YYT 1849-2022 重組膠原蛋白

中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標準重組膠原蛋白Recombinantcollagenpro2022-01-13發(fā)布國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布 I 2規(guī)范性引用文件 3術語和定義 4質(zhì)量控制 24.1通則 24.2制備工藝的質(zhì)量控制 24.3重組膠原蛋白的質(zhì)量控制 25檢測項目、要求和檢測方法 5.1通則 5.2理化項目 35.3鑒別 45.4純度 4 55.6含量 65.7結構表征 5.8生物學功能 5.9安全性試驗 86穩(wěn)定性 7生物學評價 9 9附錄A(資料性)重組膠原蛋白特性分析 附錄B(規(guī)范性)細胞黏附性測定——離心法 附錄C(規(guī)范性)細胞移行試驗——細胞劃痕法 參考文獻 l本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由國家藥品監(jiān)督管理局提出。本文件由中國食品藥品檢定研究院歸口。本文件起草單位：中國食品藥品檢定研究院、四川省藥品檢驗研究院(四川省醫(yī)療器械檢測中心)、山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗研究院、北京大學口腔醫(yī)學院口腔醫(yī)療器械檢驗中心、陜西巨子生物技術有限公司、山西錦波生物醫(yī)藥股份有限公司、江蘇創(chuàng)健醫(yī)療科技有限公司、江蘇江山聚源生物技術有1重組膠原蛋白本文件規(guī)定了重組膠原蛋白的質(zhì)量控制要求、檢測指標及其檢測方法等。本文件適用于作為醫(yī)療器械原材料的重組膠原蛋白的質(zhì)量控制。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于GB/T16886.1醫(yī)療器械生物學評價第1部分：風險管理過程中的評價與試驗GB/T16886.20醫(yī)療器械生物學評價第20部分：醫(yī)療器械免疫毒理學試驗原則和方法GB18278.1醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌濕熱第1部分：醫(yī)療器械滅菌過程的開發(fā)、確認和常規(guī)控制GB18279.1醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌環(huán)氧乙烷第1部分：醫(yī)療器械滅菌過程的開發(fā)、確認和常規(guī)控制的要求GB18280.1醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌輻射第1部分：醫(yī)療器械滅菌過程的開發(fā)、確認和常規(guī)控制YY/T1453組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品I型膠原蛋白表征方法YY/T1465(所有部分)醫(yī)療器械免疫原性評價方法YY/T1805.2組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品膠原蛋白第2部分：I型膠原蛋白分子量檢測十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法YY/T1805.3組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品膠原蛋白第3部分：基于特征多肽測定的膠原蛋白含量檢測液相色譜-質(zhì)譜法中華人民共和國藥典下列術語和定義適用于本文件。