酶學(xué)及酶工程

關(guān)于酶學(xué)及酶工程第二章酶的結(jié)構(gòu)與功能第三節(jié)酶的活性部位及催化機(jī)理第2頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、酶的活性部位模型假說(shuō)1.鎖鑰模型假說(shuō)鎖鑰模型假說(shuō)提出了酶作為生物催化劑有一個(gè)重要特點(diǎn)，即實(shí)現(xiàn)催化的必要條件是底物必須在酶上特異性結(jié)合。酶上存在特定的結(jié)合部位，結(jié)合部位與底物之間存在互補(bǔ)的特點(diǎn)，就像鎖和鑰匙的關(guān)系，因而造成酶催化反應(yīng)的很強(qiáng)的專(zhuān)一性。結(jié)合部位是酶的活性中心的組成部分。第3頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天底物在活性部位的結(jié)合力底物和結(jié)合部位有形狀的配合，使底物的原子與結(jié)合部位的原子有盡可能多的接近到范德華半徑內(nèi)。除范德華力，穩(wěn)定底物結(jié)合的力還有離子間引力、氫鍵和疏水作用，側(cè)鏈、輔基和底物之間存在相應(yīng)的配合。按鎖鑰模型假說(shuō)，酶的活性中心空間結(jié)構(gòu)是剛性的。第4頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.誘導(dǎo)契合模型假說(shuō)后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)自由酶的活性部位和底物間并不精確地像鎖鑰匙一般配合，從而提出了誘導(dǎo)契合模型假說(shuō)。該假說(shuō)認(rèn)為，酶與底物結(jié)合時(shí)，結(jié)合力促使酶和底物分別發(fā)生一些構(gòu)象的變化，從而更有利于催化反應(yīng)的發(fā)生。構(gòu)象變化使活性部位和底物達(dá)到精確配合，結(jié)合更緊密，并使催化基團(tuán)處于更有利于催化的位置上。底物形變?cè)斐蓱?yīng)力狀態(tài)會(huì)使發(fā)生反應(yīng)的鍵變?nèi)?，降低反?yīng)的活化自由能，使反應(yīng)速度增加。形變所需的能量則是由結(jié)合能提供的。

第5頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天誘導(dǎo)契合示意圖底物誘導(dǎo)酶活性部位發(fā)生形變，反作用力使底物也相應(yīng)形變，達(dá)到底物和活性部位完全契合。誘導(dǎo)契合模型是目前酶學(xué)界的主流認(rèn)識(shí)。第6頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天誘導(dǎo)契合—鎖鑰新模型探索蚯蚓蛋白酶I有三種蛋白酶活性：凝血酶Th，胰凝乳蛋白酶Ch，尿激酶U。發(fā)現(xiàn)該酶作用Th或Ch底物后，U活性下降。但與U底物作用后不影響Th和Ch活性。而Th和Ch底物剛性，U底物相對(duì)柔性。——R.Panetal.JBC,2010；第7頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天該酶活性部位含有熒光基團(tuán)。測(cè)定表明該酶與Th或Ch底物結(jié)合后內(nèi)源熒光有較大變化，但和U底物結(jié)合后變化不大。用低濃度胍擾動(dòng)該酶活性部位也造成熒光變化，但結(jié)合過(guò)Th或Ch底物后再用胍擾動(dòng)熒光變化不大了。用蚯蚓蛋白酶II、枯草桿菌蛋白酶、乳酸脫氫酶也能得到類(lèi)似的結(jié)果。表明這些酶活性部位有較大構(gòu)象變化后會(huì)維持該構(gòu)象,再作用按鎖鑰模型,形成先誘導(dǎo)契合再鎖鑰的機(jī)制。有無(wú)普遍性還需證明?！獜堊咏。┦空撐?，2013第8頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、活性部位的催化理論1.活性部位的組成按功能，酶的活性部位包含底物結(jié)合部位和催化基團(tuán)兩部分。底物在酶上的結(jié)合可有效地降低反應(yīng)所需的自由能，是酶反應(yīng)的必要基礎(chǔ)。降低反應(yīng)自由能的因素包括鄰近效應(yīng)，定向效應(yīng)和形變效應(yīng)。

