和HB2151一般用于重組質(zhì)粒的克隆和擴增TG1長得慢，菌落較小，轉(zhuǎn)化效率高，用于普通的克隆測序，BL21(DE3)長的快，菌落較大，轉(zhuǎn)化效率低點，主要用于原核表達。第8頁,共36頁，2024年2月25日，星期天感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞特點用途TG1長得慢，菌落較小，轉(zhuǎn)化效率高，用于普通的克隆測序DH5aE.coliDH5a在使用pUC系列質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化時，可與載體編碼的β－半乳糖苷酶氨基端實現(xiàn)α－互補。可用于藍白斑篩選鑒別重組菌株。常用于分子克隆、質(zhì)粒提取和蛋白質(zhì)表達。BL21(DE3)該菌株用于高效表達克隆于含有噬菌體T7啟動子的表達載體（如pET系列）的基因。T7噬菌體RNA聚合酶位于λ噬菌體DE3區(qū)，該區(qū)整合于BL21的染色體上。該菌適合表達非毒性蛋白。長的快，菌落較大，轉(zhuǎn)化效率低點。一般用于外源基因的原核表達JM109該菌株在使用pUC系列質(zhì)粒載體進行DNA轉(zhuǎn)化或用M13phage載體進行轉(zhuǎn)染時，由于載體DNA產(chǎn)生的LacZa多肽和JM09編碼的LacZΔM15進行α－互補，從而顯示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鑒別重組體菌株分子克隆、質(zhì)粒提取和蛋白質(zhì)表達。第9頁,共36頁，2024年2月25日，星期天細(xì)菌鋪板：加入抗生素（終濃度是50ug/ml-100ug/ml）挑選菌落：從LB培養(yǎng)基上挑選菌落備用細(xì)菌培養(yǎng)：37攝氏度培養(yǎng)箱中以180rpm搖動12~14h，使大腸桿菌繁殖堿裂解抽提：采用細(xì)胞裂解的方式，從含目標(biāo)質(zhì)粒的大腸桿菌菌液中將質(zhì)粒提取出來2、質(zhì)粒的提取擴增質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化具體方法省略……NOTE:不同的感受態(tài)細(xì)菌轉(zhuǎn)化效率不同，選擇合適的E.coli1ng的cccDNA就可使50ul的感受態(tài)細(xì)胞飽和，DNA量過多會降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化時為提高轉(zhuǎn)化效率，質(zhì)粒加入E.coli培養(yǎng)1h后可離心棄上清后用剩余的菌液涂布。第10頁,共36頁，2024年2月25日，星期天在質(zhì)粒提取過程中，由于機械力、酸堿度、試劑等的原因，可能使質(zhì)粒DNA鏈發(fā)生斷裂。所以，多數(shù)質(zhì)粒粗提取物中含有三種構(gòu)型的質(zhì)粒：15,000bp10,000bp7,500bp5,000bpErbB2ErbB2ErbB2共價閉合環(huán)狀DNA（超螺旋）：質(zhì)粒的兩條鏈沒有斷裂；開環(huán)DNA：質(zhì)粒的一條鏈斷裂；松弛的環(huán)狀分子；線形DNA：質(zhì)粒的兩條鏈均斷裂；線性分子第11頁,共36頁，2024年2月25日，星期天Q1：原先測序鑒定沒有問題的細(xì)菌，37℃搖菌后發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒大小或序列出現(xiàn)異常?這種情況出現(xiàn)的幾率較小，常出現(xiàn)在較大質(zhì)?；虮容^特殊的序列中。解決辦法：降低培養(yǎng)溫度，在20～25℃下培養(yǎng)，或室溫培養(yǎng)可明顯減少發(fā)生概率。使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重組酶，如rec類等，使得質(zhì)粒復(fù)制更加穩(wěn)定。質(zhì)粒抽提有一個酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH濃度過高造成的常見問題及解決方案第12頁,共36頁，2024年2月25日，星期天Q2：未提出質(zhì)粒或質(zhì)粒得率較低，如何解決?

