山茱萸神經(jīng)保護作用的代謝組學(xué)研究

[3]，IS發(fā)病機制復(fù)雜，目前認為IS的關(guān)鍵事件之一是機體代謝紊亂[4]。探究缺血性腦卒中的發(fā)病機制、診斷、治療的重要的意義，是運用代謝組學(xué)，來分析不同樣本代謝物在體內(nèi)是如何變化的[5],代謝物的分析已廣泛應(yīng)用于生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，還有藥物療效評價[6]。目前主要根據(jù)病史和查體，輔以影像學(xué)檢查來臨床診斷IS。代謝過程產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物主要包括脂肪酸、氮基酸、碳水化合物、酮體等。氮基酸、脂肪酸和碳水化合物是最重要的幾種代謝產(chǎn)物[7]。研究表明當(dāng)脂肪酸、氮基酸物等代謝物在IS等心腦血管疾病使機體中發(fā)生改變時[8]，伴隨炎癥和氧化應(yīng)激的出現(xiàn)[9]。目前對于研究代謝組學(xué)的最佳技術(shù)就是HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)，高效液相色譜不會出現(xiàn)難氣化和熱不穩(wěn)定等問題，山茱萸是一種重要的中藥材，它可保護腎臟和肝臟的健康。根據(jù)現(xiàn)代研究，大約有90種化合物，可以被山茱萸分離和鑒定出來。山茱萸具有豐富的藥理活性，已被大量的體內(nèi)和體外實驗研究證實，包括神經(jīng)保護、保肝、抗菌活性、降血糖、抗氧化、抗炎、抗癌以及骨質(zhì)疏松等作用[10]。含量最大的莫諾苷已有文獻報道具有神經(jīng)保護作用。隨著時代的發(fā)展，中藥的應(yīng)用前景也越來越好，人們也越來越重視中藥的作用以及運用，對抗缺血性腦卒中的西藥目前已經(jīng)存在，中藥也有，例如三七，但是中藥藥效仍不及西藥，關(guān)于其對抗缺血性腦卒中的代謝作用機制已有不少人研究過，但關(guān)于山茱萸對抗腦卒中的研究不多，代謝通路方面的更少，所以我們有必要作此研究，重點探討山茱萸治療腦卒中后發(fā)揮的代謝作用機制。2實驗動物與材料2.1實驗動物品系：SPF級SD大鼠性別：雄性數(shù)量：36只體重：250-280g廠家：廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)地址：廣東藥科大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)條件：溫度20～25℃；濕度40%～60%2.2實驗材料表1實驗材料材料名稱生產(chǎn)廠家水合氯醛上海麥克林生化科技有限公司尼莫地平亞寶藥業(yè)MCAO線栓長沙邁越生物科技有限公司生理鹽水北京中杉金橋生物科技有限公司PBS緩沖液粉末（適配2L）北京中杉金橋生物科技有限公司BCA試劑盒美國Rockford有限公司SPF級SD雄性大鼠南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心甲醇（色譜純）FisherScientific公司乙腈（色譜級）Merck公司質(zhì)譜儀校準液Thermo賽默飛世爾公司2.3實驗儀器表2主要實驗儀器儀器名稱生產(chǎn)廠家數(shù)控超聲波清洗器日本島津公司電子天平德國Startorius公司P2,20,200,1000移液槍德國Eppendorf公司低溫冷凍離心機長沙湘智離心機儀器有限公司旋渦震蕩儀賽默飛世爾科技(中國)有限公司十萬分之一電子天平美國梅特勒托利多公司混合冷凍球磨儀德國Retsch公司低溫冷凍干燥機德國Eppendorf公司UltiMate3000超高效液相色譜美國Thermo公司QExactiveOrbitrapplus組合型四級桿質(zhì)譜美國Thermo公司3實驗方法3.1山茱萸提取物的制備稱取山茱萸，加入純水12倍量，加熱，然后提取2次，每次時長為2h，合并濾液然后加熱濃縮，即得山茱萸浸膏備用。