毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)

關(guān)于毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)引言以科學(xué)研究為目的而進(jìn)行科學(xué)飼養(yǎng)繁殖的動(dòng)物稱為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)作為在現(xiàn)代科學(xué)帶動(dòng)崛起的一門以生命科學(xué)為主體，以醫(yī)學(xué)、生物為核心的綜合性獨(dú)立的新興學(xué)科，正以嶄新的面貌，異乎尋常的速度，影響著整個(gè)生命科學(xué)各領(lǐng)域，成為生命科學(xué)研究的奠基學(xué)科和重要支撐條件，因而受到世界各國政府和科學(xué)家的重視，甚至作為衡量一個(gè)國家生物科學(xué)水平高低的標(biāo)志之一。第2頁,共98頁，2024年2月25日，星期天食品毒理學(xué)的很多研究工作需要通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行。使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行科研的優(yōu)點(diǎn)是花費(fèi)人力、物力較少，時(shí)間短，易發(fā)現(xiàn)單因素與結(jié)果的關(guān)系，能提供大量有價(jià)值的可與人類生命活動(dòng)現(xiàn)象相類比的資料。在毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中，健康的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是保證工作順利進(jìn)行和獲得正確可靠的研究結(jié)果的重要條件。第3頁,共98頁，2024年2月25日，星期天食品毒理學(xué)研究外源化學(xué)物對(duì)于機(jī)體(特別是人體)的有害作用及其機(jī)制。食品毒理學(xué)研究的主要手段是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)試驗(yàn)是以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為模型，最終目的是通過外源化學(xué)物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒性反應(yīng)，向人(原型)外推，以期評(píng)估外源化學(xué)物對(duì)人的危害及危險(xiǎn)性。體外實(shí)驗(yàn)主要用于篩選和預(yù)測(cè)急性毒性和機(jī)制研究；人體實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)調(diào)查則可進(jìn)一步深化和證實(shí)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中所得到的資料。實(shí)際上，食品毒理學(xué)作為一門實(shí)驗(yàn)科學(xué)是以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為中心的，食品毒理學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)、實(shí)施、結(jié)果觀察和評(píng)價(jià)是毒理學(xué)研究的基本方法。第4頁,共98頁，2024年2月25日，星期天食品毒理學(xué)試驗(yàn)是對(duì)化學(xué)物安全性評(píng)價(jià)的主要手段，已為各國際組織或各國的行政部門所頒布的規(guī)程或指南列為常規(guī)試驗(yàn)，又稱為法規(guī)毒理學(xué)試驗(yàn)(regulatorytoxico1ogytest)，這類毒理學(xué)試驗(yàn)是以篩查和描述外來化學(xué)物的毒性為目的，屬于描述毒理學(xué)范疇。第5頁,共98頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)食品毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的原則和局限性一、食品毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的原則在毒理學(xué)的試驗(yàn)中，有三個(gè)基本的原則。第一個(gè)原則，化學(xué)物在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生的作用，可以外推于人?；炯僭O(shè)為：①人是最敏感的動(dòng)物物種；②人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生物學(xué)過程包括化學(xué)物的代謝，與體重(或體表面積)相關(guān)。這兩個(gè)假設(shè)也是全部實(shí)驗(yàn)生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的前提。第6頁,共98頁，2024年2月25日，星期天以單位體表面積計(jì)算在人產(chǎn)生毒作用的劑量和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物通常相近似。而以體重計(jì)算則人通常比實(shí)驗(yàn)動(dòng)物敏感，差別可能達(dá)10倍。因此可以利用安全系數(shù)來計(jì)算人的相對(duì)安全劑量。已知人致癌物都對(duì)某種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有致癌性；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物致癌物是否都對(duì)人有致癌性，還不清楚，但這已作為動(dòng)物致癌試驗(yàn)的基礎(chǔ)。