一類含有至少20種在遺傳學上不同類型的分泌蛋白質(zhì)家族，主要擔任機體的結構支撐功能，具有獨特的由三條多肽鏈(被稱為α鏈)組成的三螺旋構型，并具有一定的生物學功能。2采用重組DNA技術，對編碼所需人膠原蛋白質(zhì)的基因進行遺傳操作和(或)修飾，利用質(zhì)?；虿《据d體將目的基因帶入適當?shù)乃拗骷毎?細菌、酵母或其他真核細胞等)中，表達并翻譯成膠原蛋白(3.1)或類似膠原蛋白(3.1)的多肽，經(jīng)過提取和純化等步驟制備而成。4質(zhì)量控制由于重組基因片段的型別與序列的不同，表達體系的差異，致使獲得的產(chǎn)物不盡相同，與天然膠原蛋白相比，氨基酸組成、分子量大小和(或)結構可能差異很大，甚至行全面的特性分析(見附錄A),進行嚴格的質(zhì)量控制。重組膠原蛋白的質(zhì)量控制與分子量大小、結構特性、質(zhì)量屬性復雜程度以及生產(chǎn)工藝相關。質(zhì)量控制體系主要包括原輔料質(zhì)量控制、生產(chǎn)工藝和過程控制及最終成品的檢測等。應通過成品檢測、過程控制和工藝驗證相結合的方法，確保各類雜質(zhì)已去除或降低至可接受水平。4.2制備工藝的質(zhì)量控制重組膠原蛋白屬于一種重組蛋白，應參照《中華人民共和國藥典》“人用重組DNA蛋白制品總論”純化、原液、半成品和成品)和生產(chǎn)工藝變更要求，建立質(zhì)量控制體系。不適用條款或事項需給出合理的4.3重組膠原蛋白的質(zhì)量控制重組膠原蛋白成品的質(zhì)量控制包括采用參比品和經(jīng)驗證的方法評估已知和(或)潛在的成品相關物質(zhì)和工藝相關物質(zhì)，以及采用適宜的方法對成品鑒別、生物學功能、純度和雜質(zhì)等進行檢測和分析。選擇已證明足夠穩(wěn)定且適合臨床試驗的一個(多個)批次，或用一個代表批次作為參比品，用于鑒別、理化和生物學功能等各種分析。根據(jù)重組DNA蛋白制品特性，應對參比品做全面深入的表征/特性分析。參比品的建立和制備應參照《中華人民共和國藥典》“生物制品國家用于理化測定等方面的參比品，如用于肽圖或等電點測定的參比品，可用原液直接分裝制備，一70℃以下或經(jīng)驗證的貯存條件下保存。根據(jù)重組DNA蛋白制品特性，參比品應進行必要的分析鑒分析(酵母或其他真核細胞表達)等。收獲液經(jīng)提取、純化分裝于中間貯存容器中即為原液。原液的檢驗項目取決于工藝的驗證、一致性的確認和預期成品相關雜質(zhì)與工藝相關雜質(zhì)的水平。應采取適當方法對原液質(zhì)量進行檢測，必要時應與參比品進行比較。經(jīng)工藝驗證后，可由一批或多批原液合并生產(chǎn)半成品，制成成品前，如需對原液進行稀釋或加入其他輔料制成半成品，應確定半成品的質(zhì)量控制要求，包括檢測項目和可接受標準。3根據(jù)具體重組膠原蛋白成品的特性確定需要進行的特性分析檢測項目。建立或驗證重組膠原蛋白生產(chǎn)過程的有效性或可接受性的特性分析檢測項目可不納入常規(guī)質(zhì)量控制中，但應對某一特定質(zhì)量屬性是否放入常規(guī)放行標準予以說明。常規(guī)質(zhì)量控制的檢測項目包括如下幾個方面。肉眼直接觀測，供試品應為白色/淡黃色/無色透明液體或凝膠，或白色/類白色凍干粉或海綿狀適用時，按照《中華人民共和國藥典》“可見異物檢查法”的“燈檢法”進行檢應根據(jù)供試品的溶解特性，對供試品在水、稀酸或中性鹽溶液中的溶解程度進行表征和闡述。約10mg按照《中華人民共和國藥典》“熱分析法”率升溫至105℃,保持60min。減失重量應符合所標示范圍。規(guī)定仲裁方法為水分測定法。用0.9%氯化鈉溶液將供試品制成1mg/mL的溶液，若使用其他溶劑溶解應明確說明使用溶劑及如適用，用0.9%氯化鈉溶液將供試品制成1mg/mL的溶液或根據(jù)臨床預期使用，將供試品配制驗條件，動力黏度值應符合所標示范圍。