硅納米線表面的蛋白吸附調節(jié)分析研究 功能材料專業(yè)

目錄TOC\o"1-3"\h\u31118摘要 119818Abstract 228604第一章緒論 3154961.1研究背景 3211321.1.1蛋白與表面相互作用 351731.1.2硅納米線的功能 564781.1.3聚合物表面接枝方法 7276991.2課題的提出 919365第二章實驗部分 11268462.1實驗的儀器和藥品 11211732.2.突變體無機焦磷酸酶（PPaseE35C）的獲取 12186582.3DMBD的合成 13242222.4硅納米線的制備及改性 14256852.5重組蛋白的表征及其在改性表面的吸附與脫附測試 14299172.5.1SDS凝膠電泳 14150802.5.2酶活性測定 15112182.5.3蛋白質在硅片表面的吸附與脫附 1521027第三章結果和討論 17280193.1DMBD的合成及表征 17175193.2硅納米線的SEM表征 1724683.3硅接枝表面的聚合物厚度 18196383.4樣品的水接觸角測試 19143033.5蛋白的表征及表面對蛋白吸附測試 19214943.5.1SDS凝膠電泳 19140563.5.2蛋白濃度標準曲線的測定 20144963.5.3表面吸附蛋白質活性測試 21832第四章結論及展望 2214614.1結論 2287724.2展望 2216382參考文獻 2212046致謝 25硅納米線表面的蛋白吸附調節(jié)摘要:蛋白質是生命活動的基礎物質，蛋白質在生物體中無處不在。隨著現(xiàn)代醫(yī)學以及生物學的進步，蛋白質與表面的相互作用也引起了越來越多研究人員的關注?；诘鞍踪|與表面相互作用現(xiàn)象改性的表面也逐漸應用于醫(yī)學以及生物學領域。如固定有聚(N-異丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)的表面可以用于天然與變性蛋白的分離。此外，該表面用于組織培養(yǎng)基底可易于貼壁生長的組織完整脫落，同時關于表界面的研究在藥物控制釋放方面也起著積極作用。本文講述了在硅納米線陣列（SiNWAs）的表面以多巴胺介導用“Graftingfrom”的方法接枝了pH響應性聚合物聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(PDMAEMA)，并用儀器測試對硅納米線陣列表面進行了表征，最后用提純的無機焦磷酸酶的突變體對該表面在不同pH環(huán)境下進行了吸附測試。結果顯示表面接枝聚合物的厚度差異隨時間延長或接枝次數(shù)增加而增加，制得的表面對蛋白活性吸附具有pH響應的特點。這種表面在蛋白質分離以及生物檢測等生物領域有著潛在應用價值。關鍵字：硅納米線陣列、pH刺激響應、表面改性、PDMAEMA

ProteinadsorptionregulationonthesurfaceofsiliconnanowiresAbstract:Proteinisthebasicmaterialoflifeactivities.Andproteinsareubiquitousinorganisms.Withtheadvancementofmodernmedicineandbiology,theinteractionbetweenproteinsandsurfaceshasalsoattractedtheattentionofmoreandmoreresearchers.Basedonthephenomenonofprotein-surfaceinteraction,Surfacesaremodifiedwithallkindsofproperties.Thesesurfaceshavealsobeenusedinmedicineandbiology.Forexample,thesurfaceonwhichPNIPAAmisimmobilizedcanbeusedfortheseparationofnaturalanddenaturedproteins.Inaddition,thissurfacecanbeusedforthesheddingofentiretissuepiecebypiece.Previously,thesetissueattachedtothesurfaceofthesubstratecouldonlybedesorptedbydispersingintocells.Besides,thestudyonthesurfaceinterfaceplaysanactiveroleindrugcontrolledrelease.ThispaperdescribesthatthepH-responsivepolymerPDMAEMAwasgraftedonthesurfaceofsiliconnanowirearrays,usingdopamine-mediated“Graftingfrom”method.Theinstrumentswereusedtocharacterizethesesurfaces.Finally,theproteinsadsorptiontestofthesurfaceindifferentpHenvironmentswascarriedoutwithapurifiedinorganicpyrophosphatasemutant.Theresultsshowedthatthedifferenceinthicknessofthepolymeronthesurfacesenlargedwithtimeorthenumberofgraftsincreases,andtheresultingsurfacehasacharacteristicofpHresponsetoproteinadsorption.Thissurfacehaspotentialapplicationvalueinbiologicalfieldssuchasproteinseparationandbiologicaldetection.Keywords:Siliconnanowirearray,pHstimulationresponse,surfacemodification,PDMAEMA

