蛋白質(zhì)的測定使用凱氏定氮法解說

關(guān)于蛋白質(zhì)的測定使用凱氏定氮法解說【學(xué)習(xí)目標(biāo)】1、掌握食品中氮含量與蛋白質(zhì)含量之間的換算。2、掌握凱氏定氮裝置的搭建技術(shù)。3、掌握蛋白質(zhì)的測定技術(shù)。第2頁,共43頁，2024年2月25日，星期天【基礎(chǔ)知識】1、蛋白質(zhì)及氨基酸概述蛋白質(zhì)由兩性氨基酸通過肽鍵結(jié)合在一起的大分子化合物，它主要含的元素是C、H、O、N。一般來說，pro的平均含氮量為16/100，既一份氮相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，此數(shù)值稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。所以在用凱氏定氮法定量pro時，將測得的總氮%乘上pro的換算系數(shù)K=6.25即為該物質(zhì)的pro含量。注意：①含N是蛋白質(zhì)區(qū)別其他有機(jī)化合物的主要標(biāo)志。②不同種類食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同，如玉米、蕎麥、青豆、雞蛋等為6.25，花生為5.46，大米為5.95，大豆及其制品為5.71，小麥粉為5.70、全小麥、大麥、燕麥、裸麥和小米是5.83；硬果類為5.30；牛乳及其制品為6.38。第3頁,共43頁，2024年2月25日，星期天2、原理蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物。食品與硫酸和硫酸銅、硫酸鉀一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸胺。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量。氨基酸～HCl～N〖注意〗此法測定得到的蛋白質(zhì)含量，實(shí)際上包括核酸、生物堿、含氮類脂、葉啉和含氮色素等非蛋白質(zhì)氮化合物，故稱為粗pro。第4頁,共43頁，2024年2月25日，星期天3、適用范圍國家標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于各種食品中蛋白質(zhì)的測定第5頁,共43頁，2024年2月25日，星期天4、任務(wù)分解任務(wù)一：濕法消化任務(wù)二：堿法蒸餾硼酸吸收任務(wù)三：鹽酸滴定任務(wù)四：數(shù)據(jù)記錄與計算第6頁,共43頁，2024年2月25日，星期天任務(wù)一：濕法消化子任務(wù)1：儀器及試劑的準(zhǔn)備儀器：第7頁,共43頁，2024年2月25日，星期天子任務(wù)1：儀器及試劑的準(zhǔn)備試劑作用硫酸銅a催化作用：加速有機(jī)物的氧化分解。b消化完全的指示劑：藍(lán)綠色，澄清，透明；c蒸餾時堿性反應(yīng)的指示劑：變深藍(lán)色或產(chǎn)生黑色沉淀硫酸鉀提高溶液沸點(diǎn)，從而加快有機(jī)物分解濃硫酸氧化作用：有機(jī)物質(zhì)氧化分解為H2O和CO2第8頁,共43頁，2024年2月25日，星期天子任務(wù)2：樣品預(yù)處理固體試樣0.2~2g半固體試樣2~5g液體試樣10~25g樣品充分混勻直接消化第9頁,共43頁，2024年2月25日，星期天子任務(wù)3：樣品稱量、消化1.000g奶粉0.2g硫酸銅6g硫酸鉀20mL濃硫酸玻璃珠小火加熱炭化至泡沫完全停止輕搖

大火加熱保持瓶中液體微沸至藍(lán)綠色澄清透明繼續(xù)加熱0.5～1h冷卻加20mL水冷卻同時做試劑空白試驗(yàn)第10頁,共43頁，2024年2月25日，星期天思考1、玻璃珠的作用？2、小漏斗的作用？3、消化過程為什么要不斷轉(zhuǎn)動凱氏瓶？4、開始消化時為什么用小火？5、消化液不易澄清透明時可采用的措施？6、消化完成時的產(chǎn)物？7、加20mL水的作用？8、空白試驗(yàn)的目的？第11頁,共43頁，2024年2月25日，星期天任務(wù)二：堿法蒸餾、硼酸吸收子任務(wù)1：儀器及試劑的準(zhǔn)備儀器：10mL100mL3只第12頁,共43頁，2024年2月25日，星期天子任務(wù)1：儀器及試劑的準(zhǔn)備水蒸氣發(fā)生器：裝水至2/3處，加入數(shù)粒玻璃珠，加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)ml，使水呈微紅色→按上圖所示搭好裝置〖注意〗①裝置搭建好了之后要先進(jìn)行撿漏，利用虹吸原理。②在蒸汽發(fā)生瓶中要加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)ml以使其始終保持酸性，以防水中氨蒸出。第13頁,共43頁，2024年2月25日，星期天子任務(wù)1：儀器及試劑的準(zhǔn)備試劑：40%氫氧化鈉20%硼酸溶液混合指示劑1、1份甲基紅乙醇溶液（1g/L）與5份溴甲酚綠乙醇溶液（1g/L）臨用時混合酒紅色→綠色2、2份甲基紅乙醇溶液（1g/L）與1份亞甲基藍(lán)乙醇溶液（1g/L）臨用時混合紫紅色→綠色第14頁,共43頁，2024年2月25日，星期天子任務(wù)2：堿化蒸餾、硼酸吸收10.0mL硼酸溶液100mL三角瓶加1～2滴混合指示劑冷凝管下端插入三角瓶液面下準(zhǔn)確吸取10mL試樣由小玻杯流入反應(yīng)室少量水洗滌小漏斗蓋緊玻璃塞量筒取10.0mLNaOH溶液倒入小玻杯提起玻塞使其緩慢流入反應(yīng)室立即塞緊玻璃塞加水于小玻杯防漏氣通蒸汽顏色變化時開始計時蒸餾5min移動接受瓶使液面離開冷凝管下端再蒸餾1min用少量水沖洗冷凝管下端外部取下接收瓶第15頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

