（高清版）GBT 43629.1-2023 生物技術 核酸合成 第1部分：合成寡核苷酸的生產和質量控制要求

CCSA40生物技術核酸合成第1部分：合成寡核苷酸的生產和質量控制要求Biotechnology—Nucleicacidsynthesis—Part1:Requirementsfortheproductionandqualitycontrolofsynthesizedoligonucleotides2023-12-28發(fā)布2023-12-28實施國家標準化管理委員會IGB/T43629.1—2023/ISO20688-1:2020 12規(guī)范性引用文件 3術語和定義 4寡核苷酸的設計和選擇 25通用質量管理要求 25.1通用要求 25.2寡核苷酸分級 25.3控制文件 25.4質量管理體系 25.5人員和培訓 25.6安全控制 36資源管理 37生產工藝要求 37.1通用要求 37.2寡核苷酸合成 7.3純化 37.4質量控制檢查 37.5干燥 47.6分裝 48質量控制過程要求 48.1通用要求 48.2分析方法的確認與驗證 48.3鑒定與純度 48.4定量 58.5摩爾質量和/或堿基長度 58.6退火溫度 6 68.8糾正措施和改進建議 79合成寡核苷酸(RNA)的附加要求 7附錄A(資料性)工藝過程檢查表 8附錄B(資料性)設備和裝置清單及其控制標準 9Ⅱ附錄C(資料性)摩爾質量和摩爾數的計算 附錄D(資料性)采用質量分析法驗證寡核苷酸序列 附錄E(資料性)采用有證標準物質/有證標準樣品對測量儀器進行校準——示例 附錄F(資料性)T。值的計算方法 參考文獻 Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件是GB/T43629《生物技術核酸合成》的第1部分。GB/T43629已經發(fā)布了以下部分：——第1部分：合成寡核苷酸的生產和質量控制要求。本文件做了下列最小限度的編輯性改動：——結合我國標準的具體情況，增加了頁下注。本文件等同采用ISO20688-1:2020《生物技術核酸合成第1部分：合成寡核苷酸的生產和質量請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由全國生化檢測標準化技術委員會(SAC/TC387)提出并歸口。本文件起草單位：中國測試技術研究院、安徽瑞拜藥業(yè)有限公司、深檢集團(深圳)醫(yī)學檢驗實驗室、浙江貝蘭伯生物技術有限公司、成都海關技術中心、成都醫(yī)學院、河北省食品檢驗研究院、四川省疾病預防控制中心、通用生物(安徽)股份有限公司。本文件主要起草人：周李華、馬麗俠、周黎黎、徐朝花、侯曉妮、王或婕、林華、肖偉敏、蔣子敬、由核苷酸組成的單鏈、線性生物化合物稱為“合成寡核苷酸”或“寡核苷酸”,是生物技術中不可或缺的成分。例如，它們可用于聚合酶鏈反應(PCR)擴增引物、微陣列、實時PCR或新一代測序(NGS)捕獲探針技術中，也可用于合成目標基因的插入起始材料。GB/T43629擬由以下部分構成：——第1部分：合成寡核苷酸的生產和質量控制要求。適用于長度不超過250個堿基的合成寡核苷酸。——第2部分：合成基因片段、基因及基因組的生產和質量控制的一般定義和要求。適用于長度低于10Mbp堿基對的合成基因片段、基因及基因組，包括非克隆片段(線性)和質粒中的克隆基因(環(huán)狀)。在寡核苷酸合成過程中，生產過程中的質量控制非常重要。為了確保符合最終應用的質量要求，需要對大小范圍、濃度和污染物進行量化?？紤]到寡核苷酸在生物活性方面的應用，其質量(尤其是序列和構象)將影響其適應性或功能，例如對同源結合位點的分子識別、化學行為等。每種終端應用的具體要求可能有所不同。