緒論1.1研究背景1.1.1蛋白與表面相互作用蛋白質和物質表面作用是自然界的一種常見現(xiàn)象。在生物環(huán)境中，生物材料將會與許多不同的成分以及細胞體相互作用。由于大多數(shù)細胞的結構和功能取決于蛋白質的組裝和活動，故而蛋白質是這些成分中和生物表面相互作用最關鍵的成分[1,2]。隨著人們對蛋白質的認識，發(fā)現(xiàn)蛋白質與表面的作用涉及各種分子間作用力（如范德華力、親疏水作用、靜電相互作用、配位鍵合、分子識別等）[3,4]。此外蛋白的吸附作用還受表面形貌以及空間阻力的影響[5]。在蛋白質調控吸附中，我們主要考慮如親疏水作用、靜電作用以及表面形貌對蛋白吸附的影響。蛋白質分子在其空間表面上存在各種疏水的烷基以及親水的羰基。此外因蛋白質還有大量可離子化的氨基、羧基以及其他可離子化的基團，這些基團的離子化將使蛋白質帶上電荷。當溶液環(huán)境pH＞pI（等電點）時，蛋白質帶負電荷，pH＜pI時，蛋白質帶正電荷。由于蛋白質各個基團相互間的靜電作用力是維持其空間結構的重要作用力，而pH變化極容易改變這些基團的電性，這將使得基團間的位置將發(fā)生改變，導致蛋白質的活性空間結構改變。故而通過大范圍的pH變化使蛋白質帶電不適用于活性蛋白分離而適用于實驗檢測。上述的親疏水基團、或帶電的氨基、羧基等基團的空間位置共同形成有特定空間結構的結合位點組。由于結合位點組與蛋白質自身的空間位阻共同構成的空間結構通常復雜具有特殊性。而這一性質可用于蛋白質的特異性識別。就表面疏水性而言，一般認為改性表面的疏水性越強則其非特異性蛋白吸附就越強[6]。如Yuan等人據(jù)此設計了聚氧化乙烯（PEO）/聚乙二醇（PEG）改性的親水性表面。通過降低表面的疏水性來降低其表面蛋白的非特異性吸附。其原理可能是因為鏈壓縮及PEG/PEO的結合水的“屏障”作用加劇了對蛋白質吸附的空間阻力。產(chǎn)生“屏障”作用的原因是親水表面和水結合的趨勢更強，蛋白質與水相比無法在氫鍵的結合競爭中勝出。而這一效應和蛋白質自身的氫鍵作用以及空間結構有關[7,8]。在等電點外的pH環(huán)境中，蛋白質凈電荷不為零。根據(jù)靜電相互作用，可通過改變表面接枝聚合物的電性來調節(jié)蛋白質的吸附。Wan等人利用聚丙烯酸（PAA）在pH=7.4時帶負電荷的性質，在溶液環(huán)境中對帶正電荷的細胞色素蛋白實現(xiàn)了吸附控制[9]。表面對蛋白質吸附的環(huán)境響應調節(jié)就是通過在表面接枝環(huán)境響應性聚合物實現(xiàn)的，這些接枝于表面的聚合物的環(huán)境響應最直接的體現(xiàn)在于聚合物自身的親疏水性、帶電性的改變以及表面鏈形態(tài)改變使得接枝物厚度的改變，進而引起表面浸潤性的改變等。如Okano研究小組利用PNIPAAm改性表面發(fā)展了細胞片組織工程。PNIPAAm是溫度響應性聚合物，其在溫度較低時候受分子鏈內氫鍵作用，PNIPAAm將通過鏈內氫鍵結合大量水使得表面呈現(xiàn)親水性質。而在較高溫度時候分子鏈與水的氫鍵被破壞，分子鏈將脫水呈蜷縮狀態(tài)，這將使得表面變得疏水[10]。圖1.表面和蛋白質的靜電吸附示意圖[13]。同理pH控制的表面是通過在表面接枝pH響應性聚合物來達到上述的親疏水以及聚合物刷帶電性的改變。這種聚合物主鏈上有大量的可離子化基團的聚電解質。通過將這類聚電解質接枝在表面即可實現(xiàn)pH響應[11,12]。如聚4-乙烯吡啶（P4VP）等聚弱堿在低pH時分子鏈內帶有大量正電荷，相同電荷使得分子鏈內靜電排斥，分子鏈呈舒展狀態(tài)。聚甲基丙烯酸（PMAA）這類聚弱酸則是在在高pH時帶負電，鏈呈舒張狀態(tài)。而聚合物鏈的伸展和收縮帶來直觀的改變是接枝厚度的改變，接枝厚度的變化將影響表面的浸潤性等。此外電性的改變都將對自帶電的蛋白質的吸附起著重要作用。如Ionov制備了聚4-乙烯吡啶（P2VP）和聚丙烯酸（PAA）的混合聚合物刷，使得表面具有不同的pH響應性，在高pH時，P2VP能吸引帶負電的蛋白質；pH降低時，帶正電的蛋白質將會被PAA鏈所吸附[13]。圖1.表面和蛋白質的靜電吸附示意圖[13]。蛋白質吸附不僅取決于表面化學性質，還取決于表面的物理形貌[14,15]。已經(jīng)觀察到，不同的形貌或模式可以影響蛋白質吸附的分布或吸附量，并且可以影響隨后的生物學反應，例如細胞粘附和增殖[16]。Yuan等使用天然荷葉作為模板，在PU表面復制荷葉表面獨特的微觀結構[17]。與平面的PU表面相比，具有荷葉狀地形（PUL）的PU表面擁有更大的比表面積，這增強了該表面的疏水性，使得PLU表面能更廣泛地吸附蛋白質。此外，通過在微米/納米尺度上制造生物界面形貌還可以改善血液相容性[18,19]。例如，為了模擬血管的內表面，F(xiàn)an等人開發(fā)了一個多尺度結構的聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面，具有交錯的亞毫米脊和納米突起。血小板粘附分析表明，所得到的表面在流動下表現(xiàn)出良好的血小板抗性[20]。為了增強表面的性質，我們預備在硅納米線陣列的表面進行改性。1.1.2硅納米線的功能圖2.硅納米線在掃描電子顯微鏡下微觀圖。