大腸桿菌老化，細(xì)菌發(fā)生溶菌，可減少培養(yǎng)時間或者試試平板培養(yǎng)，質(zhì)?？截悢?shù)低，質(zhì)粒抽提過程很大程度上是受細(xì)菌生長情況決定的，剛活化的菌比負(fù)80℃保存菌種所培養(yǎng)出來的菌液狀態(tài)好，保存久的菌株可能會造成質(zhì)粒濃度低，質(zhì)粒丟失等不明原因。菌體中無質(zhì)粒，質(zhì)粒丟失。每次接種時應(yīng)接種單菌落。另外，檢查抗生素使用濃度是否正確。判斷生長的菌液是否正常，可以用肉眼觀察，在光線明亮處搖蕩新鮮培養(yǎng)液，如果菌液呈漂絮狀，情況很好。如果呈泥水狀，即看不到絮狀，則可能提不出好的質(zhì)粒，或者沒有質(zhì)粒。堿裂解不充分，菌液不宜生長太濃，搖床速度不宜過高。吸附柱過載：第13頁,共36頁，2024年2月25日，星期天質(zhì)粒未全部溶解(尤其質(zhì)粒較大時)：洗脫溶解質(zhì)粒時，可適當(dāng)加溫或延長溶解時間。乙醇?xì)埩簦浩匆合礈旌髴?yīng)離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。洗脫液加入位置不正確：洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會完全覆蓋硅膠膜的表面達到最大洗脫效率。洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液或水。洗脫效率還取決于pH值，最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當(dāng)用水洗脫時確保其pH值在此范圍內(nèi)，如果pH過低可能導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用，有利于提高洗脫效率。洗脫體積太小：隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。洗脫時間過短：洗脫時間對回收率也會有一定影響。洗脫時放置1min可達到較好的效果。第14頁,共36頁，2024年2月25日，星期天3轉(zhuǎn)染方法

瞬時轉(zhuǎn)染1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染23逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染第15頁,共36頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞培養(yǎng)用品表面積（mm2/孔）細(xì)胞密度培養(yǎng)基（μl/孔）96孔板501.5×104-5.0×104100μl48孔板1003.0×104-1.0×105200μl24孔板2008.0×104-2.0×105500μl12孔板4011.6×105-4.0×1051.0ml6孔板9623.0×105-8.0×1052.0ml35mm9623.0×105-8.0×1052.0ml60mm28271.0×106-2.5×1066.0ml轉(zhuǎn)染前細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)用品siRNA/DNA培養(yǎng)基終體積Lipo2000（siRNA/DNA）96孔板5pmol/0.2μg100μl0.25μl/0.5μl24孔板20pmol/0.8μg500μl1μl/2μl12孔板40pmol/1.6μg1.0ml2μl/4μl6孔板100pmol/4.0μg2.0ml5μl/10μl35mm100pmol/4.0μg2.0ml5μl/10μl60mm600pmol/8.0μg5.0ml10μl/20μl推薦的DNA:Lipo2000=1:0.5-1:5（ug：ul）siRNA:Lipo2000=1:0.01-1:0.1（pmol：ul）第16頁,共36頁，2024年2月25日，星期天

