植物質(zhì)粒的提取以及載體構(gòu)建

關(guān)于植物質(zhì)粒的提取以及載體構(gòu)建一、植物DNA的提取1、目的和意義2、原理3、試劑的準(zhǔn)備4、操作過程5、DNA檢測6、注意事項(xiàng)7、常見問題及解決辦法第2頁,共44頁，2024年2月25日，星期天1、目的和意義:1、抗性苗的檢測2、分子雜交3、分子標(biāo)記4、基因擴(kuò)增第3頁,共44頁，2024年2月25日，星期天2、原理:CTAB（十六烷基三甲基溴化銨hexadyltrimethylammomumbromide）是一種非離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA游離出來。植物材料在

CTAB的處理下，結(jié)合

65℃水浴使細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)變性、DNA被釋放出來。CTAB與核酸形成復(fù)合物，此復(fù)合物在高鹽（>0.7mM）濃度下可溶，并穩(wěn)定存在，但在低鹽濃度（0.1-0.5mMNaCl）下CTAB-核酸復(fù)合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白質(zhì)及多糖等仍溶解于溶液中。經(jīng)離心棄上清后，最后用75%的乙醇清洗沉淀，吹干，溶于TE中。第4頁,共44頁，2024年2月25日，星期天3、試劑的準(zhǔn)備

試劑的全稱：

CTAB：十六烷基三甲基溴化銨EDTA：已二胺四乙酸二鈉PVP:聚乙烯吡咯烷酮。第5頁,共44頁，2024年2月25日，星期天試劑的配制（2×CTAB（100ml））2%CTAB：2g1.4mol/LNaCl:8.19g20mmol/LEDTA:4ml(0.5mol/L母液）100mmol/LTris·Cl(PH8.0):10ml（1mol/L母液）2%PVP:2g2%?-巰基乙醇:2ml第6頁,共44頁，2024年2月25日，星期天試劑的作用Tris-HCl(pH8.0)：提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞CTAB：溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離EDTA：抑制DNase活性β-巰基乙醇：抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐化，使酚類物質(zhì)容易去除PVP：是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。

第7頁,共44頁，2024年2月25日，星期天4、操作過程（小樣法）1、將水浴鍋打開，調(diào)到65度，并將裂解液放到水浴鍋中預(yù)熱；2、挑取1-2g幼嫩的組織放到碾缽中，加入液氮迅速研磨成粉末；3、將粉末迅速轉(zhuǎn)入1.5ml的離心管中，迅速加入裂解緩沖液，混勻，放入65度水浴鍋水浴30min，期間晃動離心管2-3次；4、將離心管取出冷卻至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇（24：1），混勻，靜置10min；第8頁,共44頁，2024年2月25日，星期天5、室溫12000r離心10min，然后將上清轉(zhuǎn)移至干凈的新離心管中再抽提一次；6、將上清轉(zhuǎn)移至干凈的新離心管中，加入2/3體積的異丙醇或2倍體積的無水乙醇，混勻，靜置沉淀30min，10000r離心10min；7、將上清倒掉，倒置離心管使殘液流盡，加入500μ75%酒精，將沉淀搖起來放置5—10min，離心，倒掉酒精，重復(fù)一次；8、倒置離心管使殘液流盡，離心，用槍頭將殘液吸干，吹干，溶于TE(10mMTris-HCl;1mMEDTAPH=8.0)；第9頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

9、加入RNA酶，37度水浴1h或4度放置過夜；10、加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，靜置10min，12000r離心10min；11、將上清轉(zhuǎn)入新的干凈離心管中，加入2倍體積的無水乙醇，混勻，靜置30min，10000r離心10min；12、上清倒掉，用75%的乙醇清洗2次，倒掉酒精，離心，用槍頭吸干殘液，吹干，溶于TE即為可以進(jìn)行分子操作的DNA。第10頁,共44頁，2024年2月25日，星期天分光光度法：DNA在260nm處有最大吸收峰，蛋白質(zhì)在280nm處有最大的吸收峰，鹽和小分子則集中在230nm處。因此，可以用260nm波長進(jìn)行分光測定DNA濃度，OD值為1相當(dāng)于大約50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA。DNA純品的OD260/OD280為1.8，故根據(jù)OD260/OD280的值可以估計DNA的純度。若比值較高說明含有RNA，比值較低說明有殘余蛋白質(zhì)存在。OD230/OD260的比值應(yīng)在0.4-0.5之間，若比值較高說明有殘余的鹽存在。

5、DNA檢測第11頁,共44頁，2024年2月25日，星期天Marker定量法：DNA的紫外檢測通常使用熒光染料溴化乙錠，該物質(zhì)含有一個可以嵌入DNA的堆積堿基之間的平面基團(tuán)，這個基團(tuán)的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致染料與DNA結(jié)合并呈現(xiàn)熒光。根據(jù)Marker的量及其熒光的強(qiáng)弱，可大致對檢測的DNA樣品進(jìn)行定量。使用此法還有一個突出優(yōu)點(diǎn)，即它可令操作者直觀地獲悉所檢測DNA樣品的完整性及其大小。第12頁,共44頁，2024年2月25日，星期天DNA電泳圖第13頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

