山竹殼中總氧雜蒽酮提取工藝優(yōu)化及其對氧化損傷修復作用研究

山竹殼中總氧雜蒽酮提取工藝優(yōu)化及其對氧化損傷修復作用研究【摘要】目的：優(yōu)化山竹殼中總氧雜蒽酮的提取工藝，并探究其對氧化損傷的修復作用。方法:采用單因素試驗方法對山竹殼中的總氧雜蒽酮提取工藝進行優(yōu)化，以總氧雜蒽酮含量為指標，確定最佳提取條件；戊唑醇建造氧化損傷模型，評價肝臟中谷胱甘肽的含量作為肝氧化損傷的修復指標；通過電化學分析法測定其腦組織中多巴胺的含量，并采用ImageJ軟件對斑馬魚自發(fā)運動軌跡及運動參數進行分析，作為神經損傷的修復指標。結果：采用單因素優(yōu)化提取條件，得到最佳提取條件為：提取時間為1.5h、料液比為1：60g/mL、提取溫度為50℃、乙醇體積分數為80%；模型組斑馬魚肝組織的GSH含量相較空白組下降34.9%，不同劑量的給藥組相較模型組分別上升12.1%、23.1%和49.8%。此外，相較于空白組，模型組斑馬魚腦組織中多巴胺含量提升8.1%，給藥后，斑馬魚腦組織中多巴胺含量基本恢復至空白組水平。斑馬魚自發(fā)運動軌跡及運動參數恢復至正常水平。結論：總氧雜蒽酮可顯著促進斑馬魚肝臟氧化損傷的修復，并對斑馬魚的神經氧化損傷也具有一定的修復作用?！娟P鍵詞】山竹殼；氧雜蒽酮；提取工藝；氧化應激修復作用；神經毒性修復作用

Optimizationofextractiontechnologyoftotalxanthonefrommangosteenshellanditsrepaireffectonoxidativedamage【Abstract】Objective:Tooptimizetheextractionprocessoftotalxanthonefrommangosteenshellandexploreitsrepairingeffectonoxidativedamage.Methods:Thesingle-factortestmethodwasusedtooptimizetheextractionprocessoftotalxanthoneinmangosteenshell,andthecontentoftotalxanthonewasusedastheindextodeterminetheoptimalextractionconditions.Tebuconazolewasusedasanoxidativedamagemodelinzebrafish,andthecontentofglutathioneintheliverwasevaluatedasanindicatorofliveroxidativedamagerepair.Atthesametime,thedopaminecontentinthebraintissuewasdeterminedbyelectrochemicalanalysis,andthespontaneousmovementtrajectoryandmovementparametersofzebrafishwereanalyzedbyImageJsoftwareasindicatorsofneuraldamagerepair.Results:Afteroptimizingtheextractionconditionsbysinglefactor,theoptimalextractionconditionswere:extractiontimeof1.5h,liquid-to-materialratioof1:60g/mL,extractiontemperatureof50℃,andethanolvolumefractionof80%.Comparedwiththeblankgroup,theGSHcontentinthelivertissueofthemodelgroupzebrafishdecreasedby34.9%,andthedifferentdosesofthedruggroupincreasedby12.1%,23.1%,and49.8%,respectively.Inaddition,comparedwiththeblankgroup,thedopaminecontentinthebraintissueofthemodelgroupzebrafishincreasedby8.1%.Afteradministration,thedopaminecontentinthebraintissueofzebrafishbasicallyreturnedtotheleveloftheblankgroup.Thespontaneousmovementtrajectoryandmovementparametersofzebrafishreturnedtonormallevels.Conclusion:Totalxanthonecansignificantlypromotetherepairofliveroxidativedamageinzebrafishandalsohaveacertainrepairingeffectonneuraloxidativedamageinzebrafish.【Keywords】：MangosteenshellxanthoneExtractiontechnologyOxidativestressrepairNeurotoxicrepaireffect目錄1前言 [27]，在冰水浴下手動研磨5min使組織勻漿化。將勻漿液倒入1.5mL離心管中，2500轉/分，離心10min，取上清液進行測定。取1mL上述步驟制得的腦組織上清液于燒杯中，加入19mL的人工腦組織作為供試品。使用CHI660E電化學工作站，采用飽和甘汞電極參比電極、鉑片對電極、制得的修飾碳纖維電極作為工作電極，使用差分脈沖伏安法（DPV）作為測定方法，在起始電壓為?0.3，終止電壓為0.6V，脈沖振幅為50mV，脈沖寬度為0.2s，脈沖周期為0.5s的條件下測定，記錄峰高，見式(1)。斑馬魚腦組織多巴胺含量=溶液中多巴胺濃度C3.3總氧雜蒽酮對斑馬魚氧化損傷的修復作用取60尾斑馬魚，分為6組放入培養(yǎng)皿中，每組10尾斑馬魚于1.0L溶液，分別稱為空白組、1%DMSO組、模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組?？瞻捉M置于去離子水，DMSO組置于1%DMSO溶液，其余組置于0.5mg/L的戊唑醇溶液中，每2d更換一次水，給毒周期為4d；之后空白組和1%DMSO組重復上述步驟，毒性組置于1%DMSO溶液，其余組分別根據低（10mg/L）、中（25mg/L）、高（50mg/L）劑量給藥（藥物溶于1%DMSO），每2d更換一次水，給藥周期為7d。按照3.3.3的方法，每組取5尾魚測定其運動軌跡及其參數，記錄數據；按照3.3.2和3.3.4的方法測定每組斑馬魚肝組織的谷胱甘肽含量及其腦組織的多巴胺含量，作為氧化損傷修復指標。