A為俯視圖。B為側視圖[20]。硅納米線陣列是硅晶片表面的一層形貌結構如圖所示[21圖2.硅納米線在掃描電子顯微鏡下微觀圖。A為俯視圖。B為側視圖[20]。硅納米線的制備機理有氣-液-固（VLS）生長機理、氧化誘導生長機理以及腐蝕制備機理。VLS生長機理：是指預見性地根據(jù)硅和金屬催化劑的相圖選取硅和金屬催化劑的共晶點，使硅和金屬催化劑在超高溫度下汽化，然后在相圖的共晶溫度范圍附近生成共晶液滴，使得硅在混合液滴中飽和并不斷析出，由于金屬液滴是納米大小的尺度限制了硅析出直徑，使得析出的硅納米線的直徑也是納米級的。只要能選取合適的金屬催化劑合理的溫度以及氣源即可制備納米級的顆粒或者柱狀物[22]。圖3是硅納米線的生長過程示意圖。圖3.硅納米線的生長過程。A是VLS生長示意圖[22]，B是氧化誘導生長示意圖[23]。氧化誘導生長機理：該機理如圖所示，由圖3.硅納米線的生長過程。A是VLS生長示意圖[22]，B是氧化誘導生長示意圖[23]。Si+SiO2=2SiO(g)2SiO（g）=Si(n-s)+SiO2（s）圖4.化學腐蝕催化劑Ag粒子長大相切示意圖與與硅晶腐蝕生成硅納米線的示意圖[24,25]。二氧化硅在高溫下不斷吸收氣氛中的硅和一氧化硅并在內部生成一氧化硅中間層，即第一步反應，隨著硅的含量增加，在中間層又會發(fā)生第二步反應生成硅。因為晶核尺寸小，晶體生長主要受表面能影響。這圖4.化學腐蝕催化劑Ag粒子長大相切示意圖與與硅晶腐蝕生成硅納米線的示意圖[24,25]。化學腐蝕法制備硅納米線方法中以金屬催化腐蝕的方法為主。Zhu課題組[24,25]用AgNO3作氧化劑，在HF的溶解下制備了硅納米線。其過程是Ag+和硅晶表面接觸后被還原。被還原的Ag沉積在硅表面可以形成原電池結構，成為該反應的催化劑，使得硅晶腐蝕反應更快地進行，被氧化的硅能被HF溶解，這使得該腐蝕可以持續(xù)進行。Ag粒子隨著反應時間的進行不斷地長大并最終和其他的Ag粒子相切。最終形成的孔洞凹陷同樣相切，最后腐蝕較慢的部分“突起”形成硅納米線結構[21]。如圖4所示。硅納米線因其優(yōu)良的電學性質，在研究中不僅常應用于納米電子器件和傳感器領域，還應用于太陽能電池以及熱電轉換材料[26]。此外硅納米具有較好的生物相容性，在生物醫(yī)學方面也逐漸得到重視[27]。在生物傳感器方面，垂直的硅納米線陣列因其優(yōu)良的理化性質以及電學性能可以作為生物傳感器的修飾平臺[28]。更大的表面積和表面反應活性使對目標樣品的濃度探測范圍更大。同時，硅納米線陣列中硅納米線和很多生物大分子的尺寸相當，這使預結合在SiNWAS上的配體分子更快地和靶分子結合并作出響應[29]。此外以VLS策略制備的SiNWAS為基礎制成的場效應晶體管有著對生物、化學分子種類識別范圍更廣的性質。這些晶體管是先將SiNWS制成電極，隨后在SiNWAs上固定生物活性配體。根據(jù)固定的生物配體的種類可以實現(xiàn)蛋白質結合、DNA雜交以及酶反應等。這些反應都可以轉化成電信號用于檢測[30]。此外，根據(jù)表面增強拉曼散射（SERS）的方法還可以制備出探測靈敏度可達單分子的傳感器。如SiNWAS@AgNPs擁有很大的比表面積，這十分有利于其在表面形成用于與樣品分子結合的“熱點”。而這種表面可以用于無免疫標記的SERS探測。該傳感器對小鼠免疫球蛋白G的檢測靈敏度可達50ng[31]，此外該傳感器還可以對分子構象改變轉換成譜圖上特征峰的明顯改變[29]。將SiNWAS@AgNPs用作生物化學電極的時候[32]，其高比表面積和電導率使得其靈敏度更高?？捎糜跈z測磷酸鹽溶液中的牛血清蛋白（BSA）[33]當SiNWAs用作細胞培養(yǎng)時，該表面上的拓撲結構可以誘導哺乳動物形成更多的絲狀偽足用以粘附。而硅納米線會穿過細胞膜而不會使得細胞活性受到明顯的損傷[34]。利用這一性質還可以在納米線上修飾小分子藥物，將表面的納米線用作藥物載體，可以實現(xiàn)細胞水平給藥。而在硅片上利用光刻技術形成特定的硅納米線陣列形貌，這些特定形貌的硅納米線陣列可以誘使哺乳動物細胞微排列[29]。在硅納米線陣列表面修飾DNA受體時還可以對細胞實現(xiàn)無傷害的吸附，然后利用限制性核酸內切酶還可以使細胞無傷脫附[35]。而在硅納米表面修飾一些如PNIPAAm響應性聚合物還可以加強表面對蛋白質或細胞的可逆吸附和脫附[29]。1.1.3聚合物表面接枝方法材料表面接枝方法分為物理方法和化學方法。物理方法有預吸附、聚合物涂層、等離子體沉積等，化學方法主要為“Graftingto”、“Graftingfrom”。通常物理方法操作簡單，但聚合物與表面作用力較弱，這使表面的聚合物層易脫落，導致表面在后續(xù)的使用中性質差異較大。反觀，化學接枝方法相對復雜，但表面和共價錨定的聚合物鏈作用力強，在多次使用后其表面性質保持良好?！癎raftingto”是預合成具有活性端基的聚合物鏈，聚合物鏈與經(jīng)活化的表面通過化學反應相連接。如Cho等人預合成端基為巰基的PNIPAAm，并利用巰基和金表面形成形成Au-S鍵而將PNIPAAm接枝在金表面上[36]。在聚合物鏈和材料表面接枝過程中，聚合物鏈在溶液中不規(guī)則蜷縮呈線團狀，這使得聚合物鏈的活性端被掩埋而使得反應效率較低。此外接枝在材料表面的聚合物也因呈線團狀而使得后續(xù)反應的空間位阻增大而降低表面聚合物的接枝密度[36]?！癎raftingfrom”是將材料表面活化后接枝聚合反應引發(fā)劑，將表面置于單體溶液中并加以引發(fā)條件，最后聚合物單體將在材料表面聚合、生長。由于“Graftingfrom”方法是在表面同一時間生長聚合物，這使得高聚物鏈生長過程中空間位阻較小而已生長的聚合物鏈發(fā)生彎曲的空間位阻較大。