DB32T 4727-2024 鱖魚傳染性脾腎壞死病診斷及綜合防控技術(shù)規(guī)程

ICS65.150CCSB52! 7 , fl fi ? ‰DB32/T4727—2024鱖魚傳染性脾腎壞死病診斷及綜合防控技術(shù)規(guī)程Technicalcodeofpracticeforthediagnosis，prevention，andcontrolofinfectiousspleenandkidneynecrosisinmandarinfish2024-04-03發(fā)布 2024-05-03實(shí)施江蘇省市場監(jiān)督管理局 發(fā) 布中國標(biāo)準(zhǔn)出版社 出 版DB32/T4727—2024前 言本文件按照GB/T1.1—202標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)的規(guī)起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由江蘇省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本文件由江蘇省漁業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本文件起草單位：揚(yáng)州大學(xué)。本文件主要起草人：張曉君、高曉建、姜群、劉曉丹、朱鑫海、姜姿妍、周一凡。ⅠDB32/T4727—2024鱖魚傳染性脾腎壞死病診斷及綜合防控技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了鱖魚傳染性脾腎壞死病的診斷、綜合防控和記錄。本文件適用于鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的檢測以及鱖魚傳染性脾腎壞死病的診斷和綜合防控。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文包括所有的修改單適用于本文件。GB11607 漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)SC/T7103 水生動(dòng)物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。診斷現(xiàn)場調(diào)查pH臨床診斷患病魚表現(xiàn)為沿池邊漫游而死見附錄A圖。檢測方法試劑材料試劑材料：分析純分析純分析純1mmol/L乙二胺四乙酸EDTpH8.0；1 十二烷基硫酸鈉ddH2O；1DB32/T4727—202410mmol/LTris?HClpH8.04℃保存；Tris4℃保存；8U/μLBstDNA-20℃保存；10mmol/LdNTPsdATPdTTPdCTPdGTP各2.5mmol/-20℃保存；10000×SYBRGreenI-20℃保存；25mmol/LMgCl2-20℃保存；m)10×LAMP-20℃保存；5mol/L-20℃保存；10×PCR-20℃保存；5U/μLTaqDNA-20℃保存；20mg/mL蛋白酶K-20℃保存；LAMP檢測引物序列：F35?AACCACCAGGCAGAAATGG?3′B35?ATCCGAGGCGACGTCATC?3′FIP5?TAAAGCCAAAGCCCACATCGGCGAAGACATGGTGCGCTACT?3′BIP5?AAGCAAGTGCACAGCACCCGTCAAGCCTCGCACAGAGG?3′巢氏PCR檢測引物序列：MCP?F15?ATGTCTGCAATCTCAGGT?3′MCP?R15?TTACAGGATAGGGAAGCCTG?3′MCP?F25?GCGTTTGATGCGATGGAGAC?3′MCP?R25?ACGGCAGAGACACGGTAGGC?3′儀器設(shè)備儀器設(shè)備包括：a）滅菌鍋；b）水浴鍋；c）PCR儀；紫外分光光度計(jì)；電泳儀；電泳槽；凝膠成像系統(tǒng)；離心機(jī)。采樣采集樣品的數(shù)量見SC/T7103。鱖魚體表用75 酒精消毒后解剖剪解剖無菌操作剪取小塊腎臟脾臟肝臟勻漿后用于DNA提取。檢測樣本模板制備利用酚?三氯甲烷法抽提混合組織DNA。每個(gè)樣品取組織100mg~200mg，勻漿后置于1.5mL微量離心管加入含蛋白酶K的裂解10mmol/LTris?HClpH8.01mmol/LEDTApH8.0；1 SD60℃消化1h~3h。用Tris飽和酚三氯甲烷22混合液提取、純化DNA-20℃冷凍的無水乙醇沉淀2DB32/T4727—2024DNAddH2O。紫外分光光度計(jì)測定DNA濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。DNA樣品置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法LAMP擴(kuò)增按表1加入各項(xiàng)試劑進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，同時(shí)以ddH2O為模板作陰性對照，以病毒質(zhì)粒作陽性對照，LAMP65℃保持60min80℃終止反應(yīng)10min。