《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)》課件

克隆羊“多莉”“人耳鼠”再出風(fēng)頭

2001年，一只特別的活老鼠在北京引起轟動(dòng)——這是有著一對(duì)紅眼睛的、尾巴長(zhǎng)長(zhǎng)的、渾身沒(méi)毛的小白鼠。值得一提的是，這只小白鼠的背上，竟長(zhǎng)著一只幾乎與身子一般大小的“人耳”。這只老鼠背上的“人耳”是由上海市第九人民醫(yī)院副院長(zhǎng)、整復(fù)外科主任曹誼林教授利用組織工程技術(shù)復(fù)制出來(lái)的。

長(zhǎng)有人耳的小白鼠

英國(guó)科學(xué)家近日用患者自身的細(xì)胞制成一種名為“我的皮膚”的生物活性繃帶，它給皮膚燒傷病人帶來(lái)了福音。他們先從患者身上采集一些細(xì)胞樣本，再讓其在特殊的膜片上增殖。5至7天后，就可以將這種特殊膜片敷在患者的傷口上，膜片會(huì)將患者自身的細(xì)胞逐漸“釋放”到傷口，并促進(jìn)新生皮膚層的生長(zhǎng)，達(dá)到加速傷口愈合的目的。

以上資料，透露了怎樣的信息？動(dòng)物細(xì)胞工程常用的技術(shù)手段動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)—基礎(chǔ)動(dòng)物細(xì)胞融合單克隆抗體制備應(yīng)用核移植自探提綱1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程2原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)3動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件及應(yīng)用4體細(xì)胞核移植的過(guò)程5體細(xì)胞核移植的應(yīng)用前景一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)為什么要進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)？材料一：在治療燒傷病人時(shí)，通常是取病人的健康皮膚進(jìn)行自體移植。對(duì)于大面積燒傷的病人，自體健康皮膚非常有限，使用他人皮膚來(lái)源又不足，且會(huì)產(chǎn)生排斥反應(yīng)。怎樣才能獲得大量的自體健康皮膚呢？材料二：許多動(dòng)物細(xì)胞能分泌蛋白質(zhì)，如抗體等。但是，單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)很少，怎樣才能獲得大量的分泌蛋白呢？一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)2、過(guò)程：閱讀課本P44-45取動(dòng)物組織塊剪碎組織用胰蛋白酶處理分散成單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸液進(jìn)行原代培養(yǎng)貼滿瓶壁的細(xì)胞用胰蛋白酶處理分散成單個(gè)細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中進(jìn)行傳代培養(yǎng)放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)取什么樣的材料好？幼齡與老齡動(dòng)物的組織細(xì)胞比較，分化程度低的與分化程度高的組織細(xì)胞比較，哪一種更易于培養(yǎng)？為什么動(dòng)物細(xì)胞要分散成單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)?用胰蛋白酶分散細(xì)胞，說(shuō)明細(xì)胞間的物質(zhì)主要是什么成分？用胃蛋白酶行嗎？

什么叫原代培養(yǎng)？什么是傳代培養(yǎng)？用概念圖的方式完成細(xì)胞培養(yǎng)的流程圖動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中會(huì)出現(xiàn)什么特點(diǎn)？

