生物技術(shù)概論基因工程

關(guān)于生物技術(shù)概論基因工程基因片段的獲得、驗(yàn)證和表達(dá)載體構(gòu)建為體外DNA重組，一般認(rèn)為是基因工程的上游技術(shù)；轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化體篩選主要是進(jìn)行目的基因向目標(biāo)生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移、體內(nèi)重組和重組體篩選鑒定，稱為基因工程的下游技術(shù)。

第2頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天目的基因片段獲得克隆載體(空)目的基因克隆載體基因克隆驗(yàn)證切出片段插入片段測(cè)序驗(yàn)證NY表達(dá)載體(空)目的基因表達(dá)載體表達(dá)載體驗(yàn)證N表達(dá)載體構(gòu)建Y基因片段獲得第3頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天Y導(dǎo)入工程菌或病毒直接轉(zhuǎn)化介導(dǎo)生物驗(yàn)證YN生物介導(dǎo)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化目的基因DNA檢測(cè)目的基因RNA檢測(cè)目的Protein檢測(cè)Protein活性檢測(cè)室內(nèi)\田間功能驗(yàn)證受體抗性篩選YNN篩選第4頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、目的基因的獲得

1、目的基因 基因工程中用來(lái)改造生物個(gè)體或用于生產(chǎn)某種產(chǎn)物的有用基因。

2、目的基因獲得方法

（1）化學(xué)合成法：按照預(yù)先設(shè)計(jì)的DNA序列，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)合成目的基因片段的方法。合成方向：3-5

合成長(zhǎng)度：10-500bp

優(yōu)點(diǎn)：目的性強(qiáng)，商業(yè)化程度高、自動(dòng)化程度較高缺點(diǎn)：合成長(zhǎng)度有限，設(shè)備昂貴第5頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法Step1：對(duì)在擔(dān)體上的第一個(gè)堿基進(jìn)行脫保護(hù)（DMTr基）反應(yīng)，用以準(zhǔn)備附加下一個(gè)新的堿基。Step2：活化新的堿基，準(zhǔn)備和前一個(gè)堿基進(jìn)行反應(yīng)。Step3：第二個(gè)堿基附加反應(yīng)到第一個(gè)堿基上。Step4：把第一個(gè)堿基沒(méi)有和第二個(gè)堿基反應(yīng)上的部分（反應(yīng)失敗部分）加帽封死（Capping反應(yīng))，不讓其進(jìn)行進(jìn)一步延伸反應(yīng)。Step5：對(duì)第二個(gè)堿基和第一個(gè)堿基的連接部分進(jìn)行氧化反應(yīng)，使3價(jià)磷變成5價(jià)磷，使合成產(chǎn)物變得更加穩(wěn)定。如需進(jìn)一步合成延伸堿基時(shí)，再回到Step1進(jìn)行合成。如此循環(huán)往復(fù)，可以不斷合成DNA堿基，直至合成完所需序列Step6：從CPG擔(dān)體上用氨水切離合成終了的OligoDNA。第6頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天第7頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）

PCR法：參照已知基因序列，在該基因序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)兩個(gè)引物，用PCR反應(yīng)獲得兩個(gè)引物之間該基因DNA序列的方法。引物來(lái)源：已知基因序列片段獲得：PCR

優(yōu)點(diǎn)：操作容易、目的性強(qiáng)缺點(diǎn)：不能克隆未知基因或序列同源性較差的基因，含內(nèi)含子

第8頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(3)RT-PCR法：參照已知基因序列，在該基因序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)兩個(gè)引物，用PCR反應(yīng)獲得兩個(gè)引物之間該基因編碼序列(mRNA)的方法。

引物來(lái)源：已知基因序列片段獲得：RT-PCR

優(yōu)點(diǎn)：操作容易、目的性強(qiáng)缺點(diǎn)：不能克隆未知基因或序列同源性較差的基因第9頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天（4）基因組文庫(kù)法：將基因組DNA切割成片段后，直接克隆構(gòu)建成基因組文庫(kù)，從基因組文庫(kù)中查找有用克隆的編碼序列的方法。

片段切割：識(shí)別序列為4堿基的限制性內(nèi)切酶克隆載體：病毒、噬菌體、酵母人工染色體優(yōu)點(diǎn)：能夠獲得未知基因，能夠?qū)蚪M所有基因進(jìn)行研究缺點(diǎn):序列含內(nèi)含子,基因通用性較差第10頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天第11頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天

（5）cDNA文庫(kù)法：以生物體內(nèi)mRNA合成cDNA后直接克隆構(gòu)建成cDNA文庫(kù)，從中查找有用基因的方法。片段來(lái)源：mRNA逆轉(zhuǎn)錄克隆載體：質(zhì)粒載體優(yōu)點(diǎn)：便于獲得表達(dá)的基因的序列，獲得得序列為編碼序列無(wú)內(nèi)含子，費(fèi)用較低缺點(diǎn)：無(wú)法獲得未表達(dá)或表達(dá)水平較低基因

第12頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天第13頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天（六）T-DNA標(biāo)簽法（七）mRNA差異顯示法（八）反向克隆法第14頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、目的基因的克隆

在獲得了目的基因片段后，為了便于下一步操作，常需將該片段克隆到克隆載體上，進(jìn)行大量復(fù)制，并驗(yàn)證該片段序列是否正確。

第15頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(一)克隆定義：1．克隆(名詞)：通過(guò)無(wú)性繁殖形成的與其親本一致的生物群體。2．克隆(動(dòng)詞)：生物的無(wú)性繁殖。3.基因克隆：將目的基因片段連接到克隆載體上并進(jìn)行大量復(fù)制的過(guò)程。