1生物技術核酸合成第1部分：合成寡核苷酸的生產和質量控制要求本文件規(guī)定了合成寡核苷酸(通常最多250個堿基)的生產和質量控制的最低要求。本文件還描述了合成寡核苷酸的一般質量指標以及質量指標評價的常用方法。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。附有特性量值、相關不確定度和計量溯源聲明標準物質/標準樣品證書，提供使用有效程序獲得的一個或多個特性量值的標準物質/標準樣品。<合成寡核苷酸>具有滿足生物學試劑特定使用需求。注1:合成的寡核苷酸在作為PCR引物的情況下，合成的寡核苷酸具有引物的能力。注2:合成的寡核苷酸在作為探針以用于DNA微陣列、實時PCR或NGS的情況下，合成的寡核苷酸具有與靶核酸特異性雜交的能力。注3:通過評估寡核苷酸在其各自用途中的功能來確認其能力。<合成寡核苷酸>合成寡核苷酸的預期序列和/或長度與寡核苷酸總量之間的比率。注：合成寡核苷酸的純度是對應于合成寡核苷酸的預期序列和/或長度的吸收峰面積與寡核苷酸的總峰面積的比率。通過高效液相色譜(HPLC)或毛細管電泳(CE)計算260nm處的吸光度(OD2so)。純度是根據HPLC或CE或質譜儀的結果通過面積歸一化法計算的。標準物質/標準樣品referencematerial;RM具有一種或多種足夠均勻和穩(wěn)定的特定特性的物質，其特性量值適用于測量過程中的預期用途。合成寡核苷酸syntheticoligonucleotides用化學方法合成的脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。2注1:各種化合物(例如修飾的堿基、堿基類似物、末端標記試劑、熒光化合物等)均能引入到合成的寡核苷酸中。注2:本文件中的合成寡核苷酸是單鏈的、線性的，長度范圍從大約10個到250個核苷酸。4寡核苷酸的設計和選擇合成寡核苷酸的質量和一致性要求依據其預期用途有差異。例如，引物和探針在聚合酶鏈反應(PCR)或微陣列或新一代測序(NGS)中的質量要求不同。通常，用戶負責指定具體用途的寡核苷酸的質量要求。用戶可從生產者提供的質量等級列表中選擇符合預期用途的質量等級，例如“基因組等級”或“反義健全的質量管理體系和檢測標準有助于提供一致的信息，以便：——用戶適當地選擇符合預期用途的寡核苷酸；——用戶和生產者能夠更好地溝通，并就定制寡核苷酸的要求達成一致。5通用質量管理要求5.1通用要求合成寡核苷酸的生產者(以下稱為“生產者”)應建立并實施一種程序，包括描述并保存記錄以下過程：a)訂單信息；b)寡核苷酸的生產；c)質量控制要求。應制定訂單接收過程中的質量方針和質量目標。用戶的質量要求可能因其預期用途、實驗方法的設計以及影響重復性和再現(xiàn)性結果因素的差異而變化。生產者應根據訂單信息明確質量方針、質量目標和合成寡核苷酸的等級(如適用),根據質量等級表等方式監(jiān)控是否按照相應的工藝過程進行生產(示例見附錄A)。此外，應在生產過程中采取必要的措施，通過測量和分析所生產的合成寡核苷酸的質量來達到預期的結果。5.2寡核苷酸分級為了避免產生不必要的或者過高的質量定值要求，可考慮對寡核苷酸質量進行分級。生產者在記錄寡核苷酸質量等級時，應根據預期用途確定等級。應選擇和確定符合每個等級的純化方法，見7.3。5.3控制文件生產者應制定一套程序，確保對程序化信息(包括本文件要求的記錄)進行受控，并應防止使用任何作廢文件，嚴格執(zhí)行質量管理體系要求。當文件信息包括記錄保存在電子媒介中時，生產者應確保對電子媒介的受控。5.4質量管理體系生產者應建立質量管理體系。質量管理體系應建立必要的程序文件，并確保生產是根據程序文件進行的。應定期檢查合成寡核苷酸的生產是否正確執(zhí)行本文件規(guī)定的質量管理體系。