3.2分組與給藥隨機取36只SD雄性大鼠，體重范圍在250～280g，將其隨機分為3組，每組12只，為山茱萸高劑量組(7.36/g/kg），假手術(shù)組，模型組，根據(jù)大鼠體重計算其給藥量，并且連續(xù)給藥14d，然后將等體積的生理鹽水給予假手術(shù)組和模型組，在12/12h的黑暗/光循環(huán)和特定的無病原體(SPF）條件下飼養(yǎng)，在整個實驗過程中，大鼠均可以自由進食和飲水。3.3MCAO模型的操作方法與步驟3.3.1線栓的制備挑選釣魚線，約0.26mm的直徑，取其線身，隨后以垂直的方式，截成小段，約5cm長，選取細砂紙，將其頭部棱角磨平。優(yōu)選出頭部整體統(tǒng)一、光滑平整者。離線栓頭部20cm處用記號筆做一標(biāo)記，然后消毒線栓并浸泡，最后晾干。做手術(shù)前，將其置于無菌地生理鹽水中，備用，線栓臨用前浸蘸2.5×1000000L肝納素。3.3.2.術(shù)前動物準備將大鼠置于室溫20～23°C和濕度60%～70%的環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，明光和暗光交替光照12h，飼養(yǎng)1～2d，術(shù)前12h將大鼠禁食，可自由飲水。3.3.3動物麻碎用10mL/kg的5%水合氯醛向大鼠腹腔內(nèi)注射麻醉，注射器針從腹部到頭部刺入腹腔。當(dāng)核心阻力高時緩慢注射。大約10min后，老鼠會逐漸跛行，反應(yīng)冷淡，抓住尾巴，直到它不抵抗時，將其置仰臥位，固定上頜中切牙和四肢。實驗過程中確保大鼠肛溫在37°C左右，直到恢復(fù)活動。3.3.4手術(shù)步驟手術(shù)按照外科無菌原則操作。①備皮。②于正中線旁開約5mm處，將右淺筋膜沿縱向切開，玻璃分針在頸總動脈（CCA）和迷走神經(jīng)中游離，至CCA分叉處。③在CCA、ECA（頸外動脈）、ICA（頸內(nèi)動脈）下方的部位分別置線，將CCA近心端和頸外動脈近分叉處結(jié)扎。④剪一小口，在CCA距其末端處，剪的長度約5.0mm，然后輕輕的用手術(shù)鑷將線栓推進，大約插入(18.0±0.5)mm時就停止推進，然后在ICA近心端處，將該動脈縫好。缺血1h后，將阻塞線拔出，約10min時，實現(xiàn)再灌注。Sham組插線深度不同于其他組，應(yīng)小于10mm。3.4取材在再灌注時，用5%水合氯醛麻醉大鼠，將大鼠四肢以仰臥位的姿勢擺放，固定住，然后從劍突向胸骨左緣的方向，用剪刀迅速剪斷助骨，用9號灌注針(頭端膨大鈍圓)刺破心壁自左心室插入主動脈后，結(jié)扎，剪開右心耳后，用生理鹽水沖洗。用剪刀迅速剪斷脊髓，剪開頭皮，去除顱頂部的肌肉組織。對于枕骨，需用咬骨鉗咬開，然后用止血鉗，將頂骨后緣掀開頂骨，方向沿正中骨縫向兩側(cè)，即可看到腦組織。對于腦干底側(cè)腦神經(jīng)，需用眼科剪剪斷、之后再將來自顱底三叉神經(jīng)和視神經(jīng)剪斷，此時整個腦與顱底結(jié)構(gòu)，都被分離出來，最后將嗅球剝離，取出完整腦。3.5腦組織樣本預(yù)處理樣本預(yù)處理：將50mg的大鼠腦組織樣品放在冰上稱重。加入預(yù)冷的100μL生理鹽水，4℃和30Hz均質(zhì)3min后，將勻漿轉(zhuǎn)移到玻璃管中，加入300μL預(yù)冷的甲醇水（2:1，v/v）去除蛋白質(zhì)，渦旋30s，2500r/min離心15min，取上清轉(zhuǎn)移到干凈的玻璃瓶中冷凍至干燥。干燥提取物在100μL純甲醇中重溶（適當(dāng)超聲），用于UPLC-MS/MS分析。