4實驗結果與討論4.1山竹殼中總氧雜蒽酮的單因素提取與含量檢測提取時間、料液比、提取溫度和乙醇體積分數對山竹殼中總氧雜蒽酮含量的影響結果如圖2所示。圖(a)表明，山竹殼中的總氧雜蒽酮的含量隨著提取時間的增加而增加，直到1.5h，此時達到最高含量；如圖(b)所示，料液比從1：40增加到1：60（mL/g）導致總氧雜蒽酮含量的顯著增加，繼續(xù)提高料液比對山竹殼總氧雜蒽酮含量無顯著影響，這一觀察結果說明，當溶劑不足時，提取液的濃度過高使固液兩相之間的濃度梯度過小，總氧雜蒽酮無法完全溶出；相反，溶劑過多則會造成資源浪費。圖(c)顯示了提取溫度對山竹殼中總氧雜蒽酮含量的影響，表明隨著提取溫度從30℃增加到50℃，含量相應增加，在50℃達到峰值，超過這個溫度后，總氧雜蒽酮含量隨之明顯下降。圖(d)中的研究結果說明，隨著乙醇體積分數的增加，總氧雜蒽酮含量呈現出先升后降的趨勢。當乙醇的體積分數為80%時，總氧雜蒽酮含量最高；這可能是由于當乙醇的體積分數超過80%時，溶劑極性減少，導致總氧雜蒽酮的溶解度降低。綜合以上因素，確定提取時間為1.5h、料液比1：60g/mL、提取溫度50℃、乙醇體積分數80%為最佳條件。注：a.提取時間影響圖；b.料液比影響圖c.溫度影響圖；d.乙醇體積分數影響圖圖2各種單因素對葡萄籽原花青素含量的影響4.2斑馬魚的氧化損傷模型評價如表3所示，當戊唑醇濃度為0.5mg/L死亡個體為0，致死率為0%，達到非致死濃度，故使用0.5mg/L的戊唑醇進行后續(xù)氧化損傷指標的檢測。表3戊唑醇給藥濃度及其致死率戊唑醇濃度（mg/L）死亡數（尾）致死率（%）0.000%0.500%0.7240%1.0360%2.05100%將空白組與模型組斑馬魚解剖后，按照3.3.2和3.3.4方法檢測，結果如圖3所示。對比可看出模型組斑馬魚肝組織內GSH含量具有極顯著的下降，其多巴胺含量顯著上升，說明建模后斑馬魚具有氧化損傷。注：*與空白組相比，p＜0.05，差異較顯著;***與空白組相比，p<0.001，差異極顯著圖3不同組斑馬魚體內GSH含量與腦組織中DA含量空白組、模型組斑馬魚2min內運動軌跡捕捉和運動參數如圖4-5所示。由運動軌跡可看出，在建模后斑馬魚自發(fā)行為軌跡混亂。模型組的斑馬魚往中央區(qū)域游動，活躍性較高；而空白組則相對安靜，活躍性較低。從靜止時間上分析可知，模型組靜止時間為最短，即其運動最為活躍，空白組則相較靜止時間長，靜止時間對比，空白組與模型組差異較顯著。從移動距離上分析可知，模型組移動距離較長，處于活躍狀態(tài)，與空白組相比，移動距離差異較顯著。結果表明，模型組斑馬魚相較于空白組運動行為顯著增強。綜上說明，0.5mg/L戊唑醇會導致斑馬魚氧化損傷，氧化應激模型建立成功。圖4不同組別斑馬魚自發(fā)行為軌跡注：*與空白組相比，p＜0.05，差異較顯著;**與空白組相比，p<0.01，差異顯著圖5不同組別斑馬魚自發(fā)行為參數谷胱甘肽含量標準曲線：如圖6所示，最佳實驗條件下，GSH的濃度在至0μmol/L-100μmol/L范圍內與OD值呈現良好的線性關系，GSH回歸方程為：y=0.0037x-0.0011，縱坐標為OD值，橫坐標為谷胱甘肽濃度（μmol/L），r=0.9987。圖6GSH標準曲線多巴胺含量標準曲線：如圖7所示，實驗最佳條件下，在pH=8.0的磷酸鹽緩沖溶液中調節(jié)掃描速率為10mv/s，從-0.4v-0.6v之間進行掃描，多巴胺的濃度在至1μg/L-3μg/L范圍內與峰電流呈現良好的線性關系(如圖6)，回歸方程為：y=1.2842x-0.53623，縱坐標為多巴胺濃度，單位為μg/L，橫坐標為峰電流大小，單位為A。