注：對于標記的寡核苷酸，能根據標記的特性考慮其他質量指標，例如熒光強度和波長。生產者應確保人員具備執(zhí)行本文件規(guī)定的程序文件的能力，并對其進行適當監(jiān)督。生產者應向人3員提供適當的培訓和能力評估。5.6安全控制生產者應根據適用要求制定安全計劃，以確保本文件規(guī)定的寡核苷酸合成人員和純化人員的安全。6資源管理生產者應確保生產寡核苷酸的設施和區(qū)域環(huán)境處于適當的條件下。生產者應當維護生產合成寡核苷酸的設備和儀器。生產者應對可能影響合成寡核苷酸質量的原料(包括試劑、純水和輔助材料)進行附錄B列出了適合生產合成寡核苷酸的設備和裝置及其控制標準示例。7生產工藝要求7.1通用要求單序列合成寡核苷酸的生產通常包括以下過程：a)合成；b)純化；c)質量控制檢查；d)干燥(如適用);e)分裝。這些過程應使用經過定期維護/校準的儀器進行，例如移液管或干燥器。注1:有幾種用于生產復雜的寡核苷酸庫的生產工藝。例如，幾個寡核苷酸組合成復雜的寡核苷酸庫，或者通過基于陣列的合成產生復雜的寡核苷酸庫。能根據生產方法選擇、實施適當的質量控制措施。注2:確定質量屬性的常規(guī)方法不一定適用于基于陣列的合成。注3:在某些情況下，單序列寡核苷酸是用兼并堿基合成的，用于非特異性退火的特定應用。在這種情況下，堿基在一個特定的位點被顛換。7.2寡核苷酸合成應使用經過定期校準和維護的測量儀器進行質量控制檢查。寡核苷酸合成儀應定期維護和保養(yǎng)。操作人員應按照程序文件進行資格認證。應保存與實驗操作有關的記錄。應根據設計寡核苷酸的風險、與用戶協(xié)議的預期用途，選擇適當的純化設備和方法。純化方法包括：反相高效液相色譜(C8,C18)純化、陰離子交換高效液相色譜[(stronganionexchangepattern,SAX),(weakanionexchangepattern,WAX)]、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、寡核苷酸純化柱(oligonucleotidepurificationcartridge,OPC)、高純度無鹽(highpuritysaltfree,HPSF)純化和直接沉淀(脫鹽)。純化方法可根據寡核苷酸的預期用途選擇。應保留所用方法的記錄。純化設備應由有資質的人員進行操作。與操作有關的記錄應予以保存。7.4質量控制檢查應使用經過校準和維護的測量儀器進行質量控制檢查。測量操作應由有資質的人員按照程序文件4進行，并保留操作記錄。對寡核苷酸的特性、純度、雜質、合成量和其他與預期用途有關的重要屬性應進行質量控制。干燥可采用離心蒸發(fā)、冷凍干燥或空氣干燥設備進行。這些操作應由有資質的人員按照程序文件進行，并保留操作記錄。這些操作應由有資質的人員按照程序文件執(zhí)行，并保留操作記錄。8質量控制過程要求8.1通用要求質量控制過程應確定寡核苷酸與其預期用途有關的特性、純度、雜質、量和其他重要屬性。應選擇適當的方法并進行驗證，以確定寡核苷酸的特性和質量。測量工作應由有資質的人員進行。8.2分析方法的確認與驗證用于進行質量控制和檢測質量屬性的分析方法應經過確認和驗證。儀器應使用有證標準物質/有證標準樣品進行校準。注：附錄E描述了采用有證標準物質/有證標準樣品對測量儀器進行校準的示例。8.3鑒定與純度8.3.1堿基序列的鑒定堿基序列可通過適當的方法確認，例如電噴霧電離(ESI)或基質輔助激光解析/電離(MALDI)作為離子源，飛行時間質譜儀(ToF)、離子阱質譜儀或四極桿質譜儀(MS)用于分子量分析或者測序。注1:附錄D中描述了使用MS確認堿基序列的示例。注2:MS用于確認短寡核苷酸的序列，而準確分析序列取決于合成寡核苷酸的長度。