〖注意〗①加入NaOH一定要過量，判斷NaOH是否過量的方法，看反應(yīng)室內(nèi)液體顏色第16頁,共43頁，2024年2月25日，星期天加堿足量的判斷：溶液會變成深藍(lán)色或產(chǎn)生黑色沉淀原理：過量的氫氧化鈉會跟硫酸銅反應(yīng)生成氫氧化銅藍(lán)色沉淀，藍(lán)色沉淀在加熱的情況下會分解成黑色的氧化銅沉淀。如果沒有上述現(xiàn)象，說明氫氧化鈉加的量不足，需要繼續(xù)加入氫氧化納，直到產(chǎn)生上述現(xiàn)象為止。第17頁,共43頁，2024年2月25日，星期天②樣液中的硫酸銨在堿性條件下釋放出氨，為防止樣液中氨氣逸出。一是加入氫氧化鈉溶液要過量，二是要水封，三要夾緊廢液蝴蝶夾后再通蒸汽，四要在蒸餾過程中要注意接頭處有無松漏現(xiàn)象③加熱蒸餾出來的氨可以用硼酸進(jìn)行吸收，因?yàn)榕鹚嶂怀饰⑷跛嵝裕挥绊懼甘緞┑淖兩磻?yīng)，但是具有吸收氨的作用，與氨形成強(qiáng)堿弱酸鹽。④冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸餾。吸收液溫度不應(yīng)超過40℃，避免氨氣逸出，若超過時可置于冷水浴中使用。第18頁,共43頁，2024年2月25日，星期天⑤檢驗(yàn)蒸餾是否完成的方法：奈氏試紙法。原理:NH4+或NH3遇奈氏試劑會反應(yīng)生成綜紅色的碘化汞銨化合物，如NH4+或NH3含量較少，試紙呈黃色，若含量過多，呈棕黃色或棕紅色的沉淀反應(yīng)⑥在蒸餾時，蒸汽發(fā)生要均勻充足，蒸餾過程中不得?；饠嗥?否則會發(fā)生倒吸。⑦蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面，再蒸1分鐘，將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶內(nèi)，再將吸收瓶移開，最后關(guān)閉電源，絕不能先關(guān)閉電源，否則吸收液將發(fā)生倒吸。⑧所用的試劑溶液必須用無氨蒸餾水配制。第19頁,共43頁，2024年2月25日，星期天任務(wù)三：鹽酸滴定子任務(wù)1：儀器及試劑的準(zhǔn)備儀器：25mL酸式滴定管1套試劑0.0500mol/LHCL標(biāo)準(zhǔn)溶液第20頁,共43頁，2024年2月25日，星期天子任務(wù)2：鹽酸滴定接收瓶以HCL標(biāo)準(zhǔn)滴定液滴定灰色終點(diǎn)記錄VHcl（1）硼酸吸收液的顏色（2）吸收氨氣后的硼酸吸收液的顏色（3）鹽酸滴定終點(diǎn)的顏色第21頁,共43頁，2024年2月25日，星期天〖注意〗①混合指示劑在堿性溶液中呈綠色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈紅色。②酸式滴定管的正確使用第22頁,共43頁，2024年2月25日，星期天項(xiàng)目名稱檢測日期樣品名稱檢驗(yàn)依據(jù)內(nèi)容123空白樣品質(zhì)量m/gV初/mLV終/