5.2.9.1采用差示掃描量熱法(DSC)進行解聚溫度分析。按照《中華人民共和國藥典》“熱分析法”進行。初始溫度20℃,以2℃/min速度升溫至200℃,記錄熱分析曲線。根據(jù)供試品的通常貯存性狀(如凍干粉等)和預期使用性狀進行相同或相似樣品條件下的差示掃描量熱分析。5.2.9.2將供試品原液，或重組膠原蛋白凍干粉或海綿加水制成10mg/mL的溶液，置(57±0.5)℃水4浴中保溫4h后，用可見異物檢查裝置，肉眼觀察應無凝膠化或絮狀物。等)和裝量的不同確定裝量的允差要求。行測定，應與參比品肽圖一致，主要特征肽段相對比例(響應強度)應與參比品基本一致。進行定性，序列覆蓋率應符合所標示范圍。用氨基酸序列分析儀或質(zhì)譜法測定N端和/或C端氨基酸序列，其結果應符合理論預測(每年應至少做一次)。5.3.3.1按照YY/T1805.2規(guī)定的方法條件進比品(經(jīng)過飛行時間質(zhì)譜鑒定過的重組膠原蛋白)保持一致。標示范圍內(nèi)。濃度為15%,供試品加水制成濃度為1mg/mL～2mg/mL的溶液，點樣量10μL,考馬斯亮藍R250染應符合標示要求。5質(zhì)的質(zhì)量控制(如蛋白質(zhì)A、宿主細胞蛋白質(zhì)、DNA、其他潛在的培養(yǎng)或純化殘留物等)通常在原液階段進行。如經(jīng)充分驗證證明生產(chǎn)工藝對工藝相關雜質(zhì)的去除已達到高水平時，工藝相關雜質(zhì)的質(zhì)量控制可在恰當工藝步驟的中間產(chǎn)物進行，可不列入放行檢測中。雜質(zhì)檢測項目可能涉及，但不限于如下測定，“熒光染色法”的樣品加標回收率應滿足70%～130%;“定量PCR法”的樣品加標回收率應滿足50%～150%,應規(guī)定殘留限量。如果樣品中外源性DNA殘留量低于“熒光染色法”的檢測限，則應采按照《中華人民共和國藥典》“大腸埃希菌菌體蛋白質(zhì)殘留量測定法”或采盒進行測定，其結果應在總蛋白的0.05%以下(體內(nèi)植入),或0.1%以下(外用)。按照《中華人民共和國藥典》“酵母工程菌菌體蛋白質(zhì)殘留量測定法”或采用經(jīng)驗證的酶聯(lián)免疫試劑盒進行測定，其結果應在總蛋白的0.05%以下(體內(nèi)植入),或0.1%以下(外用)。采用經(jīng)驗證的酶聯(lián)免疫試劑盒進行測定，CHO細胞蛋白質(zhì)殘留量應在總蛋白的0.05%以下(體內(nèi)植入),或0.1%以下(外用)。應根據(jù)工藝中采用的表達體系和使用的抗生素類型，采用經(jīng)驗證的方法測定殘余抗生素含量/活性，并根據(jù)風險分析規(guī)定可接受的限量要求。不應有殘余抗生素活性。中，氨芐西林殘留量也可采用高效液相色譜-質(zhì)譜法。推薦液相色譜條件可采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相A為水(甲酸0.1%),流動相B為乙腈(甲酸0.1%)梯度洗脫；質(zhì)譜采用電噴霧電離離子源(ESI)為離子源。65.5.7促炎性污染物(肽聚糖等)采用經(jīng)驗證的方法或經(jīng)驗證的市售細菌肽聚糖檢測試劑盒(ELISA)檢測殘留肽聚糖，應根據(jù)其致熱反應風險規(guī)定可接受的限量要求。耦合等離子體質(zhì)譜法”進行測定，其結果應符合標示的限量要求。≤10μg/g(質(zhì)量分數(shù))?；蛳喈?shù)姆椒ㄟM行測定(應進行方法學確認和驗證),其結果應符合限量要求：砷(As)≤1μg/g,汞(Hg)≤4μg/g,鉛(Pb)≤15μg/g,鉻(Cr)、鎘(Cd)≤50μg/g(質(zhì)量分數(shù))。預期植入用的重組膠原蛋白成品中銅(Cu)、鉬(Mo)、鐵(Fe)、鎳(Ni)均≤5如果使用了防腐劑、凍干保護劑等添加劑，應給出其限量要求和檢測方法。5.6.1重組膠原蛋白含量用總蛋白含量和純度計算?？