催化基團(tuán)實(shí)施具體的催化反應(yīng)。如酸堿催化，共價(jià)催化。第9頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天活性部位的組成成分形成活性部位的組成成分包括主鏈結(jié)構(gòu)，側(cè)鏈基團(tuán)和輔基。主鏈形成活性部位的基礎(chǔ)形狀。側(cè)鏈基團(tuán)完成活性部位的構(gòu)成，是活性部位的主要成分。很多酶還包含金屬或有機(jī)輔基，它們雖不是肽鏈的一部分，但緊密結(jié)合在酶分子中，并實(shí)際參與了活性部位的形成，有的是結(jié)合部位的一部分，有的本身是催化基團(tuán)，還有的能夠傳遞中間產(chǎn)物。第10頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.酶催化的熱力學(xué)原理過(guò)渡態(tài)和活化能化學(xué)反應(yīng)通過(guò)過(guò)渡態(tài)完成，形成過(guò)渡態(tài)需要活化自由能。酶促進(jìn)過(guò)渡態(tài)形成，并和過(guò)渡態(tài)結(jié)合更緊密。因此過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物往往是優(yōu)良的專(zhuān)一性抑制劑。第11頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天活化自由能非催化反應(yīng)的活化能高，反應(yīng)不易進(jìn)行，速度慢。與酶結(jié)合成復(fù)合物時(shí)底物變?yōu)檫^(guò)渡態(tài)，結(jié)合能提供了所需的活化能。由復(fù)合物進(jìn)行反應(yīng)所需要的活化能就少了。酶的催化功能主要是由于降低了反應(yīng)活化能，從而提高了反應(yīng)速度。k=(kbT/h)e–ΔG/RT第12頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶降低活化自由能的方式

ΔG=ΔH–TΔS1）熵因素：底物結(jié)合于酶使其自由度減少，ΔS是負(fù)值而增加系統(tǒng)自由能，據(jù)計(jì)算常溫下反應(yīng)所需活化自由能約一半是熵因素貢獻(xiàn)的。底物在酶上結(jié)合時(shí)，存在臨近效應(yīng)和定向效應(yīng)，使系統(tǒng)自由度減少，因此形成復(fù)合物時(shí)熵減少。活化自由能中的熵因素在此效應(yīng)中實(shí)現(xiàn)，其后進(jìn)行反應(yīng)時(shí)所需的活化自由能就減少了。第13頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)

底物之間及底物對(duì)活性部位的鄰近和定向增加了有序性，減小了自由度，從而降低了系統(tǒng)的熵，而增加了系統(tǒng)的自由能。雙分子反應(yīng)兩個(gè)底物在結(jié)合部位定向結(jié)合并彼此靠近，比溶液中發(fā)生反應(yīng)的可能性高得多，相當(dāng)于大大提高了反應(yīng)物濃度。所有酶反應(yīng)底物和酶之間都有反應(yīng)所需的相互作用，定向和鄰近使反應(yīng)加快。底物結(jié)合時(shí)墑減少所需要的自由能由底物結(jié)合時(shí)放能提供。第14頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天結(jié)合能第15頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)例子羧基和酯基間可反應(yīng)生成酸酐。二羧酸單苯酯的的反應(yīng)比雙分子羧酸和酯的反應(yīng)速度快得多，表現(xiàn)了鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)。第16頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天而羧基和酯之間自由度越少，鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)越強(qiáng)，反應(yīng)速度越快。

作用物反應(yīng)速度第17頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天2）焓因素：形變效應(yīng)誘導(dǎo)契合使底物在活性部位結(jié)合時(shí)出現(xiàn)形變，造成底物分子內(nèi)應(yīng)力，相關(guān)鍵變?nèi)?。?duì)于磷酸酯水解反應(yīng)，有形變應(yīng)力的環(huán)狀磷酸酯水解比無(wú)應(yīng)力的開(kāi)環(huán)磷酸酯快108倍，表現(xiàn)了底物形變對(duì)反應(yīng)速度的影響。第18頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天形變效應(yīng)熱力學(xué)鍵的形變需要吸收一定能量ΔH，自由能增加。所需能量也由底物在酶上的結(jié)合能提供。其后進(jìn)行反應(yīng)時(shí)所需的活化自由能就減少了，這使反應(yīng)速度加快。第19頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、酶催化的化學(xué)機(jī)制1.酸堿催化：酸催化第20頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天堿催化酸堿催化的特點(diǎn)是由廣義酸或堿（質(zhì)子提供者或接受者）啟動(dòng)，催化反應(yīng)通過(guò)質(zhì)子和電子的轉(zhuǎn)移而實(shí)現(xiàn)。酸堿催化可使反應(yīng)速度提高2到5個(gè)數(shù)量級(jí)。第21頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶分子中的質(zhì)子供體和受體