應記錄確認的基本序列標識。生產者和使用者應就特定用途的寡核苷酸的純度達成一致。示例：合成寡核苷酸的純度能確定為目標寡核苷酸量與寡核苷酸總量之比。目標寡核苷酸是具有“預期長度”和/或正確序列的寡核苷酸。測定純度的方法包括以下一種或多種方法：a)分析用反相或離子交換高效液相色譜法；b)經驗證的相對線性區(qū)間的毛細管電泳或平板凝膠電泳；c)質譜(例如，ESI或MALDI作為離子源，ToF、MS作為分子量分析儀);d)測序。注：合成的寡核苷酸是復雜的分子，根據寡核苷酸的設計和生產工藝，會產生不同的結果。應記錄測定的純度。在某些應用中，雜質的測定是很重要的。5生產者和使用者應就特殊用途的寡核苷酸雜質的可接受程度或范圍確定并達成一致。一般來說，雜質是指干擾預期用途的寡核苷酸的含量。應采用適當的方法測定雜質的含量。雜質測定方法包括以下一種或多種方法：a)分析用反相或離子交換高效液相色譜法；b)經驗證的相對線性區(qū)間的毛細管電泳或平板凝膠電泳；c)質譜(ToF或ESI);d)測序。應記錄測定的雜質。應按照事先商定的預期用途提供足夠量的合成寡核苷酸。生產者應確認合成總量符合用戶要求。應記錄協(xié)商的合成寡核苷酸的總量。寡核苷酸濃度的測量可作為生產或產品測試(檢查)過程中質量控制的一部分。吸光度可用來測量溶液中寡核苷酸的濃度。通常，使用260nm處的吸光度。物質的量濃度是根據摩爾消光系數和OD值公式(C.1)計算的，摩爾消光系數的參數見附錄C。由于在計算摩爾消光系數時使用了不同的假設，摩爾消光系數數據(包括使用的假設)均應被記錄。其他方法，如高效液相色譜法，使用寡核苷酸參考物質或有證標準物質/有證標準樣品(如果適用),在證明與光密度的相關性后，也可用于測量濃度。應記錄測量的濃度。質量應以納克(ng)或可溯源至SI單位的形式記錄。質量通過公式(1)來計算：OD?so——260nm處的吸光度；V?——液體體積，單位為毫升(mL);C——換算系數，單位為納克每毫升(ng/mL);D——稀釋因子。8.5摩爾質量和/或堿基長度應檢測并記錄合成寡核苷酸的摩爾質量和/或堿基長度。摩爾質量可用質譜(包括ESI或MALDI作為離子源，ToF、MS作為質量分析儀)直接測定，也可通過平板電泳儀或毛細管電泳儀間接測定。應由有資質的人員進行確認，并保留記錄。質譜法是一種測量分子量的方法。使用質譜時，合成寡核苷酸的摩爾質量可按公式(2)計算：6M={[(#dA×313.20)+(#dC×289.17)+(#dG×329.19)+(#dT×304.18)+(#dU×290.16)+(#I×314.18)+(#rA×329.19)+(#rC×305.17)+(#rG×345.19)+(#rU×306.15)]+(#rI×330.18)-62}+1 (2)M——摩爾質量，單位為克每摩爾(g/mol);#dA——腺嘌呤(脫氧核糖核酸)的數量；#dC——胞嘧啶(脫氧核糖核酸)的數量；#dG——鳥嘌呤(脫氧核糖核酸)的數量；#dT——胸腺嘧啶(脫氧核糖核酸)的數量；#dU——尿嘧啶(脫氧核糖核酸)的數量；#J肌苷(脫氧核糖核酸)的數量；#rA——腺嘌呤(核糖核酸)的數量；#rC——胞嘌呤(核糖核酸)的數量；#rG——鳥嘌呤(核糖核酸)的數量；#rU——尿嘌呤(核糖核酸)的數量；#rl——肌苷(核糖核酸)的數量。注1:更多信息見參考文獻以及C.1和表C.1。注2:公式(2)能用于計算基于3’端修飾的磷酸的摩爾質量。使用不同的公式時，應予以記錄。修飾的寡核苷酸的摩爾質量可由C.2中所示修飾化合物的摩爾質量來計算。8.6退火溫度Tm值可通過附錄F中的公式(F.1)計算。計算時應記錄T。值。合成寡核苷酸的報告單，應包括但不限于以下內容：a)產品標識；b)產品批號：——生產過程和質量控制可追溯；c)訂單的使用者；d)純化方法；e)寡核苷酸序列：——描述應采用IUPAC代碼的形式，示例見附錄C;f)摩爾質量；注1:見公式(2)。