第16頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(二)基因克隆步驟1、目的基因片段的獲得：PCR、酶切獲得2、目的基因片段的分離純化：電泳：分離回收：從膠內(nèi)提取、純化并定量。3、目的基因片段與克隆載體連接：平末端連接：平末端酶酶切獲得的或粘末端經(jīng)補(bǔ)平后的片段的連接。粘末端連接：粘末端酶酶切后獲得的片段的連接。

T/A克?。航?jīng)常規(guī)PCR反應(yīng)獲得的片段的連接。4、目的基因片段重組克隆載體篩選驗(yàn)證5、目的基因片段復(fù)制第17頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(三)基因重組克隆篩選

將已經(jīng)連接外源基因的載體(DNA)向受體生物細(xì)胞中導(dǎo)入，從大量的受體中篩選出成功導(dǎo)入目的基因克隆載體的個(gè)體，稱為重組克隆篩選。一般克隆載體的受體生物為大腸桿菌。常用的篩選方法有兩種：

1、抗生素抗性篩選

2、菌落藍(lán)、白斑篩選

第18頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天pUC19第19頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天篩選結(jié)果模式圖第20頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天第21頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(四)載體上插入基因片段的驗(yàn)證1、DNA酶切法

第22頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、PCR法第23頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、DNA測(cè)序法

模板+dNTP+測(cè)序引物+測(cè)序Taq酶ddATPddTTPddGTPddCTP第24頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、目的基因的表達(dá)載體構(gòu)建目的基因片段經(jīng)驗(yàn)證正確后，需構(gòu)建適合于受體生物的基因表達(dá)載體。

表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程就是把目的基因的閱讀框架(編碼序列)插入適宜的表達(dá)載體(空)的啟動(dòng)子、終止子中間，形成表達(dá)框架。表達(dá)框架：?jiǎn)?dòng)子-目的基因的ORF-終止子第25頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、表達(dá)載體的作用：使該基因能夠被導(dǎo)入新的生物體、進(jìn)行自主或整合復(fù)制并在生物體中啟動(dòng)和表達(dá)。

一般情況下有三個(gè)串聯(lián)的表達(dá)框架：-1-2-3-1、啟動(dòng)子-抗性基因的ORF-終止子

2、啟動(dòng)子-目的基因的ORF-終止子

3、啟動(dòng)子-報(bào)告基因的ORF-終止子第26頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天抗性基因：NptII：新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，抗卡那霉素

Hyg:潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因,抗潮霉素

gentR:慶大霉素抗性基因，抗慶大霉素

AmpR:氨芐青霉素抗性基因，抗青霉素類

TETR:四環(huán)素抗性基因,抗四環(huán)素報(bào)告基因：Gus:催化溴取代葡萄糖轉(zhuǎn)化無(wú)色-藍(lán)色反應(yīng)

Gfp:綠色熒光蛋白，合成綠色熒光蛋白

Lac（z）:催化溴取代半乳糖無(wú)色-藍(lán)色轉(zhuǎn)化反應(yīng)常用選擇標(biāo)記(編碼基因):第27頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、生物表達(dá)系統(tǒng)的特異性

不同生物中，啟動(dòng)基因的表達(dá)需要不同的啟動(dòng)子，在原核生物中，需要原核生物啟動(dòng)子和終止子；在植物中，需要適合植物的啟動(dòng)子和終止子。在原核生物中，經(jīng)常使用的啟動(dòng)子有：T3、T7和SP6啟動(dòng)子。在植物中，經(jīng)常使用的啟動(dòng)子有：CaMV35S啟動(dòng)子，胭脂堿合成酶基因終止子。

第28頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、植物表達(dá)載體系統(tǒng)目前常用的植物表達(dá)載體系統(tǒng)有：

1、質(zhì)粒載體系統(tǒng)：

2、病毒載體系統(tǒng)：第29頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天根癌農(nóng)桿菌及其質(zhì)粒第30頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天Ti質(zhì)粒Vir:毒區(qū)，切割、轉(zhuǎn)運(yùn)、侵染區(qū)T-DNA區(qū)：被轉(zhuǎn)移整合到植物的DNA區(qū)域LB:左邊界RB：右邊界第31頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天

把目的基因表達(dá)框架整合到改造后的Ti質(zhì)粒(卸甲質(zhì)粒)的T-DNA區(qū)域形成的質(zhì)粒載體。所有基因轉(zhuǎn)移、基因表達(dá)元件位于同一質(zhì)粒上，稱為一元表達(dá)載體。但這類載體構(gòu)建困難，目的基因整合概率較低。改造Ti質(zhì)粒：取代致瘤和不必要的基因。

1）一元載體系統(tǒng)（整合載體系統(tǒng)）第32頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天Ti質(zhì)粒Vir:區(qū):環(huán)化成輔助質(zhì)粒T-DNA區(qū)：環(huán)化成微型Ti-質(zhì)粒第33頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天

它由微型Ti質(zhì)粒（mini-Tiplasmid）和輔助Ti質(zhì)粒（helperTiplasmid）兩個(gè)獨(dú)立的質(zhì)粒構(gòu)成。輔助質(zhì)粒：提供Vir基因的轉(zhuǎn)移、切割、拼接功能微型Ti質(zhì)粒：含有T-DNA邊界、為一個(gè)廣譜質(zhì)粒，提供用于轉(zhuǎn)移的基因表達(dá)框架。