1957年，科學(xué)家采用胰蛋白酶消化處理和應(yīng)用液體培養(yǎng)基的方法，獲得了單層細(xì)胞培養(yǎng)。單層培養(yǎng)法的出現(xiàn)，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展起了很大的推動(dòng)作用。此后單層培養(yǎng)成為細(xì)胞培養(yǎng)普遍應(yīng)用的技術(shù)。小知識(shí)在科學(xué)研究中，有時(shí)需要明確界定培養(yǎng)液的成分，而血清中由于含有許多未知成分，會(huì)對(duì)研究結(jié)果有影響，因此，在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，也可采用無(wú)血清培養(yǎng)。無(wú)血清培養(yǎng)基是在基本培養(yǎng)基中，添加一些已知的促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的物質(zhì)。小知識(shí)一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)4、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用：大規(guī)模的生產(chǎn)有重要價(jià)值的生物制品為基因工程提供受體細(xì)胞檢測(cè)有毒物質(zhì)，判斷毒性用于生理、病理、藥理等方面的研究閱讀課本P46——47小結(jié)：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)特點(diǎn)原理概念：貼壁生長(zhǎng)，接觸抑制動(dòng)物組織胰蛋白酶剪碎單個(gè)細(xì)胞加培養(yǎng)液細(xì)胞懸液分瓶培養(yǎng)10代細(xì)胞50代細(xì)胞不死細(xì)胞原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞株細(xì)胞系適宜條件培養(yǎng)條件應(yīng)用無(wú)菌無(wú)毒，營(yíng)養(yǎng)，溫度、PH，氣體環(huán)境過(guò)程細(xì)胞增殖植物組織培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的比較細(xì)胞的全能性細(xì)胞增殖固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基蔗糖植物激素葡萄糖動(dòng)物血清植物體更多細(xì)胞快速繁殖、培育無(wú)病毒植株獲得細(xì)胞或細(xì)胞分泌蛋白個(gè)體水平細(xì)胞水平用離體的植物組織或細(xì)胞能培養(yǎng)成完整的植株，一個(gè)動(dòng)物細(xì)胞能否培育成完整動(dòng)物體？1997年，美國(guó)威斯康星州的一個(gè)奶牛場(chǎng)有一頭名叫盧辛達(dá)（Lucinda）的奶牛，年產(chǎn)奶量為30.8t，創(chuàng)造了世界奶牛產(chǎn)奶量最高新紀(jì)錄。目前世界各國(guó)高產(chǎn)奶牛場(chǎng)奶牛，年平均產(chǎn)奶量一般為十幾噸，而我國(guó)奶牛產(chǎn)奶量年平均水平僅為3～4t。能不能用高產(chǎn)奶牛的一個(gè)體細(xì)胞，培養(yǎng)出一頭高產(chǎn)奶牛呢？

高度分化的植物組織仍保持著全能性，動(dòng)物細(xì)胞的全能性會(huì)隨著動(dòng)物細(xì)胞分化程度的提高而逐漸變?nèi)?。目前還不能用類似植物組織培養(yǎng)的方法獲得完整動(dòng)物個(gè)體，用動(dòng)物體細(xì)胞克隆的動(dòng)物，實(shí)際是通過(guò)核移植來(lái)實(shí)現(xiàn)的。2、體細(xì)胞核移植的過(guò)程閱讀課本P48的流程圖MII期的卵母細(xì)胞做受體細(xì)胞，卵細(xì)胞體積大，易于操作，含有促使細(xì)胞核表達(dá)全能性的物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)條件。將體細(xì)胞核移植入去核卵細(xì)胞內(nèi)，既保證了重組細(xì)胞的完整性，又能刺激體細(xì)胞核表達(dá)其全能性，發(fā)展成為一個(gè)新的個(gè)體。

在體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到受體卵母細(xì)胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細(xì)胞的核？

為使核移植的胚胎或動(dòng)物的遺傳物質(zhì)全部來(lái)自有重要利用價(jià)值的動(dòng)物提供的體細(xì)胞，在供體細(xì)胞的細(xì)胞核移至受體細(xì)胞之前，必須將受體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)去掉或?qū)⑵淦茐摹?/p>

用于核移植的供體細(xì)胞一般都選用傳代10代以內(nèi)的細(xì)胞，這是為什么？

培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞一般當(dāng)傳代至10～50代左右時(shí)，部分細(xì)胞核型可能會(huì)發(fā)生變化，其細(xì)胞遺傳物質(zhì)可能會(huì)發(fā)生突變，而10代以內(nèi)的細(xì)胞一般能保持正常的二倍體核型。因此，在體細(xì)胞核移植中，為了保證供體細(xì)胞正常的遺傳基礎(chǔ)，通常采用傳代10代以內(nèi)的細(xì)胞。