原則上，寡核苷酸部分的摩爾質量不包括帶有連接臂的修飾物，并且不包含5’端的磷酸基團。g)用于計算摩爾質量的公式；注2:OD是一種廣泛使用的寡核苷酸量的表達。注3:見8.4.3。i)摩爾消光系數數據，包括假定的數據；注4:見公式(C.1)。j)總摩爾數；注5:根據表C.1中所示的吸光度指數和附錄C中描述的公式(C.1)計算該值。7k)退火溫度；1)鳥嘌呤胞嘧啶(GC)含量；m)推薦(例如特定的緩沖液，包括TE緩沖液)用于稀釋合成寡核苷酸的溶液；n)有效期：——有效期應根據經驗確定，——可根據類似寡核苷酸穩(wěn)定性研究的結果估計保質期；注6:例如，干粉在4℃下的典型保質期為兩年，溶液在一20℃下經典保質期為1年。o)儲存條件：——儲存條件應根據經驗確定，——可根據類似寡核苷酸穩(wěn)定性研究的結果，確定儲存條件；注7:原則上，干粉儲存在4℃,溶液儲存在一20℃,但能根據用戶和生產者之間的協(xié)議使用不同的溫度范圍。p)運輸條件8.8糾正措施和改進建議質量管理體系應采取糾正措施消除包括不合格和顧客對產品的投訴等問題的原因。當發(fā)現(xiàn)產品有問題需要改進時，宜考慮采取適當的糾正措施。質量管理體系應保存糾正措施或改進的記錄。質量管理體系應定期審查糾正措施和改進的情況。9合成寡核苷酸(RNA)的附加要求第4章～第8章所述的質量管理要求也應適用于合成RNA。此外，由于RNA易被酶降解，以下附加要求也適用于RNA。a)應使用經消毒的無核酸酶的器具，如容器或吸頭。b)生產用純水或緩沖溶液應由受控過的純水系統(tǒng)制成。應定期檢查所采用的純水系統(tǒng)制備的水的電導率。試劑應在受控條件下在適當的設施中制備，以避免核酸酶的污染。此外，對于干粉狀態(tài)的產品，應在打開密封容器后立即使用。試劑應在干粉的狀態(tài)下運輸。當產品以溶液形式運輸和儲存時，應保持冷凍狀態(tài)運輸，且儲存在一80℃中。8(資料性)工藝過程檢查表表A.1工藝過程檢查表流程要求一致性章節(jié)合格不合格不適用文件和章節(jié)訂單接收過程生產編號客戶信息序列信息修飾純化方法訂單接收日期/交貨期訂單接收負責人產量生產過程設備管理合成合成負責人純化純化負責人定量測量定量測量負責人質量控制過程質量控制設備控制質量控制負責人報告編寫報告編寫負責人運輸過程運輸負責人通用要求質量經理培訓/資質法律要求糾正措施文件控制記錄控制9(資料性)設備和裝置清單及其控制標準清單設備和裝置清單及其控制標準示例見表B.1。表B.1設備和裝置清單及其控制標準裝置類型規(guī)格預期用途要求檢查頻率溫控設備(培養(yǎng)箱、冰箱、冷凍機等)儲存試劑溫度穩(wěn)定性和均勻性安裝時、安裝后每兩年，以及維修后溫度檢查每天純水生產系統(tǒng)質量控制電導率檢查每周試劑制備至少使用兩種質量合格的可溯源的緩沖溶液進行校正每天或使用時稱重設備試劑制備零點確認和讀數檢查采用標準重量，或執(zhí)行內置性能檢查每天或使用時移液器試劑分配校準并檢查移液量的準確性定期*離心機離心運轉正常，無異常響聲使用時寡核苷酸合成儀能夠通過β-氰乙基亞磷酰胺法合成寡核苷酸的裝置1),2)寡核苷酸合成檢查閥門和試劑流量定期*自動移液系統(tǒng)自動移液工作站等試劑或合成寡核苷酸等的分液檢查移液量的準確性定期“高效液相色譜系統(tǒng)可安裝適當的色譜柱，配備可測量254nm～260nm的吸收波長的檢測器，可配置用于積分峰面積的記錄器和餾分收集器寡核苷酸純化檢查內置性能和色譜柱的有效性定期*電泳設備能夠在自然條件和變性條件下進行聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳的設備以及檢測設備，如紫外線燈確認堿基長度具有分離和檢測相應摩爾質量標記的能力定期*毛細管電泳系統(tǒng)能夠在自然或變性條件下分離合成寡核苷酸的裝置，并配有檢測器和記錄裝置，可對峰面積進行匯總確認堿基長度具有分離和檢測相應摩爾質量標記的能力定期4分光光度計單光束或雙光束分光光度計合成寡核苷酸的得量測定內置性能檢查定期合成寡核苷酸的得量測定用濾光片?