病毒分離鑒定

關(guān)于病毒分離鑒定病毒材料采集與檢驗結(jié)果的關(guān)系采取標本的時期檢查病毒及其成分測定抗體潛伏期及前驅(qū)期剛發(fā)病或急性期恢復期及康復期較難查見最多查見很難查見未增多未增多或增多不明顯明顯增多（常超過4倍）第2頁,共54頁，2024年2月25日，星期天一、標本的處理（一）除菌處理

糞便可加青鏈霉素使最終濃度為10000單位/毫升，置4℃過夜。鼻咽拭子一般加抗生素最終濃度為2000單位/毫升，置4℃作用4小時。對乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、腸道病毒、呼腸孤病毒、腺病毒、痘病毒等，則可加入等量的乙醚4℃過夜除菌。第3頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（二）研磨和稀釋對腦、脊髓等組織標本首先應經(jīng)研磨器或乳缽中充分研磨后，加稀釋液（pH7.6肉湯或10％脫脂牛乳生理鹽水或0.5％水解乳蛋白Hanks液）制成組織懸液，然后經(jīng)2000轉(zhuǎn)／分離心20分鐘。必要時可加抗生素處理（同上）。第4頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

病毒是嚴格的細胞內(nèi)寄生微生物，培養(yǎng)病毒必須使用細胞。根據(jù)病毒的不同選用敏感動物（動物接種）、雞胚（雞胚接種）或離體細胞進行分離培養(yǎng)（細胞培養(yǎng)）。二、病毒的分離培養(yǎng)

第5頁,共54頁，2024年2月25日，星期天(一）動物接種法接種后通常以動物發(fā)病、死亡作為感染的指標。按病毒侵襲部位不同選擇適當?shù)慕臃N途徑。嗜神經(jīng)病毒接種在小鼠的腦內(nèi)。痘苗病毒和單純皰疹病毒接種于家兔角膜。第6頁,共54頁，2024年2月25日，星期天動物接種的優(yōu)缺點：優(yōu)點：（1）不需要復雜的儀器設(shè)備；（2）技術(shù)簡單；（3）易成功缺點：（1）個體差異大（2）價格昂貴（3）數(shù)量有限（4）需要隔離畜舍第7頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（二）雞胚接種1.雞卵的選擇

一般都選新鮮、10天以內(nèi)的受精卵以保證規(guī)格質(zhì)量上的一致。2.孵育

孵育時可將雞卵放入卵箱內(nèi)進行,氣室向上，孵育的最適溫度為38--39℃，相對濕度為40—70％，孵育8日后，雞卵應每天翻動1—2次，以幫助雞胚發(fā)育勻稱和防止雞胚膜粘連。第8頁,共54頁，2024年2月25日，星期天3.檢卵

雞卵孵育4～5天后，即可用檢卵器檢查雞胚發(fā)育情況（二天一次）。（1）未受精雞卵：在檢卵器上僅見到模糊的陰影。（2）活雞卵：雞胚發(fā)育4天后，在檢卵器上就可見到清晰的血管，雞卵內(nèi)有一小黑點（雞胚），有明顯的自然轉(zhuǎn)動。第9頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（3）死胎：如果發(fā)現(xiàn)雞卵血管模糊、擴張、胚胎活動呆滯或不能自主地轉(zhuǎn)動，則可判斷胚胎頻死或已經(jīng)死亡，應將其挑撿出來。

雞胚孵育完畢后，用鉛筆劃出氣室邊緣和胚胎的位置待用。第10頁,共54頁，2024年2月25日，星期天雞胚羊膜腔接種：用12～14天雞胚，將檢材注入羊膜腔，孵育后取羊水檢查（圖7-8）。常用于流感病毒的初次分離。雞胚卵黃囊接種：用5～8天雞胚，以細長針頭由雞卵氣室端刺入卵黃囊。孵育后取獲卵黃囊膜檢查（圖7-7）。常用于某些嗜神經(jīng)病毒的分離。4.接種第11頁,共54頁，2024年2月25日，星期天絨毛尿囊膜接種：用10～l2天雞胚，以無菌手續(xù)在蛋殼上開—小窗，然后將材料滴在絨毛尿囊膜上．孵育后。觀察膜上有無斑點病變(圖7-10)。常用于培養(yǎng)單純皰疹病毒、天花病毒和痘病毒。尿囊腔接種用9～12天雞胚，將標本接種于尿囊腔,孵育后取尿囊液檢查(圖7-9),常用于培養(yǎng)流感病毒和腮腺炎病毒等。第12頁,共54頁，2024年2月25日，星期天5.剖檢及收獲收獲前雞胚應置4℃冰箱過夜，使雞胚內(nèi)血液凝固。收獲時，用碘酒將氣室部卵殼消毒，將氣室處卵殼剝?nèi)ィú灰獙⑺槠淙霘つぃ?。然后用無菌手術(shù)刀柄從胚胎背部輕輕下壓，（切勿壓破卵黃囊）再用吸管吸取尿囊液，置青霉素小瓶內(nèi)，于低溫保存。第13頁,共54頁，2024年2月25日，星期天雞胚接種的優(yōu)缺點：優(yōu)點：技術(shù)簡單、來源充沛、價格低廉、數(shù)量可大、不需特殊設(shè)備。缺點：很多病毒不能適應，主要是哺乳動物的病毒。第14頁,共54頁，2024年2月25日，星期天(三）細胞培養(yǎng)根據(jù)細胞的類型和培養(yǎng)細胞代數(shù)的不同，可將其分為兩種。細胞培養(yǎng)(cellculture)是指利用機械、酶或化學方法使動物組織或傳代細胞分散成單個乃至2～4個細胞團懸液進行培養(yǎng)。