瞬時轉(zhuǎn)染1轉(zhuǎn)染前一天鋪板：5.0-8.0×104細(xì)胞接種在24孔板上，0.5ml正常培養(yǎng)基。24h后的細(xì)胞融合達到70%-90%的密度。轉(zhuǎn)染：（1）50ul無血清培養(yǎng)基（Opti-MEM）+20pmolsiRNA（或0.8ugDNA），柔和混勻，室溫孵育5min（2）50ul無血清培養(yǎng)基+1ullipo2000（DNA+2ullipo2000）柔和混勻，室溫孵育5min。（3）將DNA加入Lipo2000中，輕柔混勻，室溫孵育20min4.將24孔板中的正常培養(yǎng)基換為無血清的培養(yǎng)基（Opti-MEM）1.9ml。5.將100ulsiRNA/Lipo2000（DNA/Lipo2000）復(fù)合物混勻逐滴加入孔中，輕輕搖勻。6.4-6h后，換培養(yǎng)基（全培），48-72小時監(jiān)測轉(zhuǎn)染水平。7.轉(zhuǎn)染效率：綠色熒光蛋白看熒光mRNA水平，48h后收樣品，做PCR蛋白水平，72h后收蛋白，做WB。第17頁,共36頁，2024年2月25日，星期天穩(wěn)定轉(zhuǎn)染2轉(zhuǎn)染前一天鋪板：5.0-8.0×104細(xì)胞接種在24孔板上，0.5ml正常培養(yǎng)基。24h后的細(xì)胞融合達到70%-90%的密度。轉(zhuǎn)染：（1）50ul無血清培養(yǎng)基（Opti-MEM）+20pmolsiRNA（或0.8ugDNA），柔和混勻，室溫孵育5min（2）50ul無血清培養(yǎng)基+1ullipo2000（DNA+2ullipo2000）柔和混勻，室溫孵育5min。（3）將DNA加入Lipo2000中，輕柔混勻，室溫孵育20min4.將24孔板中的正常培養(yǎng)基換為無血清的培養(yǎng)基（Opti-MEM）1.9ml。5.將100ulsiRNA/Lipo2000（DNA/Lipo2000）復(fù)合物混勻逐滴加入孔中，輕輕搖勻。6.4-6h后，換培養(yǎng)基（全培），48-72小時監(jiān)測轉(zhuǎn)染水平。7.加相應(yīng)的抗生素篩選，一般是轉(zhuǎn)染48小時后加入抗生素。挑出單后就可以用維持濃度，一般是篩選濃度的1/2第18頁,共36頁，2024年2月25日，星期天1．

確定抗生素作用的最佳濃度：不同的細(xì)胞株對各種抗生素有不同的敏感性,因此在篩選前要做預(yù)試驗,確定抗生素對所選擇細(xì)胞的最低作用濃度.

①提前24小時在96孔板或24孔板中接種細(xì)胞8孔,接種量以第二天長成25%單層為宜,置CO2孵箱中37℃培養(yǎng)過夜.

②將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基,抗生素濃度按梯度遞增0,（50,100,200,400,600,800和1000μg/ml）.

③培養(yǎng)10-14天以絕大部分（>90%）細(xì)胞死亡濃度為準(zhǔn),篩選穩(wěn)定表達克隆時可比該濃度適當(dāng)提高一個級別,維持時使用篩選濃度的一半.

2．

轉(zhuǎn)染48-72小時后按1:10的比例將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在6孔板中傳代,換為含預(yù)試驗中確定的抗生素濃度的選擇培養(yǎng)基.在6孔板內(nèi)可見單個細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)可見單個細(xì)胞分裂繁殖形成單個抗性集落.轉(zhuǎn)染細(xì)胞的穩(wěn)定篩選第19頁,共36頁，2024年2月25日，星期天3.挑選單克隆.

①濾紙片法：用消毒的5x5mm濾紙片浸過胰酶,將濾紙片貼在單細(xì)胞集落上10-15秒,取出粘附有細(xì)胞的濾紙片放于24孔板中繼續(xù)加壓培養(yǎng).細(xì)胞在24孔板中長滿后轉(zhuǎn)入25cm2培養(yǎng)瓶中,長滿后再轉(zhuǎn)入75cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng).

②有限稀釋法：將細(xì)胞消化下來后做連續(xù)的10倍稀釋（10-2-10-10）,將每一稀釋度的細(xì)胞滴加到96孔板中培養(yǎng),7-10天后,選擇單個克隆生長的孔再一次進行克隆.

4.

ELISA或Westernblot檢測單克隆細(xì)胞中外源蛋白的表達情況由于不同克隆的表達水平存在差異因此可同時挑選多個克隆選擇表達量最高的克隆傳代并保種.

