細(xì)胞培養(yǎng)液的配制

關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)液的配制

培養(yǎng)基的選擇

依據(jù):經(jīng)驗(yàn)、文獻(xiàn)、嘗試常用:RPMI1640、DMEM

培養(yǎng)基的來(lái)源

市售干粉培養(yǎng)基---自己配制液體培養(yǎng)基---直接使用(注意有效期)

第2頁(yè),共27頁(yè)，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基的除菌方法

過(guò)濾除菌:(1)正壓過(guò)濾---效率高

(2)負(fù)壓過(guò)濾---效率低高壓蒸氣滅菌:

不含谷氨酰胺，滅菌后另外添加培養(yǎng)基附加成分的添加

按使用說(shuō)明或?qū)嶒?yàn)要求添加配制時(shí)加:碳酸氫鈉、抗生素、血清等臨用前加:生物活性因子如EGF、FGF、NGF、PDGF等

第3頁(yè),共27頁(yè)，2024年2月25日，星期天RPMI1640培養(yǎng)液配制過(guò)程

準(zhǔn)備物品

(1)不銹鋼過(guò)濾器,濾膜(0.45μm,0.22μm),磁力攪拌器,天平,燒杯,量筒,鹽水瓶

(2)培養(yǎng)粉,1NHCl,NaHCO3,青霉素,鏈霉素,胎牛血清,新鮮三蒸水

消毒物品

濾器中放置0.45μm和0.22μm濾膜,包裝,高壓蒸氣消毒第4頁(yè),共27頁(yè)，2024年2月25日，星期天配制步驟

(1)10.4g/包培養(yǎng)粉溶至1L三蒸水中,磁力攪拌20min(2)加2gNaHCO3/L,繼續(xù)攪拌10min(3)加青霉素100U/mL(80萬(wàn)U溶至4ml三蒸水,取0.5ml)

鏈霉素100U/mL(100萬(wàn)U溶至5ml三蒸水,取0.5ml))(4)加1NHCl約3mL,調(diào)pH至7.2,繼續(xù)攪拌第5頁(yè),共27頁(yè)，2024年2月25日，星期天(5)按要求加血清（血清一般需經(jīng)56℃，30min滅活）例如:10%胎牛血清無(wú)血清培養(yǎng)液900ml

滅活胎牛血清100ml(6)正壓過(guò)濾除菌(氣壓適當(dāng),防止濾膜破裂)(7)分裝,貯存于4℃，2周內(nèi)用完。(8)無(wú)菌試驗(yàn):取樣,37℃放置24－72h,無(wú)細(xì)菌、霉菌污染方可使用第6頁(yè),共27頁(yè)，2024年2月25日，星期天注意事項(xiàng)

谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，４℃，７ｄ分解５０％，放置兩周以上時(shí)，根據(jù)需要添加谷氨酰胺。配制１００×母液（200mmol/L,即29.22g/L）,每100ml加入0.5－2ml母液，終濃度1－4mmol/L抗生素在37℃穩(wěn)定性維持3－4d,可控制輕度污染。防污染重在無(wú)菌操作

第7頁(yè),共27頁(yè)，2024年2月25日，星期天

培養(yǎng)液配制過(guò)程

（以RPMI1640為例）第8頁(yè),共27頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.物品準(zhǔn)備(1）濾器、微孔濾膜、磁力攪拌器、天平、燒杯、量筒、pH計(jì)、貯液瓶等。

第9頁(yè),共27頁(yè)，2024年2月25日，星期天(2)培養(yǎng)粉、NaHCO3、1NHCl、青霉素、鏈霉素、血清、新鮮制備的三蒸水第10頁(yè),共27頁(yè)，2024年2月25日，星期天

2.濾器消毒準(zhǔn)備第11頁(yè),共27頁(yè)，2024年2月25日，星期天取孔徑為0.45μm和0.22μm濾膜各一張，浸入三蒸水中

第12頁(yè),共27頁(yè)，2024年2月25日，星期天將浸濕后的濾膜光面向上依次置于濾器上第13頁(yè),共27頁(yè)，2024年2月25日，星期天將裝有濾膜的濾器包裝后高壓蒸氣消毒第14頁(yè),共27頁(yè)，2024年2月25日，星期天

3.液體配制第15頁(yè),共27頁(yè)，2024年2月25日，星期天①將培養(yǎng)粉倒入容器中第16頁(yè),共27頁(yè)，2024年2月25日，星期天②加入新鮮制備的三蒸水磁力攪拌器充分?jǐn)嚢璧?7頁(yè),共27頁(yè)，2024年2月25日，星期天③按照實(shí)驗(yàn)的具體要求分別加入NaHCO3和青鏈霉素（青霉素100U/mL：80萬(wàn)U溶至4ml三蒸水,取0.5ml；鏈霉素100U/mL：100萬(wàn)U溶至5ml三蒸水,取0.5ml)第18頁(yè),共27頁(yè)，2024年2月25日，星期天④按要求加入一定比例的血清（血清一般需經(jīng)56℃，30min滅活）例如:配制含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液1升，應(yīng)加入無(wú)血清培養(yǎng)液900ml

滅活胎牛血清100ml第19頁(yè),共27頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑤加入1NHCl約3mL,調(diào)整pH至7.2－7.4

第20頁(yè),共27頁(yè)，2024年2月25日，星期天磁力攪拌器充分?jǐn)嚢铚?zhǔn)備過(guò)濾第21頁(yè),共27頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑥無(wú)菌條件下裝好濾器，檢查氣體以及液體管道是否通暢。(一般使用氧氣。注意氣壓適當(dāng),防止濾膜破裂，)第22頁(yè),共27頁(yè)，2024年2月25日，星期天將液體倒入無(wú)菌濾器，接通氣體第23頁(yè),共27頁(yè)，2024年2月25日，星期天

⑦過(guò)濾后的液體分裝于貯液瓶第24頁(yè),共27頁(yè)，2024年2月25日，星期天分裝過(guò)程嚴(yán)格無(wú)菌操作第