偟鞍缀康臏y定按照《中華人民共和國藥典》“蛋白質(zhì)含量測定法”的“凱氏定氮法”進行測定，純度按5.4進行檢測。含量結果應在標示量的如果是液體或凝膠狀樣品，以重組膠原蛋白含量除以樣品總體積，即可得到相對于單位體積樣品中重組膠原蛋白的相對含量數(shù)據(jù)，標示為mg/mL;如果為固體樣品或凍干品，以重組膠原蛋白含量除以總質(zhì)量，即可得到單位質(zhì)量樣品中重組膠原蛋白的相對含量數(shù)據(jù)，標示為mg/mg。5.6.2特征多肽法：用高效液相色譜-質(zhì)譜法進行特異性特征多肽的定量檢測，得到重組膠原蛋白特征多肽含量。基于特異性特征多肽的高效液相色譜-質(zhì)譜方法按照YY/T1805.3的規(guī)定進行。N-連接和O-連接的寡糖、糖基化、聚集等)?？墒褂酶叻直媛噬V質(zhì)譜技術(如：LCMS-QTOF)對樣品適宜的蛋白質(zhì)酶(如：胰蛋白酶)酶解產(chǎn)物進行肽圖指紋圖譜分析，通過將天冬酰胺脫酰胺化和甲硫氨酸氧化修飾設置為可變修飾，分析多見的脫酰胺化和氧化異質(zhì)性。應通過適合的理化方法分析高級結構，并通過生物學功能進行確證，也可采用體外或體內(nèi)證實其發(fā)揮功能或作用的分析方法，作為高級結構確證的補充。應采用氨基酸序列分析儀或質(zhì)譜法進行氨基酸序列分析。其結果應符合理論序列。每種重組膠原蛋白都有其特征的紅外光譜，供試品的紅外光譜圖應與參比品一致。光譜圖應規(guī)定7膠原的CD譜圖在195nm附近的波長處有負峰，在221nm附近的波長處有正峰。如果檢測不到在221nm附近處的正峰，則提示沒有三螺旋結構。如果定性檢測證實供試品中有三螺旋結構，則可利用不同比例的系列膠原蛋白對照品和其完全變性的膠原蛋白對照品混合物作為外標法對照品，與在221nm附近波長處的正峰強度進行擬合，實現(xiàn)三螺旋含量的相對定量分析。推薦使用組織提取膠原蛋白國家醫(yī)藥標準物質(zhì)作為對照品。膠原蛋白的三螺旋結構的特征表現(xiàn)出特定的吸收峰，如組織提取牛I型膠原蛋白在(43±1)℃有吸收峰，如果檢測不到特征峰則提示供試品中沒有三螺旋結構。如果定性檢測已證實供試品含有三螺旋結構，則可利用不同比例的系列膠原蛋白對照品和其完全變性的膠原蛋白對照品混合物作為外標法對照品，對三螺旋含量進行相對定量分析。推薦使用組織提取膠原蛋白國家醫(yī)藥標準物質(zhì)作為對照品。結構的單鏈含量，間接獲得三螺旋結構的含量比。通過加熱變性處理和非加熱變性處理樣品的蛋白酶酶解產(chǎn)物中特征多肽含量的比較分析，如果二者特征多肽檢測的響應強度(譜峰高度或面積)一致，則提示無三螺旋結構；如果加熱變性處理后樣品的響應強度明顯高于非加熱變性處理樣品，則提示可能含有三螺旋結構。如果重組膠原蛋白中存在三螺旋結構，應選擇2種或2種以上方法進行充分的表征和確證。推薦使用組織提取膠原蛋白對照品進行對比分析。如適用，應進行脯氨酸羥基化分析，按照YY/T1453規(guī)定的方法，使用氨基酸分析儀定量檢測羥脯如適用，應進行糖譜/糖基化修飾分析，參照《中華人民共和國藥典》“單抗N糖譜測定定，供試品測定結果應在規(guī)定的范圍內(nèi)。必要時應將供試品與參比品進行比較。重組膠原蛋白的生物學功能是指以重組膠原蛋白生物學特性相關屬性為基礎的生物學作用，對聲稱的生物學功能宜進行定性/定量分析。膠原是細胞外基質(zhì)的主要成分。重組膠原蛋白的主要生物學功能是為細胞提供支架和良好的微環(huán)境，如促進細胞黏附、增殖生長、分化等。因此，可通過評價細胞-膠原蛋白相互作用來評價重組膠原蛋白的生物學功能。8用重組膠原蛋白包被細胞培養(yǎng)板或其他經(jīng)驗證的方法，采用合適的預期臨床應用時可能接觸的細胞(如皮膚成纖維細胞),接種密度在50%左右，常規(guī)培養(yǎng)2天～3天后檢測細胞增殖情況，考察重組膠原蛋白包被梯度濃度的劑量-效應關系。