第20頁,共36頁，2024年2月25日，星期天3逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染一、概述反轉(zhuǎn)錄病毒是RNA病毒，但有反轉(zhuǎn)錄酶，可使RNA轉(zhuǎn)錄為DNA，再整合到宿主細(xì)胞基因組。在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下首先將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA，再在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等蛋白酶作用下擴增的一類病毒。它有三個基因：gag-編碼病毒的核心蛋白；pol-編碼逆轉(zhuǎn)錄酶；env-編碼病毒的被膜糖蛋白。二、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體優(yōu)點：(1)轉(zhuǎn)染范圍廣，可以感染各種細(xì)胞類型，如淋巴細(xì)胞或肝細(xì)胞、肌細(xì)胞等;(2)轉(zhuǎn)入的外源基因可完全整合(3)對細(xì)胞感染率高，基因轉(zhuǎn)移率在10%-100%(4)感染細(xì)胞不產(chǎn)生病變，可建立細(xì)胞系長期持續(xù)表達外源基因逆轉(zhuǎn)錄病毒通常分兩種：簡單的（有時又稱為致癌病毒或γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒，如鼠白血病病毒）和復(fù)雜的（如慢病毒）。這些亞型間主要的差異在于復(fù)雜的逆轉(zhuǎn)錄病毒存在一些附屬基因和調(diào)控基因，而簡單的則沒有。第21頁,共36頁，2024年2月25日，星期天當(dāng)重組病毒載體導(dǎo)入包裝細(xì)胞后，缺陷病毒載體和包裝細(xì)胞的互補作用共同完成病毒裝配,該病毒顆?？筛腥酒渌拗骷?xì)胞，此時目的基因進入該細(xì)胞并整合到細(xì)胞基因組中，導(dǎo)致插入序列在宿主細(xì)胞中表達，產(chǎn)生目的蛋白。宿主細(xì)胞不能像包裝細(xì)胞那樣為缺失結(jié)構(gòu)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒提供結(jié)構(gòu)蛋白，因而在宿主細(xì)胞內(nèi)不會產(chǎn)生新的感染性病毒顆粒,保證了該載體在生物制品領(lǐng)域的生物安全性問題。三、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝原理逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)共由兩部分組成：缺陷病毒本身包裝細(xì)胞系提供病毒載體包裝成病毒粒子所需的結(jié)構(gòu)蛋白去除了正常的蛋白編碼序列而保留了復(fù)制和包裝信號，通過分子克隆技術(shù)將目的基因插入此載體上第22頁,共36頁，2024年2月25日，星期天第23頁,共36頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)染前一天，取對數(shù)生長的HEK293T細(xì)胞5×104個/孔種于24孔板中，500μlDMEM+10%FBS培養(yǎng)基/孔，設(shè)立空白組及p-BABE-EGFE-野生型及突變型質(zhì)粒組，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞生長至80~90%融合時，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。取0.5μg

p-BABE-EGFR野生型及突變型質(zhì)粒+

0.45μg

p-BABE-gag

+

0.05μgp-BABE-VSV質(zhì)粒分別稀釋于50μl無雙抗無血清的DMEM培養(yǎng)基中，輕柔混勻，室溫放置5分鐘。取2.5μLLipofectamineTM2000稀釋于50μl無雙抗無血清DMEM培養(yǎng)基中，輕柔混勻，室溫下靜置5分鐘。將轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒DNA稀釋液輕柔混合均勻，室溫靜置20分鐘。用無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基洗細(xì)胞2-3次，并換上400μl新鮮的無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基。將質(zhì)粒和LipofectamineTM2000混合物100μl逐滴加入孔中，來回輕柔搖晃細(xì)胞培養(yǎng)板，使混合物均勻覆蓋細(xì)胞。

4~6h后（可鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)確定轉(zhuǎn)染時間），去掉轉(zhuǎn)染試劑，用DMEM完全培養(yǎng)基洗兩遍，加入500μlDMEM完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞板置于37℃、5%CO2

培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后，1000rpm，4℃，離心5min，收集48h病毒上清，并換上500μL新鮮的10%FBSDMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，1000rpm，4℃，離心5min，收集72h病毒，收集的病毒可以直接用于感染，也可凍于-80℃用于后續(xù)感染實驗。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝第24頁,共36頁，2024年2月25日，星期天（1）種板：在感染前12～18h，取對數(shù)生長的NIH3T3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，以5×104/孔種于24孔板中，置于37℃、5%CO2

培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（2）第一次感染：取0.5ml48h病毒上清+0.5ml10%FBSDMEM培養(yǎng)基+4μg/mlpolybrene，加入NIH3T3細(xì)胞中，置于37℃、5%CO2

培養(yǎng)箱中感染16h。

（3）第二次感染：去除上述培養(yǎng)基，并向NIH3T3細(xì)胞中加入0.5ml72h病毒上清+0.5ml10%DMEM培養(yǎng)基+4μg/mlpolybrene，置于37℃、5%CO2