相關系數r=0.9956。圖7多巴胺濃度與峰電流關系以及標準曲線4.3總氧雜蒽酮對斑馬魚氧化損傷的的修復作用4.3.1斑馬魚肝組織谷胱甘肽的含量測定將斑馬魚解剖后，將肝組織按照“3.3.3斑馬魚肝臟組織谷胱甘肽的含量測定”方法檢測，由圖8所示，模型組斑馬魚肝組織的GSH質量/肝重量（mg/100g）相較空白組下降34.9%，不同劑量的給藥組相較模型組分別上升12.1%、23.1%和49.8%。結果表明，戊唑醇導致斑馬魚氧化損傷，總氧雜蒽酮會起到對氧化損傷的修復作用。注：**與空白組相比，p<0.01，差異顯著；***與空白組相比，p<0.001，差異極顯著；ns與空白組相比，p>0.05圖8不同組斑馬魚體內谷胱甘肽含量4.4.2斑馬魚的運動行為學觀察空白組、模型組、DMSO組、低劑量組、中劑量組和高劑量組斑馬魚2min內運動軌跡和運動參數如圖9-11所示。模型組的斑馬魚更喜愛中央區(qū)域游動，活躍性較高；而給藥組則相對安靜，活躍性較低。由圖中可知，模型組運動距離最長，且其運動距離顯著高于空白組，給藥組運動距離與空白組無明顯差距；模型組靜止時間最短，顯著低于空白組，而給藥組的靜止時間與空白組相比無明顯差異，說明總氧雜蒽酮對氧化應激有明顯修復作用。結果表明，正常組的斑馬魚活動規(guī)律正常，勻速平緩在觀察孔中游動，模型組斑馬魚運動行為增強，給予總氧雜蒽酮則會使斑馬魚行為恢復。另外，DMSO組與正常組無明顯差異，可以認為溶劑毒性不會影響實驗結果。注：a.空白組；b.模型組；c.DMSO組；d.低劑量組；e.中劑量組；f.高劑量組圖9不同組別斑馬魚自發(fā)行為軌跡注：**與空白組相比，p<0.01，差異顯著；ns與空白組相比，p>0.05圖10不同組別斑馬魚的靜止時間注：*與空白組相比，p＜0.05，差異較顯著；ns與空白組相比，p>0.05圖10不同組別斑馬魚的游動距離4.4.3斑馬魚腦組織多巴胺含量計算將斑馬魚解剖后，將腦組織按照“3.5斑馬魚神經系統(tǒng)的毒性檢測”方法檢測，結果如圖12所示。由數據可知，模型組相較于正常組多巴胺含量的提高8.1%，給藥后多巴胺含量基本恢復至空白組水平。給藥后多巴胺濃度得以恢復，說明給藥可以修復其氧化損傷作用；另外，DMSO組與正常組無明顯差異，可以認為溶劑毒性不會影響實驗結果。注：*與空白組相比，p＜0.05，差異較顯著；ns與空白組相比，p>0.05圖11不同組別斑馬魚腦組織DA含量

5小結本文探究了山竹殼中總氧雜蒽酮的提取工藝優(yōu)化，并考察其對氧化損傷的修復作用。采用單因素法得到山竹殼總氧雜蒽酮的最優(yōu)條件為提取時間為1.5h、料液比1：60g/mL、提取溫度50℃、乙醇體積分數80%為最佳條件?？傃蹼s蒽酮對氧化損傷有顯著的修復作用：給藥組的斑馬魚肝組織中谷胱甘肽含量均低于正常組，高于模型組；斑馬魚腦組織中模型組的多巴胺含量略高于正常組，經過給藥處理后，行為學參數和腦組織中DA含量基本恢復至正常水平。通過優(yōu)化山竹殼總氧雜蒽酮的提取條件，可探索更高效、經濟的提取技術；總氧雜蒽酮通過優(yōu)越的抗氧化作用與神經保護作用實現對氧化損傷的修復，有望作為膳食補充劑應用于器官氧化損傷及阿爾茲海默癥等神經疾病的治療。

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