一般認(rèn)為，如果某一化學(xué)物對(duì)幾個(gè)物種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒性是相同的，則人的反應(yīng)也可能是相似的。第7頁,共98頁，2024年2月25日，星期天第二個(gè)原則是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須暴露于高劑量，這是發(fā)現(xiàn)對(duì)人潛在危害的必需的和可靠的方法。此原則是根據(jù)質(zhì)反應(yīng)的概念，隨劑量或暴露增加，群體中效應(yīng)發(fā)生率增加。毒理學(xué)試驗(yàn)中，一般要設(shè)3個(gè)或3個(gè)以上劑量組，以觀察劑量-反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系，確定受試化學(xué)物引起毒效應(yīng)及其毒性參數(shù)。毒性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)并不是為了證明化學(xué)品的安全性，而是為了說明化學(xué)品可能產(chǎn)生的毒作用。第8頁,共98頁，2024年2月25日，星期天僅僅檢測(cè)受試化學(xué)物在人的暴露劑量是否引起毒效應(yīng)是不夠的。當(dāng)引起毒效應(yīng)的最低劑量(LOAEL)與人的暴露劑量接近時(shí)，說明該化學(xué)物不安全。當(dāng)該劑量與人的暴露劑量有很大的距離(幾十倍，幾百倍或以上)，才認(rèn)為具有一定安全性，此距離越大，安全性越可靠。如果在研究中所用的一系列的劑量不能引起毒性效應(yīng)，則認(rèn)為所用劑量還不足夠高，應(yīng)增加劑量，以確定受試化學(xué)品的毒性。但如果在試驗(yàn)的最高劑量組的劑量與人可能的暴露劑量有足夠的安全界限，則對(duì)于安全性評(píng)價(jià)來說未觀察到毒效應(yīng)的研究是可以接受的。第9頁,共98頁，2024年2月25日，星期天在毒理學(xué)試驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ退璧膭?dòng)物總是遠(yuǎn)少于處于危險(xiǎn)中的人群。為了在少量動(dòng)物得到有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的可靠的結(jié)果，需要應(yīng)用相對(duì)較高的劑量，以使效應(yīng)發(fā)生的頻率足以檢測(cè)。例如，低達(dá)0.01％的癌癥發(fā)生率，這意味著在100萬人群中有100人發(fā)生癌癥，此發(fā)生率太高，不能為公眾接受。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物直接檢測(cè)如此低發(fā)生率將至少需要30000只動(dòng)物。因此，別無選擇，在毒理學(xué)試驗(yàn)中，對(duì)相對(duì)較少的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須以較高劑量進(jìn)行試驗(yàn)，然后根據(jù)毒理學(xué)原則外推估計(jì)低劑量暴露的危險(xiǎn)性。第10頁,共98頁，2024年2月25日，星期天第三個(gè)原則，成年的健康(雄性和雌性未孕)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人可能的暴露途徑是基本的選擇。選用成年的健康(雄性和雌性未孕)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是為了使實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有代表性和可重復(fù)性。以成年的健康(雄性和雌性未孕)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物作為一般人群的代表性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，而將幼年和老年?dòng)物、妊娠的雌性動(dòng)物、疾病狀態(tài)作為特殊情況另作研究。這樣可降低實(shí)驗(yàn)對(duì)象的多樣性，減少實(shí)驗(yàn)誤差。第11頁,共98頁，2024年2月25日，星期天毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的敏感性取決于受試物處理引起毒效應(yīng)強(qiáng)度和實(shí)驗(yàn)誤差兩個(gè)因素，處理引起的毒效應(yīng)強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)誤差小，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果的敏感性增加，反映受試物處理的真實(shí)效應(yīng)，反之亦然。在下文所述的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是要規(guī)定實(shí)驗(yàn)條件，嚴(yán)格控制可能影響毒效應(yīng)的各種因素，實(shí)施質(zhì)量保證，降低實(shí)驗(yàn)誤差。只有這樣，才能保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，不能重復(fù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是沒有任何科學(xué)價(jià)值的。外源化學(xué)物以不同途徑染毒，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物表現(xiàn)的毒性可能有很大差異，這是由于因染毒部位解剖生理特點(diǎn)不同，外源化學(xué)物吸收進(jìn)入血液的速度和量也不同，首先到達(dá)的器官和組織也不同。因此，毒理學(xué)試驗(yàn)中染毒途徑的選擇，應(yīng)盡可能模擬人接觸該受試物的方式。