培養(yǎng)箱進行第二次感染，感染24h后，加入嘌呤霉素進行篩選。2、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染NIH3T3細(xì)胞第二次感染后，加入8μg/ml嘌呤霉素進行篩選，每3天換一液，待長出陽性克隆，抗生素減半維持，繼續(xù)篩選14天，挑取單克隆，擴大培養(yǎng)，凍存細(xì)胞。3、篩選穩(wěn)定表達p-BABE-EGFR野生型及突變型質(zhì)粒的NIH3T3細(xì)胞株第25頁,共36頁，2024年2月25日，星期天逆轉(zhuǎn)錄病毒可能會整合到人的細(xì)胞中。所以進行病毒操作時必須在生物安全柜中進行，帶口罩，廢液密閉回收用84滅活，槍頭、離心管等也要滅活。第26頁,共36頁，2024年2月25日，星期天血清血清會影響復(fù)合物的形成，降低轉(zhuǎn)染效率陽離子脂質(zhì)體和DNA的最佳量在使用血清時會有所不同，因此如果你想在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清需要對條件進行優(yōu)化。大部分細(xì)胞可以在無血清培養(yǎng)基中幾個小時內(nèi)保持健康。對于對血清缺乏比較敏感的細(xì)胞，可以使用OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基，一種營養(yǎng)豐富的無血清培養(yǎng)基，或者在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用血清。對于對血清缺乏比較敏感的貼壁細(xì)胞，建議使用LIPOFECTAMINE2000。14影響轉(zhuǎn)染實驗的因素第27頁,共36頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基中的抗生素抗生素，比如青霉素和鏈霉素，是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細(xì)胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。2第28頁,共36頁，2024年2月25日，星期天3細(xì)胞維護和培養(yǎng)的演變

一般低的細(xì)胞代數(shù)（<50）能確保基因型不變。轉(zhuǎn)染前細(xì)胞最好經(jīng)過1-2次傳代，以保證細(xì)胞生長旺盛，容易轉(zhuǎn)染。注意，貼壁細(xì)胞生長到幾乎匯片時就要趕快進行下一次傳代，千萬不要使細(xì)胞保持融合超過24小時，因為一旦長滿了，細(xì)胞們就“故步自封”不思轉(zhuǎn)染啦?；盍Τ渑娴哪贻p細(xì)胞更容易接受外來的新鮮事物。第29頁,共36頁，2024年2月25日，星期天4細(xì)胞鋪板密度一般轉(zhuǎn)染時，貼壁細(xì)胞密度為70%-90%，懸浮細(xì)胞密度為2×106-4×106細(xì)胞/ml時效果較好。確保轉(zhuǎn)染時細(xì)胞沒有長滿或處于靜止期。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。5DNA

質(zhì)量DNA質(zhì)量對轉(zhuǎn)染效率影響非常大。一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)（如脂質(zhì)體等）基于電荷吸引原理，如果DNA不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進行。第30頁,共36頁，2024年2月25日，星期天常見問題及解決方案5Q1：轉(zhuǎn)染效率低（1）沒有使用優(yōu)化的陽離子脂質(zhì)體試劑。選擇針對您的細(xì)胞類型轉(zhuǎn)染效率可能最高的陽離子脂質(zhì)體試劑。（2）沒有使用優(yōu)化條件。優(yōu)化陽離子脂質(zhì)體試劑和DNA的量。（3）DNA-陽離子脂質(zhì)體試劑復(fù)合物在存在血清條件下形成。在復(fù)合體形成時不要使用血清。（4）存在抑制劑。不要使用抗生素，EDTA，檸檬酸鹽，磷酸鹽，硫酸軟骨素，透明質(zhì)酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。（5）不恰當(dāng)?shù)募?xì)胞密度。細(xì)胞密度在轉(zhuǎn)染時融合度為70%~90%。第31頁,共36頁，2024年2月25日，星期天（7）陽離子脂質(zhì)體試劑凍結(jié)。

不要使用凍結(jié)的或儲存溫度低于4℃的陽離子脂質(zhì)體試劑。（8）轉(zhuǎn)染分析的問