植物組織石蠟切片的制作

關(guān)于植物組織石蠟切片的制作石蠟制片的基本步驟1.取材2.固定、保存3.脫水4.透明5.浸蠟與包埋6.切片7.粘片與烤片8.脫蠟與復(fù)水9.染色10.切片脫水、透明和封固第2頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.取材1.1材料來(lái)源及部位：與觀察目的有關(guān)①種類②部位③發(fā)育階段④觀察橫切面還是縱切面？1.2取材原則：動(dòng)作：快，輕，用力均勻體積合適（5-10mm為宜）刀要鋒利2.固定、保存目的---殺死各種酶，保持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)固定液固定時(shí)間固定后的處理第3頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天

最常用的固定液為FAA。固定時(shí)間不受限制，短則數(shù)小時(shí)，長(zhǎng)可延至數(shù)月或數(shù)年。配方：

50％或70％酒精90毫升

冰醋酸5毫升

福爾馬林5毫升

柔軟材料用50％酒精，堅(jiān)硬材料用70％酒精配制。第4頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天卡諾氏(Carnoy’s)固定液：有極強(qiáng)的滲透力固定根尖和花藥只需40-60分鐘，時(shí)間太長(zhǎng)不好(不能超一天)。固定后用95％酒精沖洗，在組織不能立即處理時(shí)，需轉(zhuǎn)入70％酒精中保存。配法有兩種：第5頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定組織時(shí)應(yīng)注意：①保持組織新鮮，勿使其干燥，盡快固定處理。②組織塊不易過(guò)大過(guò)厚，厚度必須控制在0.3cm以內(nèi)。③固定液必須有足夠的量，一般大于組織20倍以上。④抽氣：使固定液盡快滲入材料內(nèi)部，并排除材料內(nèi)氣泡的干擾。第6頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天組織固定后的處理①?zèng)_洗或漂洗：組織固定后應(yīng)充分水洗，除去留在組織內(nèi)的固定液及其結(jié)晶沉淀，否則會(huì)影響以后的染色效果。②材料經(jīng)過(guò)固定后，需要保存下來(lái)以備利用，通常使用的保存劑是70%的酒精溶液，可以使一般的材料保存較長(zhǎng)的時(shí)間而不至于變壞。（FAA或卡諾固定液固定不需要沖洗）③通常在冰箱中4℃存放。第7頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.脫水水和透明劑不能互溶，只有脫去水分后，才能讓透明劑進(jìn)入。凡用酒精配制的固定液，一律用同濃度的酒清洗。酒精為常用脫水劑，它既能與水相混合，又能與透明劑相混。為了避免組織材料的急劇收縮，應(yīng)按從低濃度到高濃度遞增的順序進(jìn)行.30%--50%---70%---85%---95%--100%---100%每步30-60分鐘左右。第8頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天要求及注意事項(xiàng)保證脫水梯度和每一步脫水時(shí)間，水要完全脫凈。不同大小的組織塊脫水時(shí)間不同。不能過(guò)度脫水（過(guò)久使組織變脆、收縮）材料可以放在70％酒精中保存。正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陸環(huán)等也可做脫水劑。第9頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.透明純酒精不能與石蠟相溶，還需用能與酒精和石蠟相溶的媒浸液，替換出組織內(nèi)的酒精。材料塊在這類媒浸液中浸漬，出現(xiàn)透明狀態(tài)，此液即稱透明劑，透明劑浸漬過(guò)程稱透明.常用的透明劑有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各種透明劑均是石蠟的溶劑。通常組織先經(jīng)純酒精和透明劑各半的混合液浸漬1～2小時(shí)，再轉(zhuǎn)入純透明劑中浸漬。材料進(jìn)入無(wú)水的透明劑中后，若透明劑變渾濁，說(shuō)明材料中的水分未脫干凈，必須回到前面一級(jí)無(wú)水的脫水劑中再次脫水（但是效果往往不好）。透明劑的浸漬時(shí)間則要根據(jù)組織材料塊大小及組織特性而定。第10頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天5.浸蠟與包埋用石蠟取代透明劑，使石蠟浸入組織而起支持作用。通常先把組織材料塊放在熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液浸漬1～2小時(shí)或者過(guò)夜，再先后移入熔化的石蠟液中浸漬幾天。浸蠟應(yīng)在高于石蠟熔點(diǎn)3℃左右的溫箱中進(jìn)行，以利石蠟浸入組織內(nèi)。第11頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天石蠟熔點(diǎn)：