第12頁,共98頁，2024年2月25日，星期天二、食品毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的局限性歷史上，環(huán)境污染物及某些藥物所引起的中毒和死亡多次發(fā)生，引起各國的重視，推動(dòng)了毒理學(xué)的發(fā)展，各國政府主管部門制訂和多次修訂了有關(guān)藥品和各種化學(xué)品安全性評(píng)價(jià)的規(guī)范或準(zhǔn)則，希望在嚙齒類和非嚙齒類的毒理學(xué)研究能為有關(guān)候選新藥和各種化學(xué)品提供安全性證據(jù)，但以動(dòng)物的資料預(yù)測(cè)人的毒性的預(yù)測(cè)價(jià)值尚有待于研究。第13頁,共98頁，2024年2月25日，星期天Lumley(1990)和Igarashi(1994)根據(jù)有限的臨床資料報(bào)告，發(fā)現(xiàn)對(duì)人的毒性約一半不能由臨床前(動(dòng)物)毒性研究預(yù)測(cè)。Heywood(1983)報(bào)告27個(gè)化學(xué)物(大多為藥品)的靶器官毒性在大鼠和狗(或猴)之間的相符率僅20％。Olson等(1998)報(bào)告131種化學(xué)物對(duì)動(dòng)物的毒性與人的毒性相符率，嚙齒類為6％，非嚙齒類(狗和猴)為28％，合并達(dá)36％，所有的物種相符率可達(dá)69％。第14頁,共98頁，2024年2月25日，星期天按照目前的規(guī)范，進(jìn)行毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)，可以在一定程度上提高新藥和各種化學(xué)品的使用安全性，但仍不能完全排除對(duì)人健康危害的風(fēng)險(xiǎn)。WHO在《臨床前藥物安全性實(shí)驗(yàn)原則》的文件中指出“雖然事先對(duì)生物活性物質(zhì)進(jìn)行了最仔細(xì)徹底的研究，但給人使用時(shí)總是不可避免地要冒一定的風(fēng)險(xiǎn)。”這就是利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的局限性，即動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果外推到人的不確定性。第15頁,共98頁，2024年2月25日，星期天用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)資料外推到人群接觸的安全性時(shí)，會(huì)有很大的不確定性。這是因?yàn)椋庠椿瘜W(xué)物的毒性作用受到許多因素的影響。第16頁,共98頁，2024年2月25日，星期天首先，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人對(duì)外源化學(xué)物的反應(yīng)敏感性不同，有時(shí)甚至存在著質(zhì)的差別。雖然在毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中通過用兩種或兩種以上的動(dòng)物，并盡可能選擇與人對(duì)毒物反應(yīng)相似的動(dòng)物，但要完全避免物種差異是不可能的。而且，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不能述說涉及主觀感覺的毒效應(yīng)，如疼痛、腹脹、疲乏、頭暈、眼花、耳鳴等，這些毒效應(yīng)就難以或不可能發(fā)現(xiàn)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，可觀察到體征(sign)，而沒有癥狀(symptom)。第17頁,共98頁，2024年2月25日，星期天第二，在毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中，為了尋求毒作用的靶器官，并能在相對(duì)少量的動(dòng)物上就能得到劑量-反應(yīng)或劑量-效應(yīng)關(guān)系，往往選用較大的染毒劑量，這一劑量通常要比人實(shí)際接觸的劑量大得多。有些化學(xué)物在高劑量和低劑量的毒性作用規(guī)律并不一定一致，如大劑量下出現(xiàn)的反應(yīng)有可能是由于化學(xué)物在體內(nèi)超過了機(jī)體的代謝能力，這就存在高劑量向低劑量外推的不確定性。第18頁,共98頁，2024年2月25日，星期天第三，毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物數(shù)量有限，那些發(fā)生率很低的毒性反應(yīng)，在少量動(dòng)物中難以發(fā)現(xiàn)。而化學(xué)物一旦進(jìn)入市場，接觸人群往往會(huì)很大。這就存在小數(shù)量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物到大量人群外推的不確定性。第19頁,共98頁，2024年2月25日，星期天第四，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般都是實(shí)驗(yàn)室培育的品系，一般選用成年健康動(dòng)物，反應(yīng)較單一，而接觸人群可以是不同的人種、種族，而且包括年老體弱及患病的個(gè)體，在對(duì)外源化學(xué)物毒性反應(yīng)的易感性上存在很大差異。以上這些都構(gòu)成了從毒理學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果向人群安全性評(píng)價(jià)外推時(shí)的不確定因素。