因此通過此方法可獲得高密度的接枝聚合物鏈。并且可以通過控制表面引發(fā)劑的密度來控制接枝聚合物鏈的密度[37]。如Wu在聚氨酯表面通過化學反應預接枝含雙鍵的小分子，然后通過引發(fā)自由基聚合接枝了高密度的PNIPAAm[38]。如若聚合鏈合成反應復雜，則應預合成高聚物鏈通過“Graftingto”方法接枝在材料表面上。近年來隨著多巴胺在材料表面修飾的應用使得材料表面改性愈加簡易。一直以來材料表面改性都受限于如何在材料表面產(chǎn)生合適的化學活性位點。而且表面活化方法隨底物材料性質的變化而變化，化學惰性抗粘附的材料更是加劇這一難度[39]。仿生學家發(fā)現(xiàn)海洋貽貝可以不受材料種類的限制牢固地粘附于各種表面[40,41]。進一步研究發(fā)現(xiàn)貽貝在粘附中主要依靠于分泌的一種粘附蛋白。而多巴(DOPA)是粘附蛋白粘附功能中起主要作用的分子[42]。DOPA（如圖所示）含有鄰苯二酚的結構，兩個苯羥基在苯環(huán)大π鍵上的吸電子作用使得1、2號上的碳原子更容易被親核試劑進攻。又因為苯環(huán)上的酚羥基容易被氧化成酮式。DOPA又可以還原劑被親電試劑進攻。此外DOPA還可以與路易斯酸堿發(fā)生靜電作用[43]。在實驗室研究中常用性質相似的多巴胺（Dopamine）代替DOPA。在pH=8.5的三羥基甲基氨基甲烷和鹽酸溶液（Tris-HCl）中環(huán)境中多巴胺的酚羥基極容易被氧化生成多巴胺醌，多巴胺醌再經(jīng)過無色的內環(huán)化中間體，再進一步氧化成粉紅色中間體，經(jīng)重排后生成5,6-二羥基吲哚，最后經(jīng)交聯(lián)、重排生成深褐色的聚多巴胺粘附在表面。這種粘附在表面的聚多巴胺表面仍然具有高活性的端基。鏈端的羥基可以將貴重金屬，如金、銀、鉑等離子還原并使其鍍在聚合物層表面上，此外聚多巴胺還可以與硫醇以及氨基等發(fā)生邁克爾加成以及席夫堿反應[44]。如Wang小組用DOPA-DETC作光引發(fā)劑粘附在金表面，并利用光引發(fā)反應接枝了PNIPAAm[37]。圖圖5.DOPA分子示意圖，及DOPA粘附示意圖[36]。1.2課題的提出隨著醫(yī)療及組織工程等行業(yè)的理論發(fā)展，材料自身的表面性質已很難滿足相關的應用需求。在現(xiàn)代醫(yī)療過程中，蛋白質和表面的相互作用常見于如關節(jié)置換、血管支架、金屬心臟瓣膜、藥物的控制釋放等。在植入體中不合適的表面性質極容易引起不良的組織反應，如致癌、發(fā)炎、免疫排斥、血栓等。表面改性賦予了材料更理想的表面性質。如表面接有肝素的抗血栓支架，用于藥物控制釋放的抗血栓凝膠，對人造的金屬關節(jié)的表面修飾一些生物相容性材料以及添加一些生長因子，可防止周邊組織病變，還有利于組織在表面的愈合貼附。而在組織工程中，一些細胞如皮膚細胞貼壁生長，培養(yǎng)完成后，用酶處理后脫落的組織易分散成細胞懸浮液，這些細胞懸浮液很難用于外科移植。經(jīng)改性的溫敏表面有易于組織脫附，可收集到細胞間粘附形成的組織。表面改性的出現(xiàn)使材料表面的物化性質可以和符合力學要求的基底材料相復合。即將表面聚合物刷和材料主體的復合。使得材料的表面性質更加符合現(xiàn)代生物醫(yī)學的設計應用需求。本文介紹的PDMAEMA型pH響應控制蛋白質吸附與脫附的表面是一種非特異性的蛋白質靜電吸附表面。這種表面可應用于一些蛋白的活性分離。此次設計用金屬溶液腐蝕法在基底材料硅表面生成了具有更高的表面活性硅納米線。并用多巴胺對表面接枝了光引發(fā)劑。并在此基礎上用光聚合的“Graftingfrom”的方法在硅片表面生長出了pH響應的聚合物刷PDMAEMA。然后用橢圓偏振儀、掃描電子顯微鏡等儀器對實驗中的產(chǎn)物或表面進行了表征。并對最終制得的表面進行了蛋白質的吸附和脫附的測試。希望此次設計對利用多巴胺在硅納米線表面接枝PDMAEMA有一定的積極意義。

第二章實驗部分此次設計中使用的突變體無機焦磷酸酶（PPaseE35C）是通過對突變的目標大腸桿菌進行擴增最后提純的蛋白。而在硅納米線表面用于聚合的光引發(fā)劑DMBD(DOPA-DETC)復合體是預合成的。在下面的實驗部分將對這兩個方面作簡單介紹。此外，硅納米線是通過金屬化學腐蝕的方法制備，實驗中利用DMBD作光引發(fā)劑，在紫外光的照射下接枝了PDMAEMA。2.1實驗的儀器和藥品實驗儀器：FA20104電子分析天平（上海恒平科學儀器有限公司），電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司），SG120/750TS/F真空手套箱（蘇州威格設備科技有限公司），KQ-100E型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），IMS-30制冰機（常熟市學科電器有限公司），85-2型恒溫磁力攪拌器（鞏義予華儀器有限責任公司），全溫振蕩培養(yǎng)箱（英國RSBiotech公司），微量移液器（美國Gilson公司），Milli-QBiocel超純水儀、離心超濾管（美國Millipore公司），S-4700掃描電子顯微鏡（SEM），可見光譜儀（美國Thermo公司），高速離心機（德國Hermle公司），空氣恒溫搖床（上海新苗醫(yī)療器械公司），超凈工作臺（蘇州凈化公司），超低溫冰箱((日本Sanyo公司)，透析膜（北京索來寶公司）等。實驗藥品：甲基丙烯酸二甲氨基酯（DMAEMA）（98%）、抑制劑清除劑、溴化亞銅（98%）、檸檬酸三鈉鹽二水合物、鹽酸多巴胺(98%)、4-（氯甲基）苯甲酰氯（97%）、二乙基二硫代氨基甲酸鈉三水合物（95%）等來自美國Sigma-Aldrich公司。