45-50℃軟蠟

55-60℃硬蠟材料較硬的，用熔點(diǎn)較高的石蠟包埋；切片較薄時(shí)（在8微米以下），用熔點(diǎn)較高的石蠟包埋；夏季采用熔點(diǎn)較高的石蠟（56,58）,冬季宜選用熔點(diǎn)較低的石蠟（52,54）。第12頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天石蠟的處理：新蠟應(yīng)溶一次，增加密度。并用濾紙過(guò)濾去除雜質(zhì)。加5%～10%的蜂蠟(工蜂腹部下面四對(duì)蠟腺分泌物質(zhì)

),增加石蠟的韌性。反復(fù)溶的舊蠟包埋效果更好。程序：在溶蠟箱中進(jìn)行，55-60℃，恒溫。浸蠟：二甲苯透明后的組織塊在二甲苯︰石蠟（1︰1）中1次，在石蠟中2次，每次1-3天左右。包埋：在室溫進(jìn)行第13頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天6.切片包埋好的蠟塊用刀片修成規(guī)整的梯形，粘于小木塊上。第14頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天第15頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天切片刀的銳利與否、蠟塊硬度適當(dāng)都直接影響切片質(zhì)量，可用熱水或冷水等方法適當(dāng)改變蠟塊硬度。通常切片厚度為8～12微米，切出一片接一片的蠟帶，用毛筆輕托輕放在紙上。第16頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天7.粘片與烤片用粘附劑將展平的蠟片牢附于載玻片上，以免在以后操作中材料脫落。在載玻片上涂抹粘片劑，再滴蒸餾水，放上蠟片，至于展片臺(tái)上鋪展，最后用濾紙吸除多余水分，將載玻片放入42℃溫箱中干燥。第17頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天常用的粘片劑為郝伯特(Haupt)粘貼劑：甲液：明膠1克蒸餾水100毫升甘油15毫升苯酚2克乙液：甲醛4毫升蒸餾水100毫升第18頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天8.

脫蠟及復(fù)水干燥后的切片需脫蠟及復(fù)水才能在水溶性染液行染色。用二甲苯脫蠟，再逐級(jí)經(jīng)梯度酒精復(fù)水。脫蠟（溶蠟）：將切片上的石蠟溶去。一般都用二甲苯溶脫蠟。如果脫蠟不徹底，材料的染色就困難。復(fù)水：脫蠟后的材料從高濃度的酒精溶液（100%）開(kāi)始，逐級(jí)進(jìn)入低濃度的酒精溶液，最后一級(jí)通常是30%酒精或水，使材料中的水分逐漸增加。如果不經(jīng)過(guò)復(fù)水，材料脫蠟后直接進(jìn)入染色劑中，材料將會(huì)嚴(yán)重變形，甚至難以染色。第19頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天順序：

二甲苯→1/2二甲苯+1/2純酒精→100%酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒精→30％酒精→水→染色以上各級(jí)約需5～10分鐘。

第20頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天9.染色染色的目的是使細(xì)胞組織內(nèi)的不同結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不同的顏色和足夠強(qiáng)的差異以便于觀察。經(jīng)染色可顯示細(xì)胞內(nèi)不同的細(xì)胞器及內(nèi)含物以及不同類型的細(xì)胞組織。根據(jù)觀察要求及研究?jī)?nèi)容采用不同的染色劑及染法。番紅與固綠染色法番紅用l％的水溶液，固綠用0.5％的酒精液(用95％的酒精配制)染色步驟如下：

第21頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天第22頁(yè),共24頁(yè)，2024年2月25日，星期天10.