mL消耗的體積V1/mL吸取消化液體積V3/mL蛋白質(zhì)含量（g/100g）平均值（g/100g）兩次測定之差/平均值精密度Cy

（g/100g）

F：牛乳及其制品的蛋白質(zhì)換算系數(shù)6.38任務(wù)四、數(shù)據(jù)記錄與計算第23頁,共43頁，2024年2月25日，星期天有效數(shù)字：蛋白質(zhì)含量≥1g/100g時，結(jié)果保留三位有效數(shù)字蛋白質(zhì)含量＜1g/100g時，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。精密度：在重復(fù)性條件下的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%（g/100g）第24頁,共43頁，2024年2月25日，星期天小結(jié)步驟反應(yīng)前后顏色變化濕法消化凱氏燒瓶：樣品無色（加硫酸前）→加硫酸炭化黑色→消化后紅棕色→棕褐色→消化終點(diǎn)藍(lán)綠色/墨綠色→淡藍(lán)色（冷卻后溶液）堿化蒸餾反應(yīng)室：深藍(lán)色或黑色沉淀硼酸吸收紫紅色→綠色鹽酸滴定甲基紅和溴甲酚綠混合指示劑：綠色→灰色甲基紅和亞甲基藍(lán)混合液：綠色→藍(lán)紫色第25頁,共43頁，2024年2月25日，星期天凱氏定氮法用于所有動物、植物類食品的蛋白質(zhì)含量的測定，但因樣品中含有核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白質(zhì)含氮化合物，所以測定結(jié)果為粗蛋白質(zhì)含量。若要測定樣品的蛋白氮,則需要向樣品中加入三氯乙酸溶液,使其最終濃度為5%,然后測定未加入三氯乙酸的樣品及加入三氯乙酸溶液后樣品中的含氮量,進(jìn)一步計算出蛋白質(zhì)含量:

蛋白氮=總氮-非蛋白氮第26頁,共43頁，2024年2月25日，星期天任務(wù)五：試驗(yàn)器具的清洗整理第27頁,共43頁，2024年2月25日，星期天【拓展學(xué)習(xí)】1、其他蛋白質(zhì)測定方法——分光光度法（1）原理食品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解，分解產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，在pH4.8的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)生成黃色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氫化吡啶化合物。在波長400nm下測定吸光度值，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量，結(jié)果乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。（2）特點(diǎn)快速、污染少、操作簡單、省時

國家標(biāo)準(zhǔn)測定蛋白質(zhì)第二法第28頁,共43頁，2024年2月25日，星期天2、改良式凱氏裝置江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院泰州市質(zhì)監(jiān)局第29頁,共43頁，2024年2月25日，星期天3、自動凱氏定氮法1.原理同常量凱氏定氮法2.主要儀器

自動凱氏定氮儀：該裝置內(nèi)具有自動加堿蒸餾裝置，自動吸收和滴定裝置以及自動數(shù)字顯示裝置。消化裝置：由優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶及紅外加熱裝置組合成的消化爐。3、試劑

除硫酸銅與硫酸鉀制成片劑外，其他試劑與常量測定相同。4、優(yōu)點(diǎn)靈敏、準(zhǔn)確、快速以及用量少第30頁,共43頁，2024年2月25日，星期天準(zhǔn)確稱取某乳粉樣品0.800克，經(jīng)凱氏法消化定容至100ml，移取5ml消化液進(jìn)行蒸餾，用20ml硼酸吸收，再用0.05000mol/lHCl滴定，結(jié)果消耗5.00ml，試計算該乳粉的蛋白質(zhì)含量？試述蛋白質(zhì)測定中，樣品消化過程所必須注意的事項(xiàng)，消化過程中內(nèi)容物顏色發(fā)生什么變化？為什么？樣品經(jīng)消化進(jìn)行蒸餾前，為什么要加入氫氧化鈉？這時溶液發(fā)生什么變化？為什么？如果沒有變化，說明什么問題？須采用什么措施？第31頁,共43頁，2024年2月25日，星期天子項(xiàng)目二14醬油中氨基酸態(tài)氮的測定（GB/T5009.39-2003）第32頁,共43頁，2024年2月25日，星期天任務(wù)一：相關(guān)儀器設(shè)備及試劑的準(zhǔn)備

儀器設(shè)備：堿式滴定管、移液管、200mL燒杯、100容量瓶、酸度計、磁力攪拌器、滴定臺試劑：濃度為36%中性甲醛；氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.05mol/L（需臨用前標(biāo)定）第33頁,共43頁，2024年2月25日，星期天任務(wù)二：成分分析

1.原始記錄表格的設(shè)計第34頁,共43頁，2024年2月25日，星期天項(xiàng)目名稱檢測日期樣品名稱檢驗(yàn)依據(jù)樣品滴定次數(shù)加甲醛前加甲醛后空白滴定V2初讀數(shù)末讀數(shù)消耗體積初讀數(shù)末讀數(shù)消耗體積V112氨基酸態(tài)氮含量X（g/100mL）=平均值精密度第35頁,共43頁，2024年2月25日，星期天2.樣品中游離酸中和吸取5mL試樣→100mL容量瓶中→定容→混勻后吸取20.0mL→200mL燒杯→加水60mL→插入酸度計的指示電極和參比電極→開動磁力攪拌器→0.050mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計指示pH8.2→記錄消耗體積第36頁,共43頁，2024年2月25日，星期天3.滴定樣品