（以克隆高產(chǎn)奶牛為例）核移植的受體細(xì)胞是什么？處在什么時(shí)期？為什么選用該細(xì)胞？你認(rèn)為用上述體細(xì)胞核移植方法生產(chǎn)的克隆動(dòng)物，是對(duì)體細(xì)胞供體動(dòng)物進(jìn)行了100%的復(fù)制嗎？為什么？克隆牛的遺傳物質(zhì)主要來(lái)自誰(shuí)？

克隆動(dòng)物絕大部分DNA來(lái)自于供體細(xì)胞核，但其核外還有少量的DNA，即線粒體中的DNA是來(lái)自于受體卵母細(xì)胞。所以，用教材中所述的方法克隆的動(dòng)物不是供核動(dòng)物完全相同的復(fù)制。

動(dòng)物體細(xì)胞核移植產(chǎn)生的新個(gè)體的親本有三個(gè)：體細(xì)胞核供體、卵細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)供體、代孕母體。新個(gè)體細(xì)胞核基因型與體細(xì)胞核供體完全一樣，因此新個(gè)體性狀與體細(xì)胞核供體基本相同。卵細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中也有少量的DNA，新個(gè)體性狀與卵細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)供體有一些地方相同。代孕母體沒(méi)有為新個(gè)體提供遺傳物質(zhì)，新個(gè)體性狀與代孕母體基本沒(méi)有聯(lián)系。動(dòng)物體細(xì)胞核移植產(chǎn)生的新個(gè)體涉及的親本有幾個(gè)？與克隆動(dòng)物在遺傳上是什么關(guān)系？

2、體細(xì)胞核移植的過(guò)程以概念圖的形式表示體細(xì)胞核移植過(guò)程？取供體細(xì)胞取卵母細(xì)胞

供體細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)到MⅡ中期

卵母細(xì)胞去核

供體細(xì)胞注入去核的卵母細(xì)胞

供體核進(jìn)入受體卵母細(xì)胞

重組細(xì)胞

代孕母牛

生出與核供體遺傳物質(zhì)基本相同的個(gè)體早期胚胎此過(guò)程用到了哪些生物學(xué)技術(shù)？繁殖方式是什么類型？細(xì)胞培養(yǎng)核移植技術(shù)胚胎移植細(xì)胞培養(yǎng)2、體細(xì)胞核移植的技術(shù)流程生殖方式——遺傳物質(zhì)來(lái)源——后代性狀表現(xiàn)——電激處理細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)性生殖主要來(lái)自供體細(xì)胞核，少量來(lái)自卵細(xì)胞質(zhì)主要與核供體相似，少量性狀與卵供體相似

美國(guó)威斯康星州的一個(gè)奶牛場(chǎng)有一頭名叫盧辛達(dá)（Lucinda）的奶牛，年產(chǎn)奶量為30.8t，創(chuàng)造了世界奶牛產(chǎn)奶量最高新紀(jì)錄。能利用體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達(dá)嗎？請(qǐng)說(shuō)明理由。

思考與探究：

可以用體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達(dá)。盧辛達(dá)的產(chǎn)奶量很高，說(shuō)明它有高產(chǎn)奶的遺傳基礎(chǔ)，利用盧辛達(dá)的體細(xì)胞克隆的奶牛其遺傳物質(zhì)基本上全部來(lái)自該奶牛，其克隆牛具有高產(chǎn)的遺傳基礎(chǔ)，如果精心培育和飼養(yǎng)，有可能在世界范圍內(nèi)推廣，克隆牛再與高產(chǎn)的公牛自然繁殖，可得到很多高產(chǎn)的后代，從而加快奶牛改良進(jìn)程。但同時(shí)需注意，該克隆牛不能無(wú)限制地推廣，其數(shù)量不宜過(guò)多，尤其是在小范圍內(nèi)不能無(wú)限的繁殖，以避免奶牛群出現(xiàn)近親繁殖而引起種質(zhì)衰退。如果將克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達(dá)的任務(wù)交給你，你將如何對(duì)它進(jìn)行克?。?/p>