3.6液相色譜和質(zhì)譜的分離條件色譜條件：本方法所用液相是ultimate3000，質(zhì)譜QExactiveplus（Thermo）。色譜柱為C18AQUITYTM（2.1mm×100mm,1.7μm,Waters），柱溫35℃。流動相組成為流動相A和流動相B，它們分別為：98%乙腈水溶液，其含10mM甲酸銨，80%乙腈溶液，其含10mM甲酸銨。初始流動相保持1.5min，組成為5%B，隨后，在此時間內(nèi)，將其增加至45%B，接著在8min內(nèi)，將45%B增至75%B，在隨的后0.5min內(nèi)，增至97%B，保持2min，回歸初始流動相并平衡2.5min。流速為0.26mL/min。質(zhì)譜條件：采用噴射流技術(shù)（Jetstream）的ESI源在正離子模式下進行分析。毛細管電壓和噴嘴電壓分別為4kV和600V；350℃和400℃分別為干燥氣和鞘氣的溫度，8L/min為氣體流速；40psi為霧化氣壓力。4結(jié)果4.1質(zhì)量控制4.1.1質(zhì)控樣本基峰離子流圖（BPC圖）通過結(jié)合正電離模式和負電離模式，繪制了BPC圖。隨著時間的推移，最強峰值BPC圖可以捕獲所有被測試樣本的代謝物，基峰的離子流圖可以測量儀器。如4-1所示，已知顯著峰重疊和峰出現(xiàn)時間在各QC樣品當(dāng)中較好，說明被試樣品的儀器有較好的穩(wěn)定性，數(shù)據(jù)結(jié)論更可靠。圖4-1兩種模式下假手術(shù)組（s-h40）、模型組（s-25）及給藥組（s-40）的腦組織樣本總離子流圖（負離子模式（上圖）、正離子模式（下圖）4.2色譜-質(zhì)譜基峰離子圖分析如圖4-2可見，各組樣本的信號都強，顯著峰也很明顯，在12min內(nèi)（保留時間）（RT)，獲取了分離良好的三組腦組織樣本代謝物，即質(zhì)譜和色譜參數(shù)合適，其準確性適用于本實驗中腦組織樣本的分析。與此同時在相同間隔區(qū)間內(nèi)，不同組間樣品相對峰離子的強度不同，即分出的相同代謝物的含量在不同組間樣品中存在顯著差異，即這三組之間的代謝模式都有所不同。圖4-2假手術(shù)組（s-h40）、模型組（s-25）及給藥組（s-40）腦組織樣本基峰離子圖4.3多元統(tǒng)計分析本研究使用多元統(tǒng)計分析的方式，對Sham組（假手術(shù)組）Model組（模型組）和S組（給藥組）經(jīng)預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進行分析處理。得到PCA分析圖（圖4-3A、圖4-4A、圖4-3B和圖4-4B）。在正、負離子模式下測得的數(shù)據(jù)，由圖4-4A/B可知，在山茱萸干預(yù)之前，Sham組和Model組兩組間隔較開，距離較大，說明兩組間的代謝模式大不相同；由圖4-3A/B可知，山茱萸干預(yù)后，其總體代謝水平逐漸趨于向Sham組水平（正常水平），表明山茱萸對缺血性腦卒中有一定的改善作用，所以缺血性腦卒中組大鼠的代謝模式更接近于Sham組大鼠。建立OPLS-DA模型，主要對象為Sham組與Model組兩組（圖4-4A和圖4-4B）。利用模型參數(shù)R2X,R2Y和Q2，來反映模型的預(yù)測能力，還有擬合程度。良好的評判標(biāo)準為：Q2大于50%。如圖4-4A，在Sham組與Model組中，表示正離子模式時，通過交叉有效性驗證，其平均預(yù)測能力(Q2)達到了51.3%，且大于50%，表明模型具有出色的預(yù)測能力和擬合程度。如圖4-4B，Q2為72%，也大于50%，且超出50%不少，這表明我們的模型在擬合和預(yù)測方面都表現(xiàn)出色。所以可以看出我們作的OPLS-DA模型，其擬合程度和預(yù)測能力經(jīng)驗證均為優(yōu)秀。