第14頁,共44頁，2024年2月25日，星期天6、注意事項(xiàng)：1、在整個操作過程中要戴手套；2、使用液氮時要小心，不要濺到皮膚上，因?yàn)橐旱獪囟群艿?，會把皮膚凍壞；3、加試劑時要在通風(fēng)櫥中加，因?yàn)橛行┰噭┚哂袚]發(fā)性，會散發(fā)出難聞的氣味，如巰基乙醇、氯仿等。第15頁,共44頁，2024年2月25日，星期天4、每次吸取上清液時一定要輕柔，否則會吸到下面的液體；5、每次混勻的時候要輕柔，因?yàn)镈NA裂解出來之后用力搖晃的話易使DNA斷裂；6、使用離心機(jī)的時候一定要注意平衡，否則會損壞離心機(jī)。7、每次廢液都要倒到廢液瓶中，不可隨處傾倒。8、一次性手套不可遺棄在通風(fēng)櫥內(nèi)，以免被吸入堵塞通風(fēng)櫥第16頁,共44頁，2024年2月25日，星期天補(bǔ)充：

高質(zhì)量DNA的提取相對于普通提法增加的步湊：1、預(yù)處理2、NH4AC去除多糖3、酚去除蛋白質(zhì)4、高鹽TE去除殘余的多糖第17頁,共44頁，2024年2月25日，星期天二、質(zhì)粒DNA的提取

1、質(zhì)粒的概念：質(zhì)粒是真核細(xì)胞細(xì)胞核外或原核生物擬核區(qū)外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器（主要指線粒體和葉綠體）中和細(xì)菌細(xì)胞擬核區(qū)以外的環(huán)狀DNA分子?，F(xiàn)在習(xí)慣上用來專指細(xì)菌(大腸桿菌）、酵母菌和放線菌等生物中細(xì)胞核或擬核中的DNA以外的DNA分子。第18頁,共44頁，2024年2月25日，星期天2、質(zhì)粒的特點(diǎn)1、質(zhì)粒不是細(xì)菌生長所必需的遺傳物質(zhì)，可自行丟失或人工處理而消除；2、攜帶的遺傳信息能賦予宿主菌某些生物學(xué)性狀，有利于細(xì)菌在特定的環(huán)境下生存；3、能獨(dú)立于染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳；4、常包含編碼對宿主有利的酶的基因；第19頁,共44頁，2024年2月25日，星期天5、天然DNA質(zhì)粒具有3種構(gòu)型：共價閉合環(huán)狀(scDNA)、開環(huán)(ocDNA)和線性(lDNA)構(gòu)型第20頁,共44頁，2024年2月25日，星期天試劑的配置液體I：50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris-Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(Ph8.0)