首先從盧辛達(dá)耳朵（也可用別的組織、器官，耳朵在活體上容易?。┥霞羧∫恍K組織，在體外培養(yǎng)獲得該組織（如軟骨組織）的細(xì)胞。從屠宰場(chǎng)取廢棄的牛卵巢，抽取卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟。用顯微針去除卵母細(xì)胞的核，再將耳細(xì)胞注入卵母細(xì)胞，用電刺激方法使卵母細(xì)胞與體細(xì)胞融合，這時(shí)供體核就進(jìn)入了受體卵母細(xì)胞，再用電刺激或化學(xué)物質(zhì)激活注入了體細(xì)胞核的卵母細(xì)胞，使其完成細(xì)胞分裂和發(fā)育過(guò)程。核移植胚胎在體外短時(shí)間培養(yǎng)后，挑選正常卵裂的胚胎植入經(jīng)同期發(fā)情處理的受體母牛體內(nèi)。

小知識(shí)

2001年我國(guó)科學(xué)家將牛耳細(xì)胞克隆的胚胎移入135頭牛體內(nèi)，每頭牛移植了兩枚克隆胚。從2002年1月8日起，陸續(xù)獲取了14頭克隆牛犢。至2003年11月，這批被克隆的牛，存活的只有5頭。二、動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動(dòng)物4、存在的問(wèn)題：閱讀課本P50

體細(xì)胞核移植技術(shù)在研究和應(yīng)用上還存在什么問(wèn)題？請(qǐng)你查閱資料，了解這方面的前沿動(dòng)態(tài)。

研究方面：克隆動(dòng)物基因組重新編程的機(jī)制尚不清楚，克隆技術(shù)效率低，克隆動(dòng)物畸形率高、死亡率高、易出現(xiàn)早衰等問(wèn)題。這些問(wèn)題尚在研究中。

應(yīng)用上：生產(chǎn)克隆動(dòng)物費(fèi)用昂貴，距大規(guī)模應(yīng)用還有一定距離。小結(jié)：二、動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動(dòng)物

動(dòng)物核移植是將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核,移入一個(gè)已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中.使其重組并發(fā)育成一個(gè)新的胚胎,這個(gè)新的胚胎最終發(fā)育為動(dòng)物個(gè)體.2、過(guò)程：3、應(yīng)用：4、問(wèn)題：卵母細(xì)胞采集MⅡ期卵母細(xì)胞去核供體牛供體細(xì)胞注入去核卵母細(xì)胞供體細(xì)胞培養(yǎng)電激處理使供體核進(jìn)入受體卵母細(xì)胞構(gòu)建重組胚胎胚胎移植代孕母?？寺∨?、概念：練習(xí)1.（2009浙江）用動(dòng)、植物體的體細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)，下列敘述正確的是()