蛋白胨、酵母提取物來自英國OXOID公司。瓊脂粉來自北京Solarbio公司。過氧化氫（30%）、甲醇、氫氟酸、硝酸、磷酸二氫鉀、鹽酸、丙酮、硫酸、二甲基甲酰胺（DMF）、氯化鈉、磷酸二氫鈉等其他試劑皆為國藥分析純。2.2.突變體無機焦磷酸酶（PPaseE35C）的獲取目標菌的培養(yǎng)：配置1.2LLB培養(yǎng)液（1%蛋白胨，0.5%酵母粉，0.5%NaCl，pH=7.0）并滅菌。挑選適量的目標菌并用LB培養(yǎng)液于無菌EP管中加入24μL50mg·mL-1Amp及48μL6.25mg·mL-1Tet搖勻，于恒溫搖床中復蘇。復蘇完成后將細菌溶液轉移到1.2L的培養(yǎng)液中加入2.4mL50mg·mL-1Amp及4.8mL6.25mg·mL-1Tet搖勻后，搖床中擴大化培養(yǎng)留樣。加入1mL誘導劑1MIPTG搖勻，搖床中培養(yǎng)，留樣。將細菌液分裝在6個50mLEP管中4℃，6000rpm離心10min。棄去上清液，細菌沉淀于-70℃下保存。目的蛋白的提取和純化：用1mM咪唑、磷酸二氫鈉（Na2H2PO4）緩沖溶液和菌體沉淀制成細菌懸浮液，加入20mg溶菌酶，輕晃EP管使溶菌酶溶解。然后，冰上靜止5min。超聲破碎6min，留樣①。4℃12000rmp離心30min。收集上清液分裝成3管，并留樣②。最后，棄去沉淀。每管上清液加入1mL清洗后的介質，4℃搖晃結合1h。然后4℃700rmp離心3min。留取結合上蛋白的介質，并對該上清液用新的介質再結合，每次用新介質結合，共3次。收集每次的介質，最后將上清液留樣③后棄去。對收集到的9管介質用20mM的咪唑緩沖液清洗，4℃700rmp離心3min棄去上清液。對留取的介質再重復清洗2次以出去雜質蛋白。將清洗后的介質分裝于18個1.5mL的EP管中，每管加入1mL250mM的咪唑緩沖液冰上靜置20min，4℃700rmp離心1min。收集洗脫液并留樣④。用250mM的咪唑緩沖液重復洗脫并收集每次的洗脫液共4次。用無菌過濾器過濾并留樣⑤。超濾純化后留樣⑥。移取純化蛋白到5mLEP管中加純水到5mL，分與3個EP管-20℃保存。2.3DMBD的合成將硼砂（5.80g，15mmol）和水（150mL）加入到圓底燒瓶中，通氮氣30min。轉移至手套箱，先加入多巴胺（2.85g，15mmol）靜置15min。加入碳酸鈉（1.6g，15mmoL），密封。從手套箱中取出，在冰浴、氮氣氛圍下緩慢滴加CMBC（2.2mL，15mmol）。冷卻10min，最后放入手套箱中，室溫攪拌下過夜。濃鹽酸酸化至pH＜2，乙酸乙酯萃?。?5mL*3次），匯集有機相，濃縮后直接用干法上樣過柱（乙酸乙酯/正己烷=1/1）。得到0.93g白色固體產(chǎn)物CMBD（產(chǎn)率20%）。在圓底燒瓶中加入甲醇30mL，鼓氮氣30分鐘后與原料一起運進手套箱。DETC（0.74g，3.3mmol）和CMBD（0.93g，3mmol）各用15mL甲醇溶解。然后將CMBD逐滴加DETC溶液中，室溫反應24h。圖6.DMBD合成流程示意圖。將反應液濃縮后過柱（乙酸乙酯/正己烷=1/1）。最后得到0.857g淺黃色固體產(chǎn)物DMBD（產(chǎn)率74%）。最后對生成的DMBD用核磁共振氫譜表征。圖6.DMBD合成流程示意圖。2.4硅納米線的制備及改性將硅片（厚度0.53mm，單面拋光）切割成0.5cm×0.5cm方片狀備用。將切割好的硅片用丙酮超聲清洗3次（每次2min），再用超純水超聲清洗3次（每次2min），最后用丙酮超聲清洗2min并用N2吹干備用。按下述要求配制反應液和硝酸洗液：反應液：AgNO3(1.53g)，DDW(135mL)，HF(45mL)（避光條件下配制）；硝酸洗液：HNO3（40mL），H2O（80mL）。將清洗后的硅片放置在反應皿中，光面朝上，呈對角線放置。每盒放置約30片，然后在50oC烘箱中預熱0.5h；在烘箱中恒溫條件下，將反應液倒入置有硅片的反應皿中，反應15min；將反應后的廢棄液倒入HF廢液箱中，并迅速加入超純水浸泡，并將浸泡液倒入HF廢液箱中；將硝酸洗液加入反應皿中，待所有硅片沉淀后且溶液澄清后，將廢棄洗液倒入廢酸瓶中；加入超純水，將原光面粗糙呈黑色的硅片取出，未洗凈的繼續(xù)加入硝酸洗液清洗；將處理好的硅片放入烘箱過夜。表面羥基化：將SiNwAs放入Piranha溶液（濃硫酸和雙氧水體積比7:3）中。在溫度為90oC的水浴下浸泡2h，之后用大量去離子水和丙酮清洗，清洗后用氮氣吹干，留樣。接光引發(fā)劑：避光稱量DMBD溶于10mMTrispH=8的緩沖溶液中，并在超聲環(huán)境下充分溶解。配置成濃度為4mg·mL-1。將表面羥基化后的SN浸泡在該溶液中，避光室溫攪拌過夜。用去離子水沖洗并用N2吹干，留樣。表面光引發(fā)聚合DMAEMA：量取2mL的DMAEMA溶液和純化丙酮6mL（比例1：3）倒入接有光引發(fā)劑的SN，并避光鼓入N230min。在紫外燈的照射下光聚合30min。用丙酮浸泡12h，最后用丙酮清洗并用N2吹干留樣，并重復此步驟共接枝3次。每次留樣。最后對樣本用儀器進行測試表征。2.5重組蛋白的表征及其在改性表面的吸附與脫附測試2.5.1SDS凝膠電泳制膠：下膠①，4mL30%Acr/Bis、2.5mL1.5MTris-HClpH=8.8、3.3mL水（加水后搖勻）、0.1mL10%SDS（輕輕搖勻）、0.03mLTEMED、0.03mL10%AP。按上述順序依次加入。所得的溶液混合后注入兩板之間，加入1mL異丙醇壓平，靜置30min，將異丙醇導出，超純水清洗幾次，用濾紙吸干后待加入上膠。下膠②：0.7mL30%Acr/Bis、1.25mL0.5MTris-HClpH=6.8、2.9mL水（搖勻）、0.1mL10%SDS（搖勻）、0.02mLTEMED、0.02mL10%AP。