進行校準定期*考慮正常使用方式及其頻率(見ISO9001或與組織質量管理體系相關的標準),確定檢驗頻率，以確保其適用于目的?！崩?，一種光學玻璃濾波器，它是為光譜光度計的校準而設計的。(資料性)摩爾質量和摩爾數的計算C.1計算摩爾質量和摩爾消光系數所需的信息計算摩爾質量(見8.5)和摩爾消光系數所需的信息見表C.1和表C.2。這里給出的信息是常見示例的部分列表，尤其是關于帶標簽的表單。合成寡核苷酸的摩爾數可用吸光度(用OD值表示)除以摩爾消光系數計算。pH為7.0和260nm時的摩爾消光系數可按式(C.1)計算：e=(#dA×15.2)+(#dC×7.4)+(#dG×11.8)+(#dT×8.8)+(#dU×10.1)十(#I×12.1)+(#rA×14.9)+(#rC×7.55)+(#rG×13.6)+(#rU×10)式中：e—-摩爾消光系數，單位為每負一次方摩爾厘米[1/(mol·cm)];#dA——腺嘌呤(脫氧核糖核酸)的數量；#dC——胞嘧啶(脫氧核糖核酸)的數量；#dG——鳥嘌呤(脫氧核糖核酸)的數量；#dT——胸腺嘧啶(脫氧核糖核酸)的數量；#dU——尿嘧啶(脫氧核糖核酸)的數量；#I——肌苷(脫氧核糖核酸)的數量；#rA——腺嘌呤(核糖核酸)的數量；#rC——胞嘌呤(核糖核酸)的數量；#rG——鳥嘌呤(核糖核酸)的數量；#rU——尿嘌呤(核糖核酸)的數量；#rl——肌苷(核糖核酸)的數量。如果8.7中有記錄和報告，則可使用不同的公式。IUPAC代碼摩爾質量*pH為7.0和260nm時的摩爾消光系數表C.1堿基分子的摩爾質量和摩爾消光系數(續(xù))摩爾質量pH為7.0和260nm時的摩爾消光系數l/(mol·cm)306.15I314.18330.18摩爾質量是水溶液中的摩爾質量。C.2計算摩爾質量和摩爾消光系數的附加參考位點修飾摩爾質量摩爾消光系數激發(fā)波長nm發(fā)射波長λnmAmino—Biotin ——3’3’3’Amino——3’——3’Thiol(beforereduction)3’3’ ——3’——3’N2-aminohexyldG3’3’3’—3’ —3’—3’(資料性)采用質量分析法驗證寡核苷酸序列本附錄提供了使用基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜儀(MALDI-ToF-MS)和電噴霧電離四極桿質譜儀(ESI-Q-MS)通過離子源離子化對寡核苷酸進行堿基序列分析的示例。D.2MALDI-ToF-MS實驗方案實驗方案如下：a)樣品前處理——將每種分析物溶解在純水中，使最終濃度為50pmol/μL。取1μL樣品溶液和0.5μL基質溶液點在MALDI板上。然后，將MALDI板風干，加載到裝置中，最后進行質譜分析。注：基質溶液為20mg/mL2,4-二羥基苯乙酮(DHAP)和70mmol檸檬酸二銨的50%乙腈溶液?！囼灄l件見表D.1。表D.1MALDI-ToFMS測試條件測試設備基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀特點光源：氮氣激光器(λ=337.1nm)加速電壓延遲提取針對m/z3000優(yōu)化飛行模式線性模式(陽離子檢測模式)測量范圍圖D.1合成寡核苷酸的質譜結果示例標引符號說明：X——質荷比；Y——強度。