2）雙元載體系統(tǒng)binaryvector第34頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天第35頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(三)構(gòu)建過(guò)程

1．片段獲得：酶切法

2．表達(dá)載體線性化：酶切法

3、片段分離純化：電泳、條帶回收

4．連接：基因片段和載體DNA定向連接。

第36頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天第37頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(四)表達(dá)載體驗(yàn)證標(biāo)記基因篩選

酶切鑒定法

PCR鑒定法DNA雜交：斑點(diǎn)雜交、菌落原位雜交。(五)工程菌構(gòu)建

表達(dá)載體：直接轉(zhuǎn)化。工程菌構(gòu)建：生物介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。把表達(dá)載體轉(zhuǎn)入介導(dǎo)生物中。第38頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、基因轉(zhuǎn)移把外源DNA導(dǎo)入生物體，使生物體發(fā)生某種變化的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)化(Transformation)。把一種生物的基因?qū)氲搅硗庖粋€(gè)生物體內(nèi)的過(guò)程稱為基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)。第四節(jié)基因工程下游技術(shù)第39頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天（一）植物受體系統(tǒng) 受體:用于接收外源基因片段的生物個(gè)體、細(xì)胞或者組織。

1、植物組織：

2、原生質(zhì)體：

3、生殖細(xì)胞：

第40頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、植物組織： 受傷的細(xì)胞容易受到病毒或質(zhì)粒的感染。這些病毒或質(zhì)粒上的某些DNA通過(guò)各種不同的方式轉(zhuǎn)移到受傷的植物細(xì)胞，并形成愈傷組織。愈傷組織可以培養(yǎng)成完整的轉(zhuǎn)化植株。 該受體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化率高，可獲得較多的轉(zhuǎn)化植株，取材廣泛、適用性廣。但再生植株無(wú)性系變異較大，轉(zhuǎn)化的外源基因穩(wěn)定性差，嵌合體多。

第41頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、原生質(zhì)體：原生質(zhì)體是植物細(xì)胞除去細(xì)胞壁后的部分，是一個(gè)質(zhì)膜包圍的“裸露細(xì)胞”。原生質(zhì)體在合適的條件下具有分化、繁殖并再生成完整植株的能力，具有全能性。原生質(zhì)體比較容易完成一系列細(xì)胞操作或遺傳操作，而且還可以直接高效的捕獲外源基因。嵌合體少，遺傳穩(wěn)定性更差，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，難度大，再生頻率低。第42頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、生殖細(xì)胞：是以植物生殖細(xì)胞如：花粉細(xì)胞、卵細(xì)胞為受體細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)。目前主要以兩個(gè)途徑利用生殖細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化：一是利用花粉細(xì)胞和卵細(xì)胞培養(yǎng)，從而建立單倍體的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；二是直接利用花粉和卵細(xì)胞受精過(guò)程進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化

第43頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天優(yōu)點(diǎn):

一旦將外源基因?qū)脒@些細(xì)胞，可以遺傳，利用植物自身的受粉過(guò)程，具有操作方法方便、簡(jiǎn)單。缺點(diǎn):

不足受到季節(jié)的限制；只能花期進(jìn)行，且無(wú)性繁殖的植物不能采用。

第44頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）直接轉(zhuǎn)化法 直接將純化的攜帶有外源基因的DNA導(dǎo)入生物體的方法。根據(jù)所采用的原理，可以分為：物理轉(zhuǎn)化法、化學(xué)轉(zhuǎn)化法、種質(zhì)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法。

第45頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.物理轉(zhuǎn)化法：通過(guò)物理方法打開(kāi)細(xì)胞屏障(細(xì)胞壁和細(xì)胞膜)，將外源基因直接導(dǎo)入生物體的方法。

(1)電激法(電穿孔法)：

(2)超聲法(超聲穿孔法)：

(3)熱激法：

(4)顯微注射法：

(5)激光法(激光穿孔法)

(6)基因槍法(微彈法)

第46頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(1)電激法(電穿孔法)：細(xì)胞膜在適當(dāng)?shù)耐饧与妷鹤饔孟?，?xì)胞膜被擊穿，細(xì)胞周圍的溶液中的外源DNA分子會(huì)通過(guò)這些孔洞進(jìn)入細(xì)胞中。移去外加電壓后，膜孔在一定時(shí)間內(nèi)可以自動(dòng)修復(fù)，外源基因進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后少數(shù)可能會(huì)整合到染色體上。

第47頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天

利用這一原理，將原生質(zhì)體與外源基因混合置于電激儀的樣品小室中，然后在一定的電壓下進(jìn)行短時(shí)間直流電脈沖，電擊后的原生質(zhì)體被轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基中培養(yǎng)，根據(jù)選擇標(biāo)記篩選帶有標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化子。

超聲穿孔法、熱激法、顯微注射法、激光法原理與此相同第48頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天物理轉(zhuǎn)化法步驟：1、目的基因表達(dá)載體DNA溶液配制2、受體細(xì)胞準(zhǔn)備(原生質(zhì)體制備)3、物理法導(dǎo)致細(xì)胞穿孔4、細(xì)胞恢復(fù)培養(yǎng)和篩選第49頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天第50頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天基因槍法(微彈法)第51頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天第52頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.化學(xué)轉(zhuǎn)化法(1)聚乙二醇(PEG)法