還需進行置換驗證，得出OPLS-DA模型的置換驗證結(jié)果，如圖4-3C/D、4-4C/D所示。R2回歸線的Y軸截距，理論上應(yīng)≤0.4，Q2回歸線的應(yīng)≤0.0。圖4-4C顯示，在正離子模式下，R2的Y軸截距為0.982，Q2的為-0.089;圖4-4D顯示，在負離子模式下，R2的Y軸截距為0.973，Q2的為-0.327，無論是在哪種離子模式下，Q2的Y軸截距均達到了要求，R2的Y軸截距均沒有達到要求，說明此模型還存在一些問題，有可能是未過度擬合。此外，Sham組與Model組兩組間OPLS-DA模型的得分圖顯示，兩組具有明顯分高，進一步表現(xiàn)出兩者之間的脂質(zhì)代謝差異[11]。(A/B.正離子模式/負離子模式，Sham組、Model組與S組3組間的PCA分析圖；C/D正離子模式/負離子模式，Sham組、Model組與S組間的OPLS-DA模型的置換驗證)圖4-3PCA分析圖及OPLS-DA模型的響應(yīng)排序置換驗證（A/B正離子模式/負離子模式，Sham組、Model組2組間的PCA分析圖；C/D正離子模式/負離子模式，Sham組與Model組間的OPLS-DA模型的置換驗證)圖4-4PCA分析圖及OPLS-DA模型的響應(yīng)排序置換驗證綜上所述，對于假手術(shù)組和給藥組，給藥組顯現(xiàn)出不同的代謝模式，有明顯的不同于其他組的現(xiàn)象。所以，篩選出差異代謝物的關(guān)鍵是分類明顯及組間代謝模式不同。4.4差異代謝物的篩選表4-4列舉了經(jīng)篩選后得出的差異代謝物。如表4-4，共篩選出23個差異代謝物。與模型組相比，與腦卒中相關(guān)的23種顯著差異代謝物含量發(fā)生了顯著變化，經(jīng)過山茱萸干預(yù)后，回調(diào)的代謝物有14種，包括N-乙酰-L-灰分酸(N-Acctyl-L-asparticacid)、PE、溶抗環(huán)血酸（Ascorbicacid)、肌苷（Inosine）、D-（+）-蘋果酸（D-（+）-Malicacid）、L-谷胱甘肽（還原）（L-Glutathione(reduced）、)肌酸（Creatine）、三丙胺（Tripropylamine）、次黃嘌呤（Hypoxanthine）、丁酰胺（Butyramide）、鳥苷（Gutanosine）、鳥嘌呤（Guanine）、硫代嗎啉3-羧酸鹽（Thiomorpholine3-carboxylate）、蘇氨酸(Threonine)。下調(diào)的代謝物有9種，包括壬二酸（Azclaicacid）、?；撬幔═aurine）、L-谷氨酸（L-Glutamicacid）、異煙酰胺（Isonicotinamine）、L-天冬氨酸（L-Asparticacid）、磷酰膽堿（Phosphorylcholine）、七甘醇（HeptacthyleneGlycol）、6-甲氧基-3,4-亞甲基二氧亞氨基苯丙胺（6-Methoxy-3-4-methylenedioxyamphetamine）、六乙二醇（Hexaethyleneglycol）。表4-4差異脂質(zhì)的篩選和鑒定信息4.5差異代謝物的代謝通路使用MctaboAnalyst3.0軟件，對23個差異代謝物進行通路分橋，結(jié)果圖4-5，表明受23個差異代謝物影響最大的代謝通路（影響值>0.10)有丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路（Alanine,aspartateandglutamatcmetabolism)、D-谷氨酰酸和D-葡萄糖酸鹽代謝通路(D-GlutamineandD-glutamatemetaboliam)以及牛磺酸和低?；撬岽x通路(Taurineandhypotaurinemetaboliam)，即對于腦卒中引起的代謝通路異常最相關(guān)的3條代謝途徑[12]。