第15頁,共54頁，2024年2月25日，星期天原代細胞培養(yǎng)即從機體內(nèi)取出細胞置試管或瓶內(nèi)生長成單層細胞后，立即接種病毒，可用于產(chǎn)生病毒疫苗.這種原代細胞為二倍體細胞，不能保存和傳代,故而不便用于診斷。常用的有雞胚、豬腎和地鼠腎原代細胞。傳代細胞它是由二倍體細胞或癌細胞突變制成的,染色體數(shù)為非整倍體,細胞隨時可以獲得,生長迅速,可無限傳代.第16頁,共54頁，2024年2月25日，星期天細胞培養(yǎng)的方法靜置培養(yǎng)：實驗室常用。細胞懸液裝瓶，5%CO2溫箱靜置培養(yǎng)，細胞沉降并貼附在玻面上生長分裂，最后長成單層。旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)：大規(guī)模生產(chǎn)疫苗。細胞在玻瓶內(nèi)生長時，玻瓶不斷緩慢旋轉(zhuǎn)，細胞貼附于玻瓶四周，長成單層。第17頁,共54頁，2024年2月25日，星期天組織細胞培養(yǎng)的病毒，當出現(xiàn)穩(wěn)定的細胞病變后，就可取培養(yǎng)液或培養(yǎng)液與細胞培養(yǎng)物混和物，細胞培養(yǎng)物中的病毒可采用凍融、超聲波等方法使其釋放出來。

病毒的獲得第18頁,共54頁，2024年2月25日，星期天優(yōu)點：每個細胞生理特性基本一致，對病毒易感性相等；無個體差異，準確性和重復性好；可嚴格執(zhí)行無菌操作；細胞培養(yǎng)本身就能顯示病毒的生長特征；應用空斑技術(shù)可進行病毒的克隆化。

第19頁,共54頁，2024年2月25日，星期天三、病毒鑒定1.形態(tài)學鑒定細胞病變效應（cytopathiceffect，CPE）病毒在細胞內(nèi)增殖后，可引起細胞的不同變化。常見的形態(tài)學改變?nèi)缂毎麍A縮、聚合、溶解或脫落，這些改變稱為細胞病變效應（cytopathiceffect，CPE）。CPE出現(xiàn)的時間也是鑒定病毒的標志之一。

第20頁,共54頁，2024年2月25日，星期天細胞病變正常細胞細胞折光性↑，變圓○，局部→全層，死亡脫落，如：腸道病毒第21頁,共54頁，2024年2月25日，星期天細胞聚集成叢，似葡萄串狀，細胞間常有細絲狀間橋連接，細胞變圓或膨大，如：腺病毒。第22頁,共54頁，2024年2月25日，星期天細胞融合現(xiàn)象病毒感染后導致感染細胞及相鄰細胞細胞膜融合的產(chǎn)物，表現(xiàn)為若干細胞的相鄰細胞膜消失，成為多核巨細胞。第23頁,共54頁，2024年2月25日，星期天細胞融合現(xiàn)象第24頁,共54頁，2024年2月25日，星期天包涵體定義：是某些病毒感染細胞產(chǎn)生的特征性的形態(tài)變化，在普通光學顯微鏡下可見胞漿或胞核內(nèi)出現(xiàn)的呈嗜酸性或嗜堿性染色、大小數(shù)量不等的圓形或不規(guī)則形的團塊狀結(jié)構(gòu)，稱為包涵體。第25頁,共54頁，2024年2月25日，星期天包涵體的性質(zhì)病毒成分的蓄積，如狂犬病毒的Negri氏體；大量晶格樣排列的病毒顆粒組成，如腺病毒的包涵體；細胞變性的產(chǎn)物，不含病毒，如皰疹病毒的包涵體。第26頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第27頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第28頁,共54頁，2024年2月25日，星期天胞漿內(nèi)有空泡形成，如：猴病毒SV40、呼腸孤病毒等。第29頁,共54頁，2024年2月25日，星期天感染細胞具有吸附紅細胞的能力感染細胞的培養(yǎng)液中有許多游離病毒存在，具有凝集紅細胞的作用2.血吸附和血凝作用多見于以出芽方式釋放的病毒。第30頁,共54頁，2024年2月25日，星期天紅細胞吸附正常細胞（1）血吸附作用吸附試驗可通過特異抗血清抑制來達到鑒定具有吸附特性的病毒。第31頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（2）血凝作用血凝試驗血凝抑制試驗有血凝素（HA）的病毒能凝集人或動物紅細胞，稱為血凝現(xiàn)象，血凝現(xiàn)象能被相應抗體抑制稱為血凝抑制試驗，原理是相應抗體與病毒結(jié)合后，阻止病毒表面HA與紅細胞結(jié)合.第32頁,共54頁，2024年2月25日，星期天四、電子顯微鏡檢查