PEG與多聚賴氨酸、多聚鳥(niǎo)氨酸等多聚物和二價(jià)陽(yáng)離子（如Mg2+、Ca2+、Mn2+）及DNA常在原生質(zhì)體表面形成沉淀顆粒，通過(guò)原生質(zhì)體的內(nèi)吸作用而被吸收。利用PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合時(shí)要求原生質(zhì)體具有較高的活力。第53頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(2)脂質(zhì)體法帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物，然后脂質(zhì)體上剩余的電核與細(xì)胞膜上的唾液酸殘基的負(fù)電核結(jié)合；另一種解釋是通過(guò)內(nèi)吞作用而進(jìn)入細(xì)胞。

第54頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.種質(zhì)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法(1)花粉管通道法是我國(guó)科學(xué)家周光宇等首次提出外源DNA導(dǎo)入植物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。其基本原理是授粉后使外源DNA能沿著花粉管滲入，經(jīng)過(guò)珠心通道進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化還不具備正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞第55頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(2)生殖細(xì)胞浸泡法生殖細(xì)胞(種子、胚、胚珠、子房、花粉粒、花藥懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物等)直接浸泡在外源DNA溶液中，利用滲透作用把外源基因?qū)胧荏w并整合和遺傳的方法。(3)胚囊、子房注射法使用顯微注射儀把外源基因溶液注射到子房或胚囊中，由于子房或胚囊中產(chǎn)生的壓力和卵細(xì)胞的吸收使外源DNA進(jìn)入受精的卵細(xì)胞中，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。第56頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）間接轉(zhuǎn)化法(生物轉(zhuǎn)化法)1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

有兩種農(nóng)桿菌:

根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens） 發(fā)根農(nóng)桿菌(A.Rhizogenes)

被廣泛用于植物轉(zhuǎn)基因。原理：農(nóng)桿菌在適宜條件下(酸性,酚類誘導(dǎo)物如乙酰丁香酮)，將其質(zhì)粒T-DNA部分可以轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞并插入到植物基因組中。第57頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.病毒介導(dǎo)法

病毒通過(guò)膜糖蛋白和宿主細(xì)胞表面的受體相互作用或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入宿主細(xì)胞，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成DNA并隨機(jī)整合到宿主基因組中?？山閷?dǎo)轉(zhuǎn)基因的病毒:(1)雙鏈DNA病毒

CaMV花椰菜花葉病毒

DaMV大麗花花葉病毒

CEKV石竹飾刻斑紋病毒

(2)單鏈DNA病毒

(3)單鏈RNA病毒

第58頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天癥狀第59頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天（四）農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法A、整體植株接種共感染法1、原理與方法：該途徑是模仿自然界農(nóng)桿菌天然的轉(zhuǎn)化過(guò)程，人為的在植株上造成創(chuàng)傷部位，然后把攜帶目的基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌接種在創(chuàng)傷面上或植株體內(nèi)，使農(nóng)桿菌在植株內(nèi)進(jìn)行侵染轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，因此也稱為體內(nèi)轉(zhuǎn)化。2、受體材料：無(wú)菌苗、種子實(shí)生苗3、優(yōu)點(diǎn)：試驗(yàn)周期短、具有較高的轉(zhuǎn)化效率、4、缺點(diǎn)：嵌合體多、篩選困難第60頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天B、葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法

1、原理和方法：為了誘導(dǎo)農(nóng)桿菌的侵染活性，把無(wú)菌苗葉片剪切成圓形或方形葉盤(pán)，人為地造成較大的傷口/面積比，葉盤(pán)浸蘸接種農(nóng)桿菌后，與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時(shí)間后，目的基因可經(jīng)農(nóng)桿菌整合到植物染色體上，經(jīng)轉(zhuǎn)接到脫菌培養(yǎng)基上除去農(nóng)桿菌，經(jīng)篩選后可得轉(zhuǎn)化植株。

2、受體材料：無(wú)菌苗葉片。

3、優(yōu)點(diǎn)：適用性廣、重復(fù)性好缺點(diǎn)：部分材料葉盤(pán)再生困難。

第61頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天C、原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法1、原理同上2、受體材料原生質(zhì)體3、優(yōu)點(diǎn)：易轉(zhuǎn)化、無(wú)嵌合體4、缺點(diǎn)：再生困難第62頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天常用植物基因轉(zhuǎn)化方法特點(diǎn)比較評(píng)價(jià)條件農(nóng)桿菌PEG法電擊法注射法基因槍法花粉管通道法受體材料組織、、原生質(zhì)體原生質(zhì)體原生質(zhì)體原生質(zhì)體組織、細(xì)胞卵細(xì)胞寄主范圍有無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)有性繁殖材料組培條件簡(jiǎn)單復(fù)雜復(fù)雜復(fù)雜簡(jiǎn)單不需要轉(zhuǎn)化率1-10%10-5-410-5-410-3-210-3-210%~10嵌合體比例有無(wú)無(wú)無(wú)多無(wú)操作復(fù)雜性簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單復(fù)雜復(fù)雜復(fù)雜簡(jiǎn)單設(shè)備要求簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單昂貴昂貴昂貴簡(jiǎn)單工作效率高低低低高低單子葉植物少可行可行可行廣泛廣泛第63頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天大麥轉(zhuǎn)化示意圖第64頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、轉(zhuǎn)移植株篩選1、抗性篩選2、報(bào)告基因篩選3、DNA檢測(cè)4、RNA檢測(cè)5、蛋白質(zhì)檢測(cè)6、功能檢測(cè)第65頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天第五節(jié)植物轉(zhuǎn)基因改良的應(yīng)用一、抗蟲(chóng)改良1、常用抗蟲(chóng)基因可分為三類:(1)細(xì)菌中分離的抗蟲(chóng)基因,主要是蘇云金桿菌殺蟲(chóng)結(jié)晶蛋白(Bt)基因;(2)植物中分離的抗蟲(chóng)基因,主要為蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因、外源凝集素基因(Lec)等,應(yīng)用最廣泛的是豇豆胰蛋白酶抑制劑基因(CpTI);(3)從昆蟲(chóng)中分離的抗蟲(chóng)基因,主要有蝎毒素基因和蜘蛛毒素基因等。第66頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、殺蟲(chóng)原理(1)BT基因