圖4-5差異脂質(zhì)的代謝通路分析氣泡圖5討論在實驗開始之前中，我們建立了MCAO大鼠模型，運用的方法是線栓法。本研究采用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)來探究經(jīng)過山茱萸干預(yù)后的缺血性腦卒中的代謝通路，通過對比假手術(shù)組、模型組、給藥組的功能情況，表明了山茱萸能夠改善因為大鼠缺血性腦卒中引起的神經(jīng)功能缺損癥狀，具有明確的抗腦缺血及神經(jīng)保護作用[14]。因此，以腦組織樣本作為研究目標(biāo)，為了研究給藥后，大鼠代謝是如何改變的以及給予給藥組代謝物的變化，所以我們運用色譜-質(zhì)譜代謝組學(xué)技術(shù)來進一步探究大鼠的代謝途徑，研究顯示，對比假手術(shù)組，給藥組大鼠腦組織樣本中存在顯著的差異性的內(nèi)源性代謝物共有23種，主要與脂質(zhì)、氨基酸等多種代謝途徑顯著相關(guān)，而給予山茱萸后，給藥組的部分代謝物水平逐漸趨于穩(wěn)定，推測山茱萸可能是通過多環(huán)節(jié)級聯(lián)反應(yīng)來調(diào)節(jié)機體代謝紊亂，而丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路則是對于治療缺血性腦卒中最重要的代謝通路，也再次證實了山茱萸對調(diào)節(jié)腦缺血再灌注損傷的有效性。大量氨基酸類的神經(jīng)遞質(zhì)會因為缺血性腦卒中而積累，其主要發(fā)病機制就是興奮性氨基酸過量，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)是興奮性氨基酸（EAA），具有酸性游離氨基酸，谷氨酸和天冬氨酸也包含在內(nèi)，谷氨酸作為一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最高、分布最廣、作用最強的。然而過量的EAA對神經(jīng)系統(tǒng)具有神經(jīng)毒性作用，即興奮性毒性作用。在灌注損傷一系列的級聯(lián)反應(yīng)過程中，腦細胞血流中斷引起缺血后，氨基酸是變化最顯著的代謝物。Wang等[13]通過代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中急性期患者腦組織中谷氨酸含量明顯升高。腦缺血時，支鏈氨基酸合成谷氨酸途徑增強[14]，賴氨酸分解代謝增加[15]，谷氨酸含量顯著增多，且當(dāng)腦細胞處缺血缺氧狀態(tài)下時，能量供應(yīng)不足，細胞內(nèi)鉀離子外流，使原本處于去極化狀態(tài)的細胞膜去極化，進一步促進了谷氨酸釋放，同時也抑制了谷氨酸的再攝取[16]。過量的谷氨酸生成了抑制性，而給予山茱萸干預(yù)后，谷氨酸含量和天冬氨酸含量顯著下調(diào)，即山茱萸可通過調(diào)節(jié)谷氨酸代謝，減輕神經(jīng)毒性作用，綜上所述，山茱萸通過參與調(diào)節(jié)腦卒中相關(guān)的代謝過程，使得體內(nèi)代謝模式向正常的趨勢發(fā)展，其重要代謝途徑之一是山茱萸改善腦缺血和降低毒性作用。綜上，本實驗探究山茱萸抗腦缺血的腦保護機制的代謝組學(xué)技術(shù)是色譜-質(zhì)譜技術(shù)，通過動態(tài)觀察大鼠腦組織中代謝物的變化，進而尋找代謝模式的改變模式。實驗表明，多種代謝物會因為缺血性腦卒中而產(chǎn)生明顯的變化，我們篩選出N-乙酰-L-灰分酸、PE、溶抗環(huán)血酸、肌苷、D-（+）-蘋果酸、L-谷胱甘肽（還原）肌酸、三丙胺、次黃嘌呤、丁酰胺、鳥苷、鳥嘌呤、硫代嗎啉3-羧酸鹽、蘇氨酸、壬二酸、?；撬?