病毒的很多特征如大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)等必須借助電子顯微鏡進行檢查。對于目前尚難培養(yǎng)而形態(tài)又非常典型的病毒，可直接從感染組織或分泌液，或者接種病料的雞胚和細胞培養(yǎng)收獲的材料作電子顯微鏡檢查，直接觀察病毒粒子。第33頁,共54頁，2024年2月25日，星期天透射電子顯微鏡

第34頁,共54頁，2024年2月25日，星期天1.正染法：超薄切片法取材固定戊二醛四氧化鋨清洗與脫水浸透包埋聚合切片染色鈾染鉛染第35頁,共54頁，2024年2月25日，星期天雞痘病毒（超薄切片）第36頁,共54頁，2024年2月25日，星期天超薄切片法的優(yōu)缺點：優(yōu)點：可觀察病毒形態(tài)和形態(tài)發(fā)生過程缺點：操作復雜，費時，但標本可長時間保存第37頁,共54頁，2024年2月25日，星期天2.負染技術(shù)負染是指通過重金屬鹽在樣品四周的堆積而加強樣品外周的電子密度，使樣品顯示負的反差，襯托出樣品的形態(tài)和大小。銅網(wǎng)樣品

濾紙1-2分鐘后電鏡觀察染液（常用磷鎢酸）第38頁,共54頁，2024年2月25日，星期天口蹄疫病毒的電鏡負染第39頁,共54頁，2024年2月25日，星期天負染法的優(yōu)缺點：優(yōu)點：快速簡易（10-20min）；分辨率高；圖象清晰地病毒結(jié)構(gòu)缺點：敏感性低，要求病毒量在107以上；所有樣品應處于懸浮狀態(tài)第40頁,共54頁，2024年2月25日，星期天免疫電鏡技術(shù)是將抗原抗體反應的特異性與電子顯微鏡的高分辨力相結(jié)合，在亞細胞和超微結(jié)構(gòu)水平上對抗原物質(zhì)進行定位分析的一種高度精確、靈敏的方法。

3.免疫電鏡技術(shù)(Immuneelectronmicroscopy，IEM)第41頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（1）免疫凝集電鏡技術(shù)抗原與抗體凝集反應后，可使標本中病毒顆粒聚集成團，再經(jīng)負染直接在電鏡下觀察，提高了敏感性，確定病毒的血清學性質(zhì)。第42頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（2）免疫電鏡定位技術(shù)特異性抗體用電子致密物質(zhì)，如鐵蛋白、過氧化物酶等標記后，使之與組織超薄切片中的抗原結(jié)合，在電鏡下觀察到標記物所在位置，即為抗原抗體反應的部位。

酶標記染色

第43頁,共54頁，2024年2月25日，星期天五、血清學試驗

是一種常用的診斷病毒病的方法?？刹捎肊LISA、瓊脂擴散、中和試驗、標記抗體技術(shù)等免疫血清學方法檢查病畜的抗體消長情況和發(fā)病組織中的病毒抗原。第44頁,共54頁，2024年2月25日，星期天virus1.中和反應觀察特異性抗體能否保護易感的試驗動物死亡，能否抑制病毒的細胞病變效應。凡能與病毒結(jié)合，使其失去感染力的抗體又稱中和抗體。第45頁,共54頁，2024年2月25日，星期天2.補體結(jié)合反應

AgAb紅細胞溶血素補體AbAg紅細胞補體溶血素溶血（-）不溶血（+）第46頁,共54頁，2024年2月25日，星期天3.免疫擴散

第47頁,共54頁，2024年2月25日，星期天4.酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相裁體上，并保持其免疫活性。測定時，將待檢標本和酶標抗原或抗體按不同