圖D.1合成寡核苷酸的質譜結果示例(續(xù))利用D.2中描述的條件，用MALDI-ToF-MS分析合成的寡核苷酸。使用原始分析軟件，圖D.1中所示的每個峰與寡核苷酸中指定位置的每個核苷酸相關。實驗方案如下：a)樣品前處理1)將每種分析物溶于純水中，終濃度為10pmol/μL。柱上的質量負荷保持恒定，上樣量為2)流動相A:15mmolTAE緩沖液，3)流動相B:15mmTAE緩沖液，400mmolHFIP的甲醇溶液。時間/min流速/(mL/min)A/%B/%081.026.581.021.081.0b)ESI-Q-MS測試條件(見表D.3)測試設備(液相色譜)超高效液相色譜法測試設備(檢測器)質譜儀色譜柱柱溫樣品溫度a)色譜圖b)原始質譜c)解卷積譜標引符號說明：X?——保留時間；X?——質量；Y——強度。解卷積后，得到質量為9064.5Da(+0.7Da)的母峰和一個相對強度小于6%的鈉(Na+)碎片峰，如D.4ESI-Q-MS/MS實驗方案實驗方案如下：a)樣品前處理1)本實驗采用21nt寡核苷酸(5'-UCGUCAAGCGAUUACAAGGTT-3’)(5pmol/μL水溶液)。2)流動相A:15mmolTAE緩沖液，400mmolHFIP制備的pH8.0的水溶液。3)流動相B:15mmolTAE緩沖液，400mmolHFIP的甲醇溶液。b)ESI-Q-MS/MS測試條件——測試條件見表D.4、表D.5和表D.6。時間/min流速/(mL/min)A/%B/%087.023.087.087.0測試設備(液相色譜)超高效液相色譜法測試設備(檢測器)Qtof質譜儀色譜柱柱溫樣品溫度質譜系統(tǒng)Qtof質譜儀數據質量范圍400Da-3000Da模式ESI負模式毛細管出口電壓震源偏移量源溫度霧化氣溫度霧化氣流速鎖定質量葡萄糖纖維蛋白肽B,100fmol/μL,50-50H?O-CAN,0.1%FA采用D.4中描述的條件，用ESI-Q-MS/MS分析合成的寡核苷酸。實驗使用M4-峰[在圖D.3,a中圈出的]作為母離子進行。子離子的分配是通過簡單的計算與理論質量相匹配來y?y?標引符號說明：X——質量；Y——強度。圖D.3合成寡核苷酸的質譜(ESI-Q-MS/(資料性)采用有證標準物質/有證標準樣品對測量儀器進行校準——示例E.1總則標準物質/標準樣品可用于合成寡核苷酸測量儀器準確度的校準。本附錄描述了示例。E.2DNA濃度測量根據a)～c)測量DNA標準物質/標準樣品的濃度，分光光度計獲得結果(見表E.l)。這些結果可用于分光光度計的準確度評估。a)采用的標準物質/標準樣品：——采用標準物質/標準樣品(CRM6203-a)。b)測量儀器：分光光度計；c)操作步驟：2)選擇測量模式，3)將波長設置為260nm,4)將無核酸酶的水作為參比，加入比色皿中，5)進行校準，6)將樣品裝入另一個比色皿中，將樣品留在比色皿中進行3次測量，并記錄吸光度值，表E.1DNA濃度測量示例標準物質/標準樣品測量值認證機構建議值OD2so濃度/(ng/μL)標準值/(ng/μL)擴展不確定度/(ng/μL)CRM6203-a-A0.1241CRM6203-a-G0.1398CRM6203-a-T0.1146注：截至2017年6月，CRM6203系列尚未銷售。不過，后續(xù)產品CRM6205系列已上市。此表中的數據等同于CRM6205系列。E.3RNA濃度的測量——例1根據a)～c)測量RNA標準物質/標準樣品的濃度，分光光度計獲得結果(見表E.2)。結果可用于分光光度計的準確度評估。a)標準物質/標準樣品。b)測量儀器：分光光度計。