、L-谷氨酸、異煙酰胺、L-天門冬氨酸、6-甲氧基-3,4-亞甲基二氧亞氨基苯丙胺、磷酰膽堿、七甘醇、六乙二醇23種與腦卒中相關(guān)的內(nèi)源性差異代謝物。因此，氨基酸代謝及脂質(zhì)代謝途徑是山茱萸改善腦缺血大鼠模型的神經(jīng)保護作用的重要途徑，具有對抗神經(jīng)毒性、抗炎、改善腦血流等作用，證實了山茱萸多種活性成分、多途徑的整合作用機制，所以山茱萸降低神經(jīng)毒性的作用機制之一可能是通過抑制興奮性氨基酸的釋放，進而抑制缺血性腦卒中。與血清代謝模式不同，腦組織的代謝通路相對較少，造模后有部分大鼠由于腦水腫而死，因此在實驗開始時，我們應(yīng)當(dāng)考慮如何減少腦水腫對大鼠造成的傷害以及如何預(yù)防這種可能性。缺血性腦卒中的發(fā)展過程是由一系列復(fù)雜的機制組成的，這些過程互相影響，形成惡性循環(huán)，上述研究說明山茱萸對于干預(yù)大鼠缺血性腦卒中的具體代謝機制尚不明確，還需進行深入探究。本實驗初步從山茱萸對于如何影響大鼠代謝通路的角度探討了缺血性腦卒中導(dǎo)致的代謝通路紊亂的機制，得知了山茱萸可有效降低神經(jīng)毒性，起到保護作用，對于后續(xù)深入研究山茱萸對于腦缺血性卒中的代謝通路有一定的意義，但是山茱萸發(fā)揮神經(jīng)保護作用的其他具體代謝機制以及具體是什么成分在發(fā)揮主要作用還需要人們再投入更多的實驗以及精力去探索。參考文獻汪戎錦.基于代謝組學(xué)的刺五加葉治療缺血性腦卒中作用機制研究[D]吉林大學(xué),2021,000861.彭斌,吳波.中國急性缺血性腦卒中診治指南2018[J].中華神經(jīng)科雜志,2018,51(9):666-682.DebP.SharmaS.HassanKM.Pathophysiologicmechanismsofacuteischemicstroke:Anoverviewwithemphasisontherapeuticsignificancebeyondthrombolysis[J].Pathophysiology,2010,17(3):197-218.AuA.MetabolomicsandLipidomicofIschemicStroke[J].AdvClinChem,2018,85:31-69.劉蕾，蒙蘭青，歐陽揚，等.代謝組學(xué)在缺血性腦卒中方面應(yīng)用的研究進展[J].右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2021,43(1):117-121.HankeyGJ.Stroke[J].Lancet,2017,389(10069):641-654.趙健元,趙世民．代謝物感知失調(diào)的分子致病機理[J].中國科學(xué)；生命科學(xué)，2016,46(04):392-396.杜文婷,劉萍.代謝組學(xué)及其在心腦血管疾病中的應(yīng)用概況[J]，中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2017,35(10)；2501-2503.江春迎,楊康敏,楊柳,等．金黃地鼠動脈粥樣硬化發(fā)展過程中的nmr代謝組學(xué)研究[J].藥學(xué)學(xué)報,2013,48(04):495-502.李佳欣,陳思琦,葛鵬玲.山茱萸藥理學(xué)研究進展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2022,24(04):63-66.孫芳玲,王文,安宜,等.莫諾苷抑制過氧化氫誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞損傷作用[J].中國藥物與臨床,2008.8(11):843-845.SUNFL.WANGW,ANY