配制好后高壓滅菌，于4℃冰箱保存液體II：0.4mol/LNaOH2%SDS

溶液II要現(xiàn)用現(xiàn)配，室溫下使用液體III：5mol/L乙酸鉀60.0ml

冰乙酸11.5mlH2O28.5ml配好后高壓滅菌，于4℃冰箱保存，用時置于冰上

第21頁,共44頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)原理加入溶液I使菌體懸浮。加入溶液II后SDS使菌體細(xì)胞壁、細(xì)胞膜破裂，使細(xì)胞內(nèi)核酸釋放出來，同時NaOH處理可破壞DNA堿基配對，使宿主的線狀染色體DNA變性，但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開。加入溶液III后，宿主的線狀染色體DNA未來得急復(fù)性就在冰冷條件下與SDS、蛋白質(zhì)、高分子量RNA纏繞在一起沉淀下來，而質(zhì)粒DNA處于拓?fù)淅p繞狀鏈，迅速得到準(zhǔn)確配對，重新形成完全天然的超螺旋分子，處于溶解狀態(tài)保留在上清中。第22頁,共44頁，2024年2月25日，星期天操作步驟1、挑取單菌落于加有一定濃度的抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，200r/min，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。2、將菌液轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中，10000r離心1min。3、棄上清，將管子倒置于濾紙上，使殘液流盡，加入200μ液體I，于渦旋振蕩器上震蕩，使菌液充分重懸。4、加入新配制好的400μ液體II，蓋緊管子快速顛倒混勻，不可劇烈震蕩，靜置5min。5、加入預(yù)冷的300μ液體III，顛倒離心管數(shù)次，冰浴5min，12000r離心5-10min。6、上清轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇（24：1），混勻，靜置5-10min，12000r離心10min。第23頁,共44頁，2024年2月25日，星期天7、上清移入干凈離心管，加入2/3體積的異丙醇或2倍體積的無水乙醇，混勻，靜置沉淀20min，12000離心10min。8、棄上清，倒置離心管使殘液流盡，用75%的乙醇洗滌兩次。9、棄上清，倒置離心管使殘液流盡，將離心管離心幾分鐘將殘液離到管底，用槍頭將殘液吸干，吹干。10、將沉淀溶于30μ的TE溶液中，于4℃或-40℃保存?zhèn)溆谩?1、質(zhì)粒的檢測：對質(zhì)粒的檢測我們一般就是進(jìn)行電泳檢測。第24頁,共44頁，2024年2月25日，星期天11、質(zhì)粒的檢測：對質(zhì)粒的檢測我們一般采用電泳檢測。第25頁,共44頁，2024年2月25日，星期天注意事項(xiàng)1、加入液體I后一定要充分懸浮菌體細(xì)胞，確保沒有結(jié)塊的菌體，否則細(xì)胞裂解不充分，質(zhì)粒產(chǎn)量會降低。2、溶液II在室溫較低時特別是在冬天，容易產(chǎn)生沉淀。如果有沉淀產(chǎn)生，一定要水浴加熱溶解，并混勻后才能使用。3、如果抗生素失效，或濃度太低可能會導(dǎo)致雜菌大量擴(kuò)增，從而得不到質(zhì)?；虻玫胶苌儋|(zhì)粒。大腸桿菌生長時間過長或過短，也會導(dǎo)致抽提不到質(zhì)?；蛸|(zhì)粒產(chǎn)量很低。第26頁,共44頁，2024年2月25日，星期天補(bǔ)充：儀器的使用1、稱量天平的使用：天平是配制試劑的時候稱量試劑用的，每次使用是要用稱量紙墊著，避免試劑直接接觸天平，否則天平就會被腐蝕，影響稱量的準(zhǔn)確性和天平的使用壽命。另外，每次使用完之后要把天平用軟毛刷掃干凈，以免灑落的試劑腐蝕天平。2、通風(fēng)櫥的使用：通風(fēng)櫥是由外向內(nèi)抽風(fēng)的，目的是為了避免在實(shí)驗(yàn)過程中揮發(fā)性氣體污染室內(nèi)，因此在使用的時候要保持通風(fēng)櫥的通暢，注意不要把手套放在通風(fēng)櫥里面，以免吸到排風(fēng)口里面堵塞排風(fēng)孔而導(dǎo)致通風(fēng)櫥不能正常工作。第27頁,共44頁，2024年2月25日，星期天3、離心機(jī)使用的注意事項(xiàng)使用離心機(jī)的時候首先要調(diào)平衡，沒有調(diào)平衡的話容易損壞轉(zhuǎn)軸，從而損壞離心機(jī)；其次在使用過程中會有離心管破裂而導(dǎo)致試劑漏在離心機(jī)里面，發(fā)生這種情況要及時將露出的試劑處理干凈，將離心機(jī)擦干凈，以免試劑腐蝕離心機(jī)。第28頁,共44頁，2024年2月25日，星期天三、載體的構(gòu)建載體（vector）：是指將外源DNA或基因攜帶進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的工具，按功能可以分為克隆載體和表達(dá)載體?？寺≥d體：是指用于擴(kuò)增或保存外源DNA片段而設(shè)計的載體。多克隆位點(diǎn)(multiplecloningsite)ori復(fù)制起始點(diǎn)遺傳標(biāo)記pUCMCSAmpr第29頁,共44頁，2024年2月25日，星期天克隆載體具備的條件①載體都能攜帶外源DNA片段(基因)進(jìn)入受體細(xì)胞，或停留在細(xì)胞質(zhì)中自我復(fù)制，或整合到染色體DNA上，隨著染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。②載體都具有供外源基因插入的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)。③載體都具有合適的遺傳標(biāo)記基因。④載體都必須是安全的，不應(yīng)含有對受體細(xì)胞有害的基因，并且不會任意轉(zhuǎn)入除受體細(xì)胞以外的其他生物細(xì)胞，尤其是人的細(xì)胞。第30頁,共44頁，2024年2月25日，星期天⑤載體本身的分子量都比較小，可容納較大的外源基因片段。⑥載體在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)要高，方便外源基因在細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增。⑦載體在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性要高，保證重組體穩(wěn)定傳代而不易丟失。⑧載體的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。第31頁,共44頁，2024年2月25日，星期天第32頁,共44頁，2024年2月25日，星期天表達(dá)載體：在克隆載體基礎(chǔ)上，為使插入的外源DNA片段有效轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽，裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的強(qiáng)啟動子以及利于表達(dá)產(chǎn)物分泌、分離和純化的元件，這種載體稱為表達(dá)載體。第33頁,共44頁，2024年2月25日，星期天表達(dá)載體構(gòu)建的一般步驟：酶切連接轉(zhuǎn)大腸桿菌PCR檢測重組質(zhì)粒的提取酶切檢測轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌PCR檢測保菌第34頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶切：1、確定酶切位點(diǎn)；2、確定體系、緩沖液和酶的最佳反應(yīng)溫度；3、配制反應(yīng)液：buffer:2

酶：0.5DNA：3ddH2O:補(bǔ)足20μ第35頁,共44頁，2024年2月25日，星期天連接：T4buffer：1DNA片段：6Vector：2T4連接酶：1配制好之后放連接儀16℃連接過夜。第36頁,共44頁，2024年2月25日，星期天第37頁,共44頁，2024年2