具體檢測方法可采用MTT法、CCK8法等進行檢測(按照試劑盒的操作說明進行),采用無重組膠原蛋白包被的細胞培養(yǎng)板作為對照，分析細胞增殖率。如需要，可采用組織提取膠原蛋白國家標準品作為對照材料，對比分析重組膠原蛋白的促細胞增殖用重組膠原蛋白包被細胞培養(yǎng)板或其他經(jīng)驗證的方法，采用合適的預期臨床應用時可能接觸的細胞(如皮膚成纖維細胞),接種密度在90%左右，常規(guī)培養(yǎng)3天～7天后檢測細胞分化情況。具體方法可采用RT-PCR方法測定細胞的分化標志物(如：a-SMA、Vimentin、Fibroblastsurfaceantigen),采用無重組膠原蛋白包被的細胞培養(yǎng)板作為對照，分析細胞分化情況。如需要，可采用組織提取膠原蛋白國家標準品作為對照材料，對比分析重組膠原蛋白的促細胞分化細胞貼壁情況可通過細胞貼壁率試驗簡單地評價細胞黏附性。但是，細胞黏附性還包括細胞黏附強度(相對細胞黏附百分比),按照附錄B或其他經(jīng)驗證的方法進行。如需要，可采用組織提取膠原蛋白國家標準品作為對照材料，對比分析重組膠原蛋白的細胞黏附重組膠原蛋白用于組織修復與重建時，應有利于細胞的識別、移行，細胞移行試驗按照附錄C或其他經(jīng)驗證的方法進行。如需要，可采用組織提取膠原蛋白國家標準品作為對照材料，對比分析重組膠原蛋白的細胞的識5.9安全性試驗應根據(jù)所采用的表達體系(細菌、酵母或其他真核細胞等)而定，檢測指標包括，但不限于如下幾項。如果重組膠原蛋白成品以無菌的方式提供，則應按照GB18278.1、GB18279.1、GB18280.1對滅菌9如果重組膠原蛋白成品以非無菌的方式提供，每1g、1mL或10cm2供試品中需氧菌總數(shù)不得超過102CFU,霉菌和酵母菌菌落數(shù)不得超過10CFU,不得檢出大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單檢測方法：用0.9%無菌氯化鈉溶液或pH7.2無菌磷酸鹽緩沖液制備供試品溶液。按照《中華人民共和國藥典》“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法”“非無菌產(chǎn)品微生物限度重組膠原蛋白穩(wěn)定性受多種因素影響，包括純化工藝、微生物負載、包裝貯存條件等。重組膠原蛋性進行動態(tài)評價和分析。與穩(wěn)定性相關的工藝驗證宜采用連續(xù)三批次重組膠原蛋白進行。在相關工藝條件無變化時，每年宜進行至少一個批次產(chǎn)品的穩(wěn)定性檢驗。在工藝條件有變化時，應考慮對重組膠原蛋白穩(wěn)定性的影響，必要時進行再次驗證。7生物學評價作為制備醫(yī)療器械產(chǎn)品的原材料，應按照GB/T16886.1的要求對重組膠原蛋白進行相應必要的生物學評價?；诓糠秩四z原蛋白核酸序列進行編輯組合而重組的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，可能引起人體預測不到的免疫原性，特別是長期反復使用時。因此，如果不能排除免疫原性風險，則宜增加免疫學研究。試驗方法應按照GB/T16886.20及YY/T1465系列標準的要求進行。如果產(chǎn)品以非無菌的方式提供，可將樣品滅菌后用于生物學評價試驗，宜考慮滅菌方式及滅菌對重組膠原蛋白的影響。8.1若生產(chǎn)商作為本單位研發(fā)醫(yī)療器械產(chǎn)品的初始材料(原材料)時，應按照醫(yī)療器械生產(chǎn)中對原材料8.2若生產(chǎn)商作為醫(yī)療器械研發(fā)的原材料銷售時，應提供必要的信息，在品名和來源的信息中應至少包括：表達體系、DNA模板種屬及其膠原蛋白類型、氨基酸長度和編輯情況，如：(aaX—aaY)n(重復次數(shù)),并建議考慮相關醫(yī)療器械產(chǎn)品對原材料包裝、貯存、運輸?shù)囊蟆?