Bt基因又稱殺蟲(chóng)結(jié)晶蛋白(insecticidalcrystalprotein.ICP)基因,來(lái)自于蘇云金芽孢桿菌,其殺蟲(chóng)毒性來(lái)自芽孢形成過(guò)程中產(chǎn)生的殺蟲(chóng)晶體蛋白(或δ內(nèi)毒素)。原理:破壞昆蟲(chóng)的消化系統(tǒng).這種蛋白通常以原毒素形式存在,當(dāng)昆蟲(chóng)取食后,原毒素在消化道內(nèi)被活化，破壞腸道細(xì)胞膜上的特異性結(jié)合蛋白,使細(xì)胞膜產(chǎn)生一些孔道。

第67頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天

目前常見(jiàn)的bt基因分為7類，共30多個(gè)小類，分別可以抗鱗翅目、膜翅目、雙翅目、鞘翅目害蟲(chóng)以及線蟲(chóng)，有些種類具有多種昆蟲(chóng)抗性。

第68頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天抗蟲(chóng)棉基因的轉(zhuǎn)化過(guò)程第69頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天70由中國(guó)農(nóng)科院生物工程中心開(kāi)發(fā)的Bt棉對(duì)棉鈴蟲(chóng)有顯著的抗性。與對(duì)照相比減少農(nóng)藥用量80％，并減少用工150個(gè)/hm2，以上兩者可使每公頃節(jié)省1500元，Bt轉(zhuǎn)基因棉種深受棉農(nóng)的歡迎。第70頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(2)胰蛋白酶抑制劑基因植物中存在三類蛋白酶抑制劑：

——絲氨酸蛋白酶抑制劑

——巰基蛋白酶抑制劑

——金屬蛋白酶抑制劑。其中絲氨酸蛋白酶抑制劑中的豇豆胰蛋白酶抑制劑基因(CpTI)是目前研究得較為深入且應(yīng)用最為廣泛的基因。

第71頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白酶抑制劑殺蟲(chóng)機(jī)理:

蛋白酶抑制劑與昆蟲(chóng)消化道的蛋白酶相結(jié)合,形成酶-抑制劑復(fù)合物,使酶活性中心失活,從而阻斷或減弱酶的水解作用,干擾昆蟲(chóng)對(duì)外來(lái)蛋白的正常消化,最終造成昆蟲(chóng)非正常發(fā)育或死亡。

第72頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(3)植物凝集素基因(Lec)

植物凝集素是植物體普遍存在的一類保守性很強(qiáng)的非免疫性蛋白,能特異性識(shí)別并可逆地結(jié)合糖蛋白的糖基部分。

——麥胚凝集素(WGA),對(duì)歐洲玉米螟有良好的抗性。——雪蓮花凝集素(GNA)對(duì)蚜蟲(chóng)、葉蟬、稻飛虱等同翅目吸食性害蟲(chóng)有極強(qiáng)的毒性?！愣雇饽?p-Lec)能抑制豇豆象的生長(zhǎng)。第73頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天

作用機(jī)理:

當(dāng)昆蟲(chóng)取食外凝集素后,外源凝集素在昆蟲(chóng)消化道周圍的細(xì)胞膜糖蛋白專一性結(jié)合,從而影響所有營(yíng)養(yǎng)的吸收,達(dá)到抗蟲(chóng)目的。第74頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(4)淀粉酶抑制劑

淀粉酶抑制劑能抑制昆蟲(chóng)消化道內(nèi)α-淀粉酶活性,使食入的淀粉無(wú)法水解,阻斷了昆蟲(chóng)主要能量來(lái)源；它與淀粉酶形成的酶-抑制劑復(fù)合物通過(guò)生理反饋調(diào)節(jié)作用,刺激昆蟲(chóng)分泌過(guò)量的消化酶,產(chǎn)生厭食反應(yīng)。

第75頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(5)昆蟲(chóng)毒素基因昆蟲(chóng)神經(jīng)毒素控制著昆蟲(chóng)許多關(guān)鍵的生理過(guò)程,影響昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)、變態(tài)、生殖、代謝和行為等,近年來(lái),人們已開(kāi)始在基因工程中利用昆蟲(chóng)神經(jīng)毒素防治害蟲(chóng)。目前,蝎毒素和蜘蛛毒素兩種昆蟲(chóng)特異性神經(jīng)毒素已被用于植物抗蟲(chóng)基因工程。

第76頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天

由于每一種抗蟲(chóng)基因都有其局限性,近年來(lái)正在研究或已應(yīng)用于抗蟲(chóng)基因工程的基因還有膽固醇氧化酶基因、營(yíng)養(yǎng)殺蟲(chóng)蛋白基因、幾丁質(zhì)酶基因、核糖體失活蛋白基因和異戊烯轉(zhuǎn)移酶基因等。