同樣按上述順序依次加入藥品。迅速加入下膠的兩板之間，加滿后插上梳齒，靜置30min。取20μL提純后的目標蛋白于20μL的EP管中，加入5μL的loadingbuffer溶液，于100℃水浴加熱10min，maker煮5min，槽中放入制備好的膠，倒入750mLSDS電泳緩沖液，拔下梳齒，分別點樣至SDS凝膠，接通40V電源，蛋白跑至黑線以下后轉80V電源電泳。待跑出膠時停止電泳，取出膠并用染色液染色2h，再用脫色液脫色，脫色完成后拍照。2.5.2酶活性測定用50μL1MTris-HCl（pH=8.0）、50μL1MMgCl2，加入不同體積的10mMKH2PO4最后用水補至1000μL來配置不同濃度梯度的KH2PO4溶液。分別取100μL個加入0.4MCA，800μLAAM和80μL1MCA混合后測A355。可得活度標準曲線。緩沖蛋白體系：5μL1MTris-HCl（pH=8.0）、5μL1MMgCl2、76μLH2O、10μL蛋白液。AAM溶液：10μL七鉬酸銨：2.5M硫酸:丙酮=1:1:2將4μL的50mMNa4P2O7加入到EP管中，加入96μL緩沖蛋白溶液，30℃加熱10min，加入10μL0.4M的檸檬酸、800μLAAM，搖晃2min，加入80μL1M檸檬酸，取200μL的所得溶液加入96孔板。以水作空白對照，放入酶標儀測A335。將所測值代入標準曲線即得酶活。2.5.3蛋白質在硅片表面的吸附與脫附首先，取10μg·mL-1的蛋白以及90μL相應pH（6.0-10.0）的50mMTris-HCl混合加入到接枝完成的硅片上，吸附半小時。隨后，利用相應pH的Tris-HCl溶液沖洗3次，每次浸泡2min，吸干水分后測活。在吸附好蛋白的片上加入4μLPPi，隨后加入96μL緩沖溶液（86μL水，1M相應pH的Tris-HCl溶液5μL，1MMgCl5μL。水浴30℃下反應10min。之后吸取脫附后的反應液80μL加入8μL0.4M檸檬酸，加入640μLAAM（2.5MH2SO41.5mL七鉬酸銨1.5mL丙酮3mL），搖晃2min后加入64μL1M檸檬酸終止，取200μL測定355nm下的吸收值。

第三章結果和討論3.1DMBD的合成及表征圖7.DMBD的核磁共振氫譜(分子中各基團信號已在圖中標出)。圖7.DMBD的核磁共振氫譜(分子中各基團信號已在圖中標出)。DMBD即DOPA-DETC，是為了將DETC這一聚合物光引發(fā)劑通過DOPA接枝到將要改性的表面上。使得表面可以引發(fā)聚合DMAEMA。按照上述實驗步驟我們先用下述步驟合成了DMBD(DOPA-DETC)這一分子。為了驗證該分子的合成，我們對生成物用核磁共振氫譜表征，結果如圖。Dopa-DETC的1HNMR譜顯示存在屬于二乙基二硫代氨基甲酸芐酯（-C6H4-CH2-S-（C=S）-N（CH2CH3））部分的兒茶酚單元的特征性化學位移（6至7ppm）。這表明DMBD的成功合成。圖8.圖8.掃描電鏡下的硅納米線形貌。圖7：DMBD的1HNMR譜。3.2硅納米線的SEM表征此次試驗的表面結構是通過金屬離子溶液腐蝕的方法在硅片上產(chǎn)生了納米線級的微觀形貌，硅納米線的長度的增加可以通過延長反應時間來實現(xiàn)。圖8是對所制硅片用掃描電子顯微鏡（SEM）對該表面進行形貌表征所得圖像。圖中硅納米線取向相對統(tǒng)一，長度約為5.0μm，同時硅納米線有許多折斷與偏倒，這應該是在對硅納米線清洗過程中硅片重疊、翻覆所致。硅納米線微觀結構大大增加了材料的比表面積，使得硅表面活性增加。利于后續(xù)接枝反應的進行。3.3硅接枝表面的聚合物厚度實驗中我們在硅納米線表面接枝了光引發(fā)劑DMBD，并在此基礎上通過光引發(fā)聚合接枝了PDMAEMA，由于接枝后的表面仍然有許多活性基團可再次引發(fā)DMAEMA的聚合反應，故后續(xù)實驗中又通過再聚合增加了聚合物層的厚度。圖9.橢圓偏振光譜儀下硅納米線的表面的聚合物接枝厚度。最后用橢圓偏振光儀對表面進行了表征，結果如下：接枝DMBD的硅納米線表面僅有約2.5nm的厚度且長度差異較小。第一次接枝的表面厚度約5-6nm之間，厚度浮動較小，第二次接枝表面厚度在7-12nm左右，第三次接枝厚度在13-19nm左右（圖9）。表面接枝物厚度的增加驗證了表面聚合DMAEMA后的表面仍然具有可再次引發(fā)聚合反應的活性端基圖9.橢圓偏振光譜儀下硅納米線的表面的聚合物接枝厚度。圖10.SN（a）和圖10.SN（a）和SN-PDMAEMA（b）的TEM圖像。圖11.表面的水接觸角測試結果。3.4樣品的水接觸角測試圖11.表面的水接觸角測試結果。表面的浸潤性將直接影響蛋白質在表面的蛋白質吸附。如圖11，用金屬化學腐蝕制備的硅納米線陣列的表面經(jīng)羥基化后能與水形成氫鍵，具有超親水的性質，其水接觸角小于5°。而經(jīng)DMBD修飾的表面，其水接觸角有明顯提升。這表明DMBD被成功修飾在表面上了。而對于與修飾相對疏水的PDMAEMA后的表面，其疏水性有了明顯的提升，這表明PDMAEMA的成功修飾，同時也說明了經(jīng)修飾后的表面將更疏水，也更有利于蛋白質在表面上的吸附。而后續(xù)再接枝的SN-PDM-2和SN-PDM-3則表明聚合物的接枝厚度對表面的疏水性影響達到飽和。3.5蛋白的表征及表面對蛋白吸附測試3.5.1SDS凝膠電泳圖12.無機焦磷酸突變體的SDS的凝膠電泳。（M：marker;1：細菌破碎液;2：破碎液上清;3：與介質結合3次后的上清液;4：第一次洗脫液;5：無菌濾膜濾液;6：超濾后的蛋白溶液。）如圖所示21KDa分子量的蛋白質即是目標蛋白—無機焦磷酸酶。細菌破碎液圖12.無機焦磷酸突變體的SDS的凝膠電泳。