資料性)重組膠原蛋白特性分析研發(fā)階段對重組膠原蛋白的理化特性、生物學功能/作用、免疫學特性、純度和雜質(zhì)等進行嚴格的特性分析鑒定是建立并確定產(chǎn)品質(zhì)量標準的基礎。需采用廣泛的分析技術來表征其理化性質(zhì)(如：分子量、等電點、氨基酸組成、疏水性等),以及對糖基化等各種翻譯后修飾進行充分鑒定，并納入適當?shù)臋z測，以確認終產(chǎn)物具有預期的構象、聚集和(或)降解狀態(tài)及其高級結構。A.2.1一級結構包括二硫鍵(氫鍵)連接方式的氨基酸序列。宜測定目標產(chǎn)品的氨基酸序列，并與其基因序列推斷的理論氨基酸序列進行比較。氨基酸序列測定還宜考慮可能存在的N端甲硫氨酸(如大腸桿菌來源的制品),信號肽或前導序列和其他可能的N端、C端修飾(如乙?；Ⅴ０坊蛘哂捎谕庠疵笇е碌牟糠纸到庖约癈端加工、N端焦谷氨酸等),以及各種其他異質(zhì)性(如脫酰胺化、氧化、異構化、碎片化、二硫鍵錯配、N-連如有(如酵母菌發(fā)酵工藝或其他真核細胞表達體系制備的產(chǎn)品),則宜對糖基化修飾進行全面的分析和確定，如糖基化修飾與產(chǎn)品半衰期和生物學作用相關，則宜確定糖的含量(如中性糖、氨基糖和唾液酸)。糖型結構可能與不良反應相關(如非人類的糖型結構或其殘基),宜盡可能對糖鏈的結構、糖型以及多肽鏈的糖基化位點進行深入分析。必要時應進一步就電荷異質(zhì)性進行檢測分析。A.2.3高級結構如有，則宜通過適合的理化方法分析高級結構，并且通過生物學功能或作用來確認。生物學功能或作用是對高級結構的確證，也可采用體外或體內(nèi)證實其發(fā)揮功能或作用的分析方法，作為高級結構確證A.3.1概述：重組膠原蛋白的雜質(zhì)主要包括自身相關雜質(zhì)、工藝相關雜質(zhì)以及外源污染物。宜盡可能地對雜質(zhì)進行分析鑒定，并采用適宜的方法評價其對生物學功能的影響。A.3.2自身相關物質(zhì)/雜質(zhì)：主要源于重組膠原蛋白的異質(zhì)性和降解產(chǎn)物。需要對目標重組膠原蛋白的各種分子變異體進行分離、鑒別和分析。如變異體的功能與目標產(chǎn)物一致時可不做雜質(zhì)考慮。但宜考慮在生產(chǎn)和/或貯存期間產(chǎn)品降解產(chǎn)物是否顯著增加及其與免疫原性的相關性。A.3.3工藝相關雜質(zhì)：包括來源于生產(chǎn)工藝本身，如細胞基質(zhì)來源、細胞培養(yǎng)來源和下游工藝。宜對潛在的工藝相關雜質(zhì)(如宿主細胞蛋白質(zhì)、宿主細胞DNA、細胞培養(yǎng)殘留物、下游工藝的殘留物等)進行鑒A.3.4污染物：指所有引入的，且并非生產(chǎn)過程所需的物質(zhì)(如各種微生物、細菌內(nèi)毒素)。此外，還宜考慮采用其他適宜檢測方法對可能污染的包括肽聚糖等在內(nèi)的非細菌內(nèi)毒素促炎性污染物進行控制。A.4生物學功能評價重組膠原蛋白實現(xiàn)預期的生物學功能的特定能力、潛力，如膠原蛋白-細胞相互作用。同時也宜關注可能引起的負效應。基于部分人膠原蛋白核酸序列進行編輯組合而重組的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，作為一種完整的蛋白質(zhì)物質(zhì)屬于非人體內(nèi)存在的全新蛋白質(zhì)，需要進行詳盡的結構分析和生物學功能(正向、負向)分析。A.5免疫化學特性天然膠原蛋白有一定的糖基化，酵母發(fā)酵技術制備的膠原蛋白產(chǎn)物可能有輕度的糖基化。糖基化可能影響產(chǎn)品的生物學功能和免疫原性，宜進行適當?shù)奶匦匝芯?。必要時宜對目標分子中與相應表位作用的部分進行分析確證，包括對這些結構的生物化學鑒別(如蛋白質(zhì)、低聚糖、糖合的特征研究(如氨基酸序列和糖型)?