第77頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(二)抗真菌病改良1、抗真菌病基因根據(jù)植物的防衛(wèi)機(jī)制和病原菌致病機(jī)理，已知的植物抗真菌病基因主要有以下兩個(gè)方面：一是細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)增強(qiáng)基因，二是生成抗菌物質(zhì)或激活抗菌物質(zhì)活性的基因第一類基因目前應(yīng)用較少，第二類基因已經(jīng)開(kāi)始大量應(yīng)用。

第78頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、主要抗真菌病基因及作用機(jī)理(1)幾丁質(zhì)酶基因植物和微生物中幾丁質(zhì)酶基因編碼的降解幾丁質(zhì)酶。幾丁質(zhì)是植物病原真菌的細(xì)胞壁主要成分之一，幾丁質(zhì)的降解可以導(dǎo)致病原細(xì)胞死亡，也可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)。(2)β-1，3-葡聚糖酶基因

β-1，3-葡聚糖是植物病原真菌的細(xì)胞壁主要成分之一，的降解可以導(dǎo)致病原細(xì)胞死亡，也可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)。

第79頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(3)植物抗毒素基因植物產(chǎn)生的對(duì)病原真菌具有毒性的物質(zhì)，稱為植物抗毒素，編碼此類物質(zhì)合成酶的基因稱為植物抗毒素基因。目前已從不同科屬植物中鑒定了200多種，其中以類黃酮和萜烯類最多。其中的關(guān)鍵酶如苯丙氨酸裂解酶基因(PAL)已經(jīng)克隆。其中芪合成酶基因已從葡萄、花生等植物中克隆并轉(zhuǎn)入煙草中獲得了抗病性植株。

第80頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(4)核糖體抑制蛋白基因(Ribosomeinhibitingprotein,RIP)

核糖體抑制蛋白是來(lái)源于植物能作用于其他遠(yuǎn)緣真核生物核糖體、抑制蛋白質(zhì)合成的蛋白毒素?，F(xiàn)已經(jīng)從大麥中分離了RIP并在體外抑制了真菌的活性。(5)過(guò)氧化物酶基因參與苯丙烷代謝，形成木質(zhì)素、植保素及細(xì)胞壁酚類物質(zhì)。第81頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(三)抗細(xì)菌性病害改良1、抗菌肽基因抗菌肽是一類從動(dòng)物、植物中分離得到的具有抗菌活性并且同源性較高的小分子多肽?？咕挠?0多個(gè)氨基酸擦殘基組成，分子量大約為4kd，殺菌肽具有雙親性的α螺旋結(jié)構(gòu)，是殺菌肽破壞膜活性的關(guān)鍵。殺菌肽具有光譜抗菌性，主要分為A、B、D三種形式，其中A、B特別對(duì)革蘭氏陰性菌有強(qiáng)大的殺傷力2、溶菌酶基因溶菌酶能夠溶解細(xì)菌細(xì)胞外一些多糖之間的糖苷鍵，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞缺乏支撐最后漲破。第82頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、病原菌本身抗性基因病原菌本身參與寄主識(shí)別的基因在寄主相互作用時(shí)其重要，將病原菌的這些基因轉(zhuǎn)入植物中，使其表達(dá)，從而干擾病原菌的正常生理代謝，導(dǎo)致植物表現(xiàn)出抗性。第83頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(四)抗病毒改良

1、CP基因病毒外殼蛋白(coatprotein,CP)基因是病毒編碼外殼蛋白的基因，利用病毒外殼蛋白轉(zhuǎn)基因增強(qiáng)植物抗病毒能力的原理是：病毒的裸露的核酸進(jìn)入植物細(xì)胞后，立即被植物細(xì)胞中的CP包裹，阻止了翻譯和復(fù)制。

CP抑制病毒脫殼。侵染信號(hào)識(shí)別，如發(fā)現(xiàn)CP則不侵染，未發(fā)現(xiàn)則侵染。第84頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、病毒復(fù)制酶基因病毒復(fù)制酶基因在病毒侵入植物后與植物核糖體結(jié)合后轉(zhuǎn)錄并表達(dá)成病毒復(fù)制酶。該基因?qū)胫参锖螅烧T導(dǎo)植物產(chǎn)生病毒抗性。作用原理不明。病毒復(fù)制酶介導(dǎo)的抗性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于外殼蛋白基因介導(dǎo)的的抗性，即使病毒接種量很高，仍然存在抗性。第85頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天