A.都需要CO2培養(yǎng)箱 B.都須用液體培養(yǎng)基

C.都要在無(wú)菌條件下進(jìn)行D.都可體現(xiàn)細(xì)胞的全能性C2.（10浙江）下列關(guān)于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的敘述，正確的是（）A培養(yǎng)保留接觸抵制的細(xì)胞在培養(yǎng)瓶壁上可形成多層細(xì)胞B克隆培養(yǎng)法培養(yǎng)過(guò)程上多數(shù)細(xì)胞的基因型會(huì)發(fā)生改變C二倍體細(xì)胞的傳代培養(yǎng)次數(shù)通常是無(wú)限的D惡性細(xì)胞系的細(xì)胞可進(jìn)行傳代培養(yǎng)D練習(xí)3.(2008年寧夏高考)回答下列有關(guān)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的問(wèn)題：(1)在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長(zhǎng)到細(xì)胞表面______時(shí)，細(xì)胞會(huì)停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞的________。此時(shí)，瓶壁上形成的細(xì)胞層數(shù)是________。要使貼壁的細(xì)胞從瓶壁上分離下來(lái)，需要用酶處理，可用的酶是______________。(2)隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增多，絕大部分細(xì)胞分裂停止，進(jìn)而出現(xiàn)________的現(xiàn)象；但極少數(shù)細(xì)胞可以連續(xù)增殖，其中有些細(xì)胞會(huì)因遺傳物質(zhì)發(fā)生改變而變成________細(xì)胞，該種細(xì)胞的黏著性________，細(xì)胞膜表面蛋白質(zhì)(糖蛋白)的量___________。相互接觸接觸抑制單層(一層)胰蛋白酶衰老甚至死亡不死性降低減少(3)現(xiàn)用某種大分子染料，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)，觀察到死細(xì)胞被染色，而活細(xì)胞不染色，原因是______________________________________________(4)檢查某種毒物是否能改變細(xì)胞染色體的數(shù)目，最好選用細(xì)胞分裂到______期的細(xì)胞用顯微鏡進(jìn)行觀察。(5)在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，通常在________條件下保存細(xì)胞。因?yàn)樵谶@種條件下，細(xì)胞中________的活性降低，細(xì)胞________的速率降低。(6)給患者移植經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)形成的皮膚組織后，發(fā)生了排斥現(xiàn)象，這是因?yàn)闄C(jī)體把移植的皮膚組織當(dāng)作_______進(jìn)行攻擊。由于活細(xì)胞的膜具有選擇透過(guò)性，大分子染料不能進(jìn)入活細(xì)胞內(nèi)(或由于死細(xì)胞的膜喪失了選擇透過(guò)性，大分子染料能夠進(jìn)入死細(xì)胞內(nèi)而著色)中冷凍(或超低溫、液氮)酶新陳代謝抗原

細(xì)胞的衰老與動(dòng)物機(jī)體的衰老有著密切的關(guān)系，細(xì)胞的增殖能力與供體的年齡有關(guān)，幼齡動(dòng)物細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，有絲分裂旺盛，老齡動(dòng)物則相反。所以，一般來(lái)說(shuō)幼年動(dòng)物的組織細(xì)胞比老年動(dòng)物的組織細(xì)胞易于培養(yǎng)。同樣，組織細(xì)胞的分化程度越低，則增殖能力越強(qiáng)，所以更容易培養(yǎng)。一般取胚胎細(xì)胞或幼齡動(dòng)物的器官組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

成塊的組織中細(xì)胞與細(xì)胞靠在一起，彼此限制了細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，分散成單個(gè)細(xì)胞后培養(yǎng)，細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)容易供應(yīng)，其代謝廢物容易排出；而用大塊組織培養(yǎng)時(shí)，內(nèi)部細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和代謝廢物的排出都較困難，因此，這些細(xì)胞在體外長(zhǎng)時(shí)間的生存和生長(zhǎng)就較困難。同時(shí)，分散成單個(gè)細(xì)胞養(yǎng)，可使得在細(xì)胞水平操作的其他技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)。

用胰蛋白酶分散細(xì)胞，說(shuō)明細(xì)胞間的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。胃蛋白酶作用的適宜pH約為2，當(dāng)pH大于6時(shí)，胃蛋白酶就會(huì)失去活性。胰蛋白酶作用的適宜環(huán)境pH為7.2～8.4。多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的適宜pH為7.2～7.4，胃蛋白酶在此環(huán)境中沒(méi)有活性，而胰蛋白酶在此環(huán)境中活性較高，因此胰蛋白酶適宜用于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的消化。

胰蛋白酶不會(huì)把細(xì)胞消化掉嗎？為什么？

胰蛋白酶除了可以消化細(xì)胞間的蛋白外，長(zhǎng)時(shí)間的作用也會(huì)消化細(xì)胞膜蛋白，對(duì)細(xì)胞有損傷作用，因此必須