；诓糠秩四z原蛋白核酸序列進行編輯組合而重組的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，不僅可能影響產(chǎn)品的生物學功能，也可能引起預測不到的免疫原性，特別是長期反復使用時，因免疫原性評價。A.6含量膠原蛋白含量以質(zhì)量/質(zhì)量(質(zhì)量分數(shù))或質(zhì)量/體積(質(zhì)量濃度)表示。進行目標蛋白質(zhì)含量檢測時宜除外宿主蛋白質(zhì)殘留等雜蛋白?？赏ㄟ^高效液相色譜法(HPLC)或絕對定量的方法，如：利用合成的能夠代表擬測定的重組膠原蛋白產(chǎn)物的特征多肽標準品外標法，采用高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)技術進行膠原蛋白含量測定，并可用于鑒別、溯源和驗A.7參比品宜選擇已證明足夠穩(wěn)定或用一個代表性批次作為參比品，用于鑒別、理化和生物學活性等各種分析，并按特性分析要求進行全面分析鑒定。用于理化測定等方面的對照品，如用于肽圖或等電點測定的對照品，可用原液直接分裝制備，一般-70℃以下或經(jīng)驗證的貯存條件下保存。根據(jù)重組DNA蛋白制品特性，對照品宜進行必要的分析鑒二硫鍵分析及糖基分析(酵母或其他真核細胞表達)等。(規(guī)范性)細胞黏附性測定——離心法B.1試驗原理為研究材料與細胞的黏附作用大小，可通過離心法定量測定膠原蛋白與細胞形成黏附后分離所需的力。將細胞懸液在涂有膠原蛋白的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)一定時間，用熒光標記細胞，在最佳相對離心力(RCF)洗脫未黏附的細胞，測定離心前后細胞分離百分比，評價待測重組膠原蛋白樣品的相對促細胞黏附性。試驗原理示例圖見圖B.1。離心后細胞計數(shù)離心后細胞計數(shù)反轉(zhuǎn)板子和離心粘合密封物鏡圖B.1細胞黏附性測定——離心法試驗原理示例圖a)試驗細胞：如NIH/3T3細胞(ATCCCRL-1658小鼠胚胎成纖維細胞);b)陰性D-PBS溶液；c)對照材料：膠原蛋白國家標準品；e)細胞培養(yǎng)板(96孔，平底)、封口膜(醋酸密封帶或等效材料)、鋁箔。B.3試驗步驟與方法向96孔板內(nèi)分別加入100μL標準品溶液、供試品、D-PBS空白對照。每個樣品包被制備4個孔，在37℃,5%CO?培養(yǎng)箱中孵育1h～4h。從孔中除去多余的包被溶液，加入100μL1%BSA-PBS溶液，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育1h。移除孔內(nèi)液體后，用D-PBS洗滌三次，棄除清洗液，用封口膜密封后置于4℃?zhèn)溆谩.3.2細胞制備將NIH/3T3細胞于37℃,5%CO?細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞密度及狀態(tài)。當細胞生長至培養(yǎng)瓶的80%～90%時，進行細胞傳代或細胞接種。使用已經(jīng)與Hoechst33342熒光染色劑(10%)預混合的完全培養(yǎng)基，將細胞稀釋至5×10*/mL。將100μL細胞加入孔中，用鋁箔覆蓋，并在37℃,5%CO?下孵育1h。測量3個重復樣品，第4個孔用來調(diào)整顯微鏡參數(shù)，不使用其測B.3.3檢測確定最佳相對離心力(RCF),使膠原蛋白國家標準品的相對細胞黏附性比值宜為50%～60%。使中取出上清液。用D-PBS清洗1次后，加入100μLD-PBS。對于3個孔中的每個孔進行拍攝。計算每個樣品大約2400個～3600個細胞[(800細胞/孔～1200細胞/孔)×3孔]。(規(guī)范性)細胞移行試驗——細胞劃痕法C.1試驗原理