表1 LAMP反應(yīng)體試劑體積μLDNA模板2（FIPBIP）各1（F3各1dNTP10mmol/）2.510×LAMP緩沖液2.5甜菜堿（5mol/L）4MgC225mmol/）2BstDNA聚合酶（8U/μL）1ddH2O補(bǔ)足至25LAMP檢測結(jié)果判斷將1μL10000×SYBRGreenI熒光染料加入LAMP反應(yīng)產(chǎn)物，振蕩后觀察混合液顏色，綠色為陽性，橙色為陰性（見圖A.2）。巢式PCR檢測方法PCR擴(kuò)增按表2加入試劑進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，同時(shí)以ddH2O為模板作陰性對照，以病毒質(zhì)粒作陽性對照，PCR的反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min94℃變性30s58℃退火30s72℃延伸1min30次后72℃延伸10min。表2 第一輪擴(kuò)增反應(yīng)體試劑體積μLDNA模板1MCP?F10.5MCP?R10.510×PCR緩沖液2.53DB32/T4727—2024表2 第一輪擴(kuò)增反應(yīng)體續(xù))試劑體積μLMgC225mmol/）2dNTP10mmol/）1TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5ddH2O補(bǔ)足至25按表3加入試劑進(jìn)行第二輪PCRddH2O為模板作陰性對照，以病毒質(zhì)粒作陽性對照，PCR94℃預(yù)變性2mi94℃變性3055℃退火3072℃延伸3030次后72℃延伸10mi。表3 第二輪擴(kuò)增反應(yīng)體試劑體積μLDNA模板（第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物）1MCP?F20.5MCP?R20.510×PCR緩沖液2.5MgC225mmol/）2dNTP（10mmol/L）2TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5ddH2O補(bǔ)足至25巢氏PCR檢測結(jié)果判斷反應(yīng)結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物，用1瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果，第一輪陽性擴(kuò)增片段的大小為1362bp，第二輪陽性擴(kuò)增片段的大小為526bp，陰性無擴(kuò)增片段（見圖A.3）。綜合判定結(jié)合現(xiàn)場調(diào)查、臨床癥狀和分子生物學(xué)檢測結(jié)果，診斷結(jié)論如下：4DB32/T4727—2024綜合防控養(yǎng)殖前準(zhǔn)備工作養(yǎng)殖用水水源應(yīng)符合GB11607漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。池塘準(zhǔn)備池塘清整冬季在捕撈后，排干池水，維修堤埂灘腳，并清除池底過多淤泥及池邊雜草，曬池和凍池。生石灰清塘生石灰清塘包括：干法清塘：池塘留水6cm~9cm10kg/100m2~30kg/100m2生石灰清塘；20kg/100m3~50kg/100m3生石灰化漿后全池潑灑。漂白粉清塘漂白粉含有效氯≥28 。漂白粉清塘包括：a）干法清塘：用量1kg/100m2~3kg/100m2；）2kg/100m3~5kg/100m3苗種檢疫苗種放養(yǎng)前進(jìn)行傳染性脾腎壞死病毒檢測。疫苗注射鱖魚苗種下塘前，按照說明書注射國家批準(zhǔn)的鱖傳染性脾腎壞死病滅活疫苗（NH0618。苗種放養(yǎng)“試水魚養(yǎng)殖過程管理水質(zhì)調(diào)控鱖魚養(yǎng)殖池塘水體溶解氧宜≥5mg/L≥30cmpH宜為7.5~8.510d~15d物型底質(zhì)改良劑和水質(zhì)改良劑各1次。餌料投喂投喂的餌料魚不攜帶傳染性脾腎壞死病毒規(guī)格不超過鱖魚全長的50 投喂前用3 ~5 食水浸泡10min~15min消毒。疾病高發(fā)期管理水溫25℃~30℃時(shí)為鱖魚傳染性脾腎壞死病發(fā)病高峰期，每10d用微生物制劑調(diào)節(jié)水質(zhì)進(jìn)行預(yù)5DB32/T4727—2024毒1次~2次，防止交叉感染。記錄詳細(xì)記錄實(shí)際防控措施，記錄保存2年以上。記錄內(nèi)容應(yīng)包含苗種及餌料魚來源、用藥量、用藥方法、病魚死亡情況等。實(shí)際操作與復(fù)核人員需在記錄上簽字。6DB32/T4727—2024附 錄 A資料性）鱖魚傳染性脾腎壞死病臨床癥狀及LAMP和巢式PCR檢測結(jié)果示意圖鱖魚傳染性脾腎壞死病臨床癥狀見圖A.1。標(biāo)引序號說明：AB——鰓絲發(fā)白；C——肝臟發(fā)白；D——膽囊腫大；E——腎臟腫大；F——脾臟腫大。圖A.1 鱖魚傳染性脾腎壞死病臨床癥狀鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測結(jié)果見圖A.2。7DB32/T4727—2024標(biāo)引序號說明：1——陽性樣本；2——陽性對照；3——陰性對照。圖A.2 鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測結(jié)果鱖魚傳染性脾腎壞死病毒巢式PCR檢測結(jié)果見圖A.3。檢測結(jié)果