3、病毒衛(wèi)星RNA

病毒中在核苷酸序列外有時(shí)會(huì)出現(xiàn)病毒衛(wèi)星RNA，他們不與核苷酸序列同源，但可以改變病毒的致病能力。優(yōu)點(diǎn)：靈敏，缺點(diǎn)：不確定性，增強(qiáng)或減弱致病性，來(lái)源有限，重組風(fēng)險(xiǎn)、釋放風(fēng)險(xiǎn)第86頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、核糖體抑制蛋白基因核糖體失活蛋白(ribosomeinactiveprotein,RIP)可以抑制病毒蛋白質(zhì)生物合成，使病毒不能合成自身蛋白質(zhì)。核糖體失活蛋白基因可以使植物獲得廣譜性病毒抗性。5、干擾素基因干擾素是脊椎動(dòng)物在受病毒侵染后形成的一種小分子蛋白質(zhì)，能結(jié)合在細(xì)胞膜上形成抗病毒狀態(tài)。原理是干擾素可以抑制病毒與細(xì)胞膜的結(jié)合。第87頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天6、缺陷干擾顆粒缺陷干擾顆粒(defectiveinterfering,DI)是指那些序列與親本病毒相似但必須依賴親本病毒才能復(fù)制的RNA分子。它的序列與病毒同源?？共《驹恚焊?jìng)爭(zhēng)病毒復(fù)制酶。第88頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(五)抗除草劑改良1、各類除草劑的作用機(jī)理(作用的靶酶)(1)草甘膦(glyphosate)抑制芳香族氨基酸合成的關(guān)鍵酶：莽草酸羥基乙烯轉(zhuǎn)移酶(EPSPS)活性。(2)磺酰脲(sulfonylurea)抑制支鏈氨基酸合成的關(guān)鍵酶：乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthase,ALS)活性。(3)草丁膦(phosphinothricin)是有機(jī)磷除草劑，抑制植物谷胱甘肽合成酶(Glutaminesynthase，GS)(4)三嗪除草劑(triazine)抑制光合系統(tǒng)II的Qb蛋白與質(zhì)體醌的結(jié)合，阻斷光合作用。(5)溴苯腈(bromoxyril)抑制光合作用系統(tǒng)的電子傳遞鏈。第89頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、抗除草劑轉(zhuǎn)基因改良策略(1)靶蛋白過(guò)量產(chǎn)生：機(jī)理：產(chǎn)生過(guò)量靶蛋白，使抑制作用有限。舉例：采用超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)基因表達(dá)EPSPS，可以抗草甘磷類除草劑(2)靶蛋白基因突變：機(jī)理：尋找對(duì)除草劑不敏感的植株并克隆其中的靶蛋白編碼基因。但往往導(dǎo)致植物減產(chǎn)。舉例：除草劑選擇法，尋找靶酶EPSPS/ALS/Qb的突變體，進(jìn)行繁殖，或者克隆其中的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因育種。第90頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(3)除草劑降解和解毒基因利用：

——乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因-草丁膦，bar:來(lái)源于鏈霉素的乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因——水解酶基因及其利用：腈水解酶(nitrilase)——超氧化物岐化酶：SOD第91頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(六)抗寒性改良1、抗凍蛋白基因(1)來(lái)源：生物中具有降低冰點(diǎn)和減少冰晶生長(zhǎng)速度的蛋白質(zhì)。其中魚(yú)類研究較多。(2)抗凍機(jī)制：抗凍蛋白可以和冰核結(jié)合，減少冰晶生長(zhǎng)，降低溶液冰點(diǎn)，從而抑制結(jié)冰傷害。2、滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因第92頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天93轉(zhuǎn)基因甜椒轉(zhuǎn)基因辣椒可在冬季生長(zhǎng)(以色列)

第93頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(七)抗旱、抗?jié)掣牧?、脯氨酸合成酶基因

(1)大豆(P5CR)、黑麥

(2)作用機(jī)理：滲透調(diào)節(jié)2、甜菜堿合成相關(guān)酶基因

(1)相關(guān)酶：膽堿加單氧酶(CMO)、甜菜堿醛脫氫酶(BADH)(2)作用機(jī)理：滲透調(diào)節(jié)第94頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、滲調(diào)蛋白基因(1)滲調(diào)蛋白(osmotin，OSM)，植物中普遍存在(2)作用機(jī)理：滲透調(diào)節(jié)4、胚胎后期豐富蛋白(lateralembryoaboundantprotein)基因(1)植物來(lái)源：禾本科植物(2)作用機(jī)理：滲透調(diào)節(jié)5、乙醇脫氫酶基因(1)植物中普遍存在：Adh-1,Adh-2(2)耐澇作用機(jī)理：缺氧ATP合成，解毒第95頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(八)耐貯性改良1、成熟激素相關(guān)基因改良:抑制乙烯產(chǎn)生作用(1)反義ACC合成酶(ACCsynthase)(2)反義ACC氧化酶(ACCoxidase,EthyleneformingEnzyme,EFE)(3)反義乙烯受體(Ethylenereciptor,ER)第96頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天反義RNA技術(shù)AnantisenseoligobindsthesensemRNAand

preventssynthesisoftheproteincodedbythatmRNA第97頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、細(xì)胞壁降解相關(guān)基因改良：抑制細(xì)胞壁降解(1)反義多聚半乳糖醛酸酶基因（PG）：(2)反義果膠裂解酶基因（PL）(3)反義果膠甲脂化酶基因（PE）(4)反義半乳糖苷酶基因(Gal)(5)反義木聚糖內(nèi)基轉(zhuǎn)移酶基因(XET)：(6)反義纖維素酶基因(cellulase)(7)反義聚木糖酶基因(XGase)第98頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、軟化相關(guān)胞內(nèi)物質(zhì)代謝基因(1)反義淀粉酶基因(amylase)(2)反義脂氧合酶基因(LOX)4、抗病性相關(guān)基因(1)PGIP第99頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(九)品質(zhì)改良1、營(yíng)養(yǎng)成分改良(1)貯藏蛋白：小麥醇溶蛋白基因：增加新蛋白質(zhì)(2)脂肪改良：LOX基因：脂肪酸飽和度改變2、風(fēng)味改良(3)甜味蛋白：來(lái)源于甜玉米，改變風(fēng)味３、外觀品質(zhì)改良(4)著色度改良：色素基因工程：花色素第100頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天101轉(zhuǎn)基因西紅柿散發(fā)檸檬香味和玫瑰芳香的轉(zhuǎn)基因西紅柿第101頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天102無(wú)子的轉(zhuǎn)基因茄子(意大利)