c)操作步驟：1)打開設備(自動校準開始);3)將波長設置為260nm,模式設置為“吸光度”;4)將不含核酸酶的水作為參比物，加入比色皿中；5)按“0A/100%T”進行自動校準；6)將樣品裝入另一個比色皿，然后按測量鍵。將樣品留在比色皿中進行3次測量，并記錄吸光度值；7)根據吸光度、摩爾消光系數、堿基組成和OD值，計算RNA濃度(摩爾消光系數見附錄C)。標準物質/標準樣品測量值認證機構建議值A260濃度/(ng/μL)標準值/(ng/μL)擴展不確定度/(ng/μL)CRM6204500-ACRM6204500-BE.4RNA濃度的測量——例2RNA標準物質/標準樣品濃度測量的另一個例子如下(見表E.3)。結果可用于分光光度計的準確度評估。a)標準物質/標準樣品。注：采用RNA標準物質/標準樣品(CRM6204-a)。b)測量儀器：分光光度計。2)選擇“RNA”作為測量對象，加入2μL水，然后進行空白測量；3)擦拭測量孔，取2μL樣品，進行測量；記錄260nm處的吸光度值和RNA濃度，取3次測量表E.3RNA濃度測量示例標準物質/標準樣品測量值認證機構建議值A260濃度/(ng/μL)標準值/(ng/μL)擴展不確定度/(ng/μL)CRM6204500-C0.949CRM62041000-A69.44.9CRM62041000-B69.8GB/T43629.1—2023/ISO206(資料性)T值的計算方法F.1總則本附錄描述了T。值的計算方法。F.2算法選擇示例合成核苷酸T。值計算的算法選擇模式示例如圖F.1所示。Wallace規(guī)則如果Tm<20℃,Wallace規(guī)則重新計算合成核酸最近鄰算法如果20℃<Tm<80完成如果80℃<Tm,重新計算GC%法標記或報告圖F.1算法選擇當使用最近鄰算法計算的T。值小于20℃(<20℃)時，用Wallace規(guī)則重新計算。當使用最近鄰算法計算的Tm值等于或大于80℃(≥80℃)時，使用GC%法進行重新計算。F.3最近鄰算法△H——雜化物的最近鄰焓變化之和，單位為千卡每摩爾(kcal/mol)1(見表F.1);-10.8——△S(起始常數),單位為卡路里每摩爾開爾文[cal/(mol·K)];△S——雜交子的最近鄰熵變之和，單位為卡路里每摩爾開爾文[cal/(mol·K)](見表F.1);R——氣體常數，值為1.987,單位為卡路里每千卡摩爾[cal/(K·mol)];[Na+]——Na+的摩爾濃度，單位為摩爾每升(mol/L)(標準值設為50mmol/L)。1)kcal為非法定計量單位，1kcal=4.19kJ。GB/T43629.1—2023/ISO20688-1:2020相互作用“kcal/molcal/(mol·K)AA/TT—9.1-24AT/TA一8.6—23.9TA/AT-6-16.9CA/GT-5.8—12.9GT/CA一6.5—17.3CT/GA-7.8—20.8GA/CT—5.6—13.5CG/GC—11.9—27.8GC/CG—11.1—26.7GG/CC-11—26.65’→3’3’-5’AT/TA例如，AC(5’→3’)的△H為一6.5kcal/mol,對應于GT/CA的值。F.4Wallace規(guī)則公式(F.2)如下：式中：Tm=2×(A+T)+4×(G+C)A,T,C,G——每種核苷酸的數目。F.5%GCmethod氣相色譜法[Na+]——Na+的物質的量濃度，單位為摩爾每升(mol/L,標準值設為50mmol/L);Xg,Xc——G和C的摩爾分數；L——促成雙鏈形成的核苷酸數；F——甲酰胺的物質的量濃度(標準值設為0)。|ISOGuide30Referencematerials—Selecte[5]ISO/IEC17025Getories[6]ISO24276:2006Foodstuffs—Methodsofanorgani