質(zhì)子供體質(zhì)子受體

-COOH-COO--NH3+-NH2-SH-S--OH-O-第22頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.共價(jià)催化催化反應(yīng)中，酶的催化基團(tuán)和底物形成臨時(shí)共價(jià)鍵，使底物被激活為中間態(tài)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)被催化的反應(yīng)而生成產(chǎn)物，同時(shí)酶恢復(fù)游離態(tài)：這種催化機(jī)制稱(chēng)為共價(jià)催化。共價(jià)催化包括親核催化和親電催化。第23頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天親核催化和親電催化如酶分子富含可提供公用電子對(duì)的親核基團(tuán)，如氨基、巰基、羥基、咪唑基等，其提供電子對(duì)給帶部分正電的底物而形成臨時(shí)共價(jià)鍵，這種催化作用就是親核催化。由于酶的側(cè)鏈基團(tuán)大多是親核的，親核催化是共價(jià)催化中的主要形式。如酶分子含有缺少電子的親電基團(tuán)，與富含未公用電子對(duì)的底物形成臨時(shí)共價(jià)鍵而完成催化反應(yīng)的稱(chēng)為親電催化。第24頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天親核催化例第25頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、酶的輔因子很多酶有輔因子，包括和酶牢固結(jié)合的輔基以及不牢固結(jié)合的輔酶。輔因子包括金屬輔因子和有機(jī)輔因子兩類(lèi)。最常見(jiàn)的輔酶包括NAD，NADP，CoA，核苷二磷酸或三磷酸和磷酸吡哆醛等，可以把它們歸于底物一類(lèi)中。而輔基則可以看做是酶的一部分，一般均結(jié)合在活性中心，成為活性中心的組成部分。第26頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.金屬輔因子已知酶中大約有三分之一以上需要金屬離子。含金屬輔基的稱(chēng)為金屬酶。有些酶和金屬離子結(jié)合不緊密，純化時(shí)失去金屬離子，但需加入金屬離子才有活性，稱(chēng)為金屬激活酶。此時(shí)金屬離子應(yīng)是金屬輔酶。

金屬離子參與酶的催化作用的方式有多種：1）接受或提供電子，或做為親電劑或親核劑,或激活親電劑或親核劑；2）通過(guò)配位鍵結(jié)合底物，并引起底物形變；3）保持反應(yīng)基團(tuán)的三維取向，穩(wěn)定酶活性部位于活性構(gòu)象。第27頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天過(guò)渡金屬酶

過(guò)渡金屬酶往往通過(guò)多配價(jià)鍵結(jié)合，結(jié)合很緊密，一般形成金屬酶。較多見(jiàn)的金屬離子包括鋅、銅、鉬、鐵、鈷等。羧肽酶A是一個(gè)典型含鋅金屬酶?；钚灾行挠幸粋€(gè)含鋅而結(jié)合C末端的疏水口袋。

第28頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天羧肽酶AZn2＋位于該酶活性中心，和His69，Glu72，His196以及水以配位鍵結(jié)合。底物C末端與Arg145側(cè)鍵通過(guò)靜電吸引，使底物定位。Zn2＋通過(guò)吸電子作用促進(jìn)肽鍵水解。

第29頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.有機(jī)輔基

生物素可共價(jià)結(jié)合羧基。它通過(guò)酰胺鍵和蛋白質(zhì)的賴(lài)氨酸側(cè)鏈氨基結(jié)合，形成生物素羧基載體蛋白。（BCCP）第30頁(yè),共33頁(yè)，2024年2月25日，星期天乙酰輔酶A羧化酶因BCCP能和羧基鍵合，在羧化反應(yīng)中起重