第102頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天103第103頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(十)豐產(chǎn)性改良1、RuBP羧化酶Rubisco基因改良：提高二氧化碳的羧化效率，提高光合，進(jìn)而提高產(chǎn)量2、磷酸烯醇式丙酮酸異構(gòu)化酶PEPCase基因改良：提高二氧化碳羧化效率，進(jìn)而提高光合、產(chǎn)量3、磷酸蔗糖合成酶基因改良：促進(jìn)光合產(chǎn)物運(yùn)輸，減少反饋抑制4、ADPG焦磷酸酶基因改良：促進(jìn)運(yùn)輸，減少反饋抑制第104頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(十一)早實(shí)性改良１、lfy基因：縮短童期(植物不能開(kāi)花結(jié)果的階段)(十二)農(nóng)藝性狀改良１、矮化性狀：矮化基因(dw)２、柱形性狀：柱形基因(co)３、短枝性狀：短枝基因(sp)４、生根能力：生根基因(rol)第105頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天第七節(jié)植物性狀分子標(biāo)記及應(yīng)用一、植物的性狀標(biāo)記二、植物性狀的分子標(biāo)記三、植物性狀分子標(biāo)記的方法四、植物性狀分子標(biāo)記的應(yīng)用

第106頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、植物的性狀標(biāo)記

植物的某些遺傳性狀和植物的某一外在形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)、生物大分子特征等存在對(duì)應(yīng)關(guān)系。 當(dāng)這個(gè)特征與這個(gè)遺傳性狀存在較嚴(yán)格的遺傳連鎖關(guān)系時(shí)，這個(gè)特征就是該性狀的遺傳標(biāo)記。第107頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天早熟晚熟綠葉紅葉紅葉是早熟性狀的標(biāo)記第108頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天標(biāo)記分類：1、形態(tài)標(biāo)記：如針葉，氣孔小抗旱性狀的標(biāo)記2、生理生化標(biāo)記：含水量、含糖量3、分子標(biāo)記：與性狀相關(guān)的生物大分子有無(wú) 同工酶標(biāo)記：與性狀相關(guān)的同工酶的有無(wú)

DNA標(biāo)記：有無(wú)某個(gè)特定的DNA片段或序列第109頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、植物的分子標(biāo)記

(一)概念

廣義的分子標(biāo)記(molecularmarker)是指可遺傳的與生物的表性性狀連鎖的可檢測(cè)的DNA序列或蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)標(biāo)記包括:

種子貯藏蛋白 同工酶:催化同一反應(yīng)的不同的酶分子.

狹義的分子標(biāo)記概念只是指DNA標(biāo)記。

第110頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(二)DNA分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)

DNA分子標(biāo)記有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì):1、直接檢測(cè)DNA分子,無(wú)表型效應(yīng),不受組織類別、發(fā)育階段、環(huán)境條件等的影響;2、多態(tài)性強(qiáng);3、源于基因組DNA自身的突變,因而數(shù)量極多;4、與不良性狀無(wú)必然的連鎖遺傳,不影響目標(biāo)性狀的表達(dá);

第111頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）植物分子標(biāo)記的種類

1、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記

(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP),2、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記

(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD),3、DNA指紋標(biāo)記

DNAFingerprint,DNF4、簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記

(simplesequencerepeat,SSR),5、序列特異性擴(kuò)增區(qū)域標(biāo)記

(sequencecharacterizedamplifiedregion,SCAR),6、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記

(amplifiedfragmentlengthpolymorphicDNA,AFLP),.

第112頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、植物性狀分子標(biāo)記方法(一)酶切基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記

1、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記，RFLPRFLP標(biāo)記獲得的原理是用DNA限制性內(nèi)切酶比較具有相對(duì)性狀的兩個(gè)群體在DNA序列上的不同。這個(gè)不同表現(xiàn)為酶切后形成DNA片段的大小不同。因此凡是可以引起酶切位點(diǎn)變異的突變?nèi)琰c(diǎn)突變、DNA的重組如插入和缺失等均可導(dǎo)致RFLP標(biāo)記的產(chǎn)生。

第113頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天

此技術(shù)及其從中發(fā)展出來(lái)的一些變型均包括以下基本步驟：

1、DNA的提取

2、用限制性內(nèi)切酶酶切DNA3、用凝膠電泳分開(kāi)DNA片段

4、查找特異的與目的性狀共分離的DNA片段

5、在分離群體中驗(yàn)證片段與性狀之間的遺傳距離。

第114頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天RFLPR.E.allelesagarosegelAaalleles第115頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天(二)以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記

1、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)

以隨機(jī)引物對(duì)兩個(gè)相對(duì)性狀的基因組DNA進(jìn)行PCR掃描，差別通過(guò)PCR產(chǎn)物條帶的不同(多態(tài)性)體現(xiàn)出來(lái),該多態(tài)性條帶與目的性狀存在連鎖關(guān)系時(shí),該條帶為該性狀的RAPD標(biāo)記。第116頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天RAPD第117頁(yè),共134頁(yè)，2024年2月25日，星期天

對(duì)于任一特定的引物，它在DNA兩條鏈上有特定的結(jié)合位點(diǎn)，如果這些特定的結(jié)合位點(diǎn)的分布符合PCR反應(yīng)的條件，且引物的3‘-端相距在一定的長(zhǎng)度范圍之內(nèi)，就可以擴(kuò)增出來(lái)DNA片段。如果基因組