（M：marker;1：細菌破碎液;2：破碎液上清;3：與介質結合3次后的上清液;4：第一次洗脫液;5：無菌濾膜濾液;6：超濾后的蛋白溶液。）3.5.2蛋白濃度標準曲線的測定Bradford法測蛋白濃度是利用考馬斯藍蛋白質染料，考馬斯藍在游離狀態(tài)時最大光吸收在488nm，與蛋白質結合后為青色，最大吸收值在595nm處。且吸收值和濃度成正比關系，利用此性質可以測蛋白質濃度。作標準曲線如下。圖圖13.蛋白質濃度的標準曲線3.5.3表面吸附蛋白質活性測試圖14.蛋白質在表面上吸附和脫附后的活性(A)，以及相對活性(B)。按照上述實驗步驟，對突變無機焦磷酸酶對硅納米線改性表面進行了吸附測試，并測試器活度，所得結果如下，無機焦磷酸酶在圖14.蛋白質在表面上吸附和脫附后的活性(A)，以及相對活性(B)。BABA第四章結論及展望4.1結論在此次設計中，我們利用化學金屬溶液腐蝕法在硅片表面產(chǎn)生了硅納米線的微觀表面形貌。合成了DMBD，并利用多巴胺介導將DETC光引發(fā)劑接枝到了硅納米線的表面上，并在此基礎上通過光引發(fā)聚合將PDMAEMA接枝到了硅片基底上。提純了無機焦磷酸酶的突變體。最后用SEM、紅外光譜儀等對表面以及產(chǎn)物進行了測試。實現(xiàn)了接枝PDMAEMA的硅納米線陣列對蛋白質吸附的pH響應。4.2展望刺激響應表面隨著生物醫(yī)學工程的發(fā)展將愈發(fā)成熟。在方法，表面改性的方法將趨于統(tǒng)一而多樣化，接枝高效化、流程簡單化。在表面性質方面，高響應、高穩(wěn)定、高靈敏度等性質的特級表面的需求也將越來越大，同時多響應、多功能的表面的需求也將出現(xiàn)。在此次的設計中該表面對蛋白吸附量的調控并未達到理想狀況，吸附效率較低，性質突變較低距離開關程度差距較遠。希望以后有機會能制備出理想的表面。參考文獻NelAE,M?dlerL,VelegolD,etal.Understandingbiophysicochemicalinteractionsatthenano–biointerface[J].NatureMaterials,2009,8(7):543-547.ChenH,YuanL,SongW,etal.Biocompatiblepolymermaterials:Roleofprotein–surfaceinteractions[J].ProgressinPolymerScience,2008,33(11):1059-1087.HladyVV,BuijsJ.Proteinadsorptiononsolidsurfaces[J].CurrentOpinioninBiotechnology,1996,7(1):72-77.TsapikouniTS,MissirlisYF.Protein–materialinteractions:Frommicro-to-nanoscale[J].MaterialsScience&EngineeringB,2008,152(1–3):2-7.LordMS,FossM,BesenbacherF.Influenceofnanoscalesurfacetopographyonproteinadsorptionandcellularresponse[J].NanoToday,2010,5(1):66-78.PrimeKL,WhitesidesGM.Adsorptionofproteinsontosurfacescontainingend-attachedoligo(ethyleneoxide):Amodelsystemusingself-assembledmonolayers[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,1993,115(23):10714-10721.JeonSI,LeeJH,AndradeJD,etal.Protein—surfaceinteractionsinthepresenceofpolyethyleneoxide:I.SimplifiedTheory[J].JournalofColloidandInterfaceScience,1991,142(1):149-158.OstuniE,ChapmanRG,HolmlinRE,etal.Asurveyofstructure?propertyrelationshipsofsurfacesthatresisttheadsorptionofprotein[J].Langmuir,2001,17(18):5605-5620.WanP,ChenY,XingY,etal.Combininghost?guestsystemswithnonfoulingmaterialforthefabricationofabiosurface:Towardnearlycompleteandreversibleresistanceofcytochromec[J].Langmuir,2010,26(15):12515-12517.KikuchiA,OkanoT.Intelligentthermoresponsivepolymericstationaryphasesforaqueouschromatographyofbiologicalcompounds[J].ProgressinPolymerScience,2002,27(6):1165-1193.RüheJ,BallauffM,BiesalskiM,etal.Polyelectrolytebrushes[M]//PolyelectrolyteswithDefinedMolecularArchitectureI.Springer,Berlin,Heidelberg,2004:79-150.BallauffM,BorisovO.Polyelectrolytebrushes[J].CurrentOpinioninColloid&InterfaceScience,2006,11(6):316-323.IonovL,HoubenovN,SidorenkoA,etal.Stimuli-responsivecommandpolymersurfaceforgenerationofproteingradients[J].Biointerphases,2009,4(2):FA45-FA49.SongW,ChenH.Proteinadsorptiononmaterialssurfaceswithnano-topography[J].ChineseScienceBulletin,2007,52(23):3169-3173.HovgaardMB,RechendorffK,ChevallierJ,etal.Fibronectinadsorptionontantalum:theinfluenceofnanoroughness[J].TheJournalofPhysicalChemistryB,2008,112(28):8241-8249.YuanL,YuQ,LiD,etal.Surfacemodificationtocontrolprotein/surfaceinteractions[J].MacromolecularBioscience,2011,11(8):1031-1040.ZhengJ,SongW,HuangH,etal.Proteinadsorptionandcelladhesiononpolyurethane/Pluronic?surfacewithlotusleaf-liketopography[J].ColloidsandSurfacesB:Biointerfaces,2010,77(2):234-239.KohLB,RodriguezI,VenkatramanSS.Theeffectoftopographyofpolymersurfacesonplateletadhesion[J].Biomaterials,2010,31(7):1533-1545.ChenL,LiuM,BaiH,etal.Antiplateletandthermallyresponsivepoly(N-isopropylacrylamide)surfacewithnanoscaletopography[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,2009,131(30):10467-10472.FanH,ChenP,QiR,etal.Greatlyimprovedbloodcompatibilitybymicroscopicmultiscaledesignofsurfacearchitectures[J].Small,2009,5(19):2144-2148.于謙.環(huán)境敏感性材料表面對蛋白質吸附的調控[D].武漢理工大學,2011MoralesAM,LieberCM.Alaserablationmethodforthesynthesisofcrystallinesemiconductornanowires[J].Science,1998,279(5348):208-211.ZhangR,LifshitzY,LeeS.Oxide‐assistedgrowthofsemiconductingnanowires[J].Cheminform,2003,34(24):635-640.PengK.Q,Yan.YJ,GaoSP,etal.Synthesisoflarge‐areasiliconnanowirearraysviaself‐assemblingnanoelectrochemistry[J].AdvancedMaterials,2002,14(16):1164-1167.PengKQ,HuangZP,ZhuJ.Fabricationoflarge-areasiliconnanowirep-njunctiondiodearrays[J].AdvancedMaterials,2004,16:73-76.BoukaiAI,BunimovichY,Tahir-KheliJ,etal.Siliconnanowiresasefficientthermoelectricmaterials[J].Nature,2008,451(7175):168-171.KimW,NgJK,KunitakeME,etal.Interfacingsiliconnanowireswithmammaliancells.[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,2007,129(23):7228-7229.BalasubramanianK.Challengesintheuseof1Dnanostructuresforon-chipbiosensinganddiagnostics:Areview[J].BiosensorsandBioelectronics,2010,26(4):1195-1204.YuQ,LiuH,ChenH.VerticalSiNWAsforbiomedicalandbiotechnologyapplications[J].JournalofMaterialsChemistryB,2014,2(45):7849-7860.PatolskyF,ZhengG,LieberCM.Nanowiresensorsformedicineandthelifesciences[J].Nanomedicine,2006,1(1):51-65.ZhangML,YiC