第20頁,共98頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)毒理學(xué)毒性評(píng)價(jià)試驗(yàn)的基本目的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的常規(guī)部分是毒性評(píng)價(jià)或安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)。為了對(duì)受試物的毒性進(jìn)行全面的測(cè)試，增強(qiáng)測(cè)試結(jié)果的可靠性，權(quán)威機(jī)構(gòu)規(guī)定了評(píng)價(jià)程序，以保證毒性評(píng)價(jià)研究可以達(dá)到普遍能接受的最低要求和原則。毒理學(xué)家認(rèn)為毒理學(xué)試驗(yàn)程序應(yīng)該有一定的靈活性。對(duì)毒理學(xué)試驗(yàn)的原理和設(shè)計(jì)思路的深入理解，有助于研究者對(duì)評(píng)價(jià)程序的實(shí)施，在發(fā)現(xiàn)新的現(xiàn)象或線索時(shí)，可進(jìn)行一些補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)來證實(shí)，并可進(jìn)一步研究其機(jī)制。第21頁,共98頁，2024年2月25日，星期天毒性評(píng)價(jià)或安全性評(píng)價(jià)方面的基本目的包括以下幾點(diǎn)：

1.受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)在急性和慢性毒性試驗(yàn)中，觀察受試物對(duì)機(jī)體的有害作用，對(duì)有害作用的觀察應(yīng)該是對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行全面的逐項(xiàng)的觀察和記錄。發(fā)現(xiàn)有害作用是進(jìn)行劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究的前提。第22頁,共98頁，2024年2月25日，星期天2.劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究是毒性評(píng)價(jià)和安全性評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)。通過對(duì)不同有害作用的劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究，可以得到該受試物的多種毒性參數(shù)。在急性(致死性)毒性試驗(yàn)中，應(yīng)該得到LD50，也可以得到LD01和MTD。在急性非致死性毒性試驗(yàn)中，應(yīng)該得到急性可觀察到有害作用的最低劑量(LOAEL)和未觀察到有害作用的劑量(NOAEL)。在亞急性、亞慢性及慢性毒性試驗(yàn)中，應(yīng)該得到相應(yīng)的LOAEL和NOAEL。在致突變、致癌和致畸等特殊毒性試驗(yàn)中，劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究將為確定受試物是否具有這些特殊毒性提供依據(jù)。在致畸試驗(yàn)也可得到LOAEL和NOAEL；在致突變、致癌試驗(yàn)中，盡管認(rèn)為是無閾值的，但也可得到表觀的LOAEL和NOAEL。第23頁,共98頁，2024年2月25日，星期天3.確定毒作用的靶器官。確定受試物有害作用的靶器官，是毒理學(xué)研究的重要目的，以闡明受試物毒作用的特點(diǎn)，并為進(jìn)一步的機(jī)制研究和毒性防治提供線索。4.確定損害的可逆性。一旦確認(rèn)有害作用存在，就應(yīng)研究停止接觸后該損害是否可逆和消失，器官和組織功能是否能恢復(fù)，還是像化學(xué)致癌作用那樣停止接觸后損害繼續(xù)發(fā)展?毒性的可逆性關(guān)系到對(duì)人的危害評(píng)價(jià)，如果受損的器官組織能夠修復(fù)并恢復(fù)正常功能，則可能接受較高危險(xiǎn)性的接觸水平。第24頁,共98頁，2024年2月25日，星期天當(dāng)然，毒理學(xué)研究還可能有其他的目的和要求，例如毒作用的敏感檢測(cè)指標(biāo)和生物學(xué)標(biāo)志、毒作用機(jī)制研究、受試物的毒物動(dòng)力學(xué)和代謝研究、中毒的解救措施等。對(duì)這些要求，應(yīng)擴(kuò)展常規(guī)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)以包括有關(guān)的項(xiàng)目，或者另外設(shè)計(jì)和進(jìn)行靶器官毒理學(xué)研究及機(jī)制毒理學(xué)研究。第25頁,共98頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇和處理毒理學(xué)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物作為研究對(duì)象的，為獲得可靠的研究結(jié)果，先決條件是正確地選用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。第26頁,共98頁，2024年2月25日，星期天一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物物種的選擇外源化學(xué)物的固有毒性往往在人和不同物種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之間表現(xiàn)不同，物種差別可以表現(xiàn)在量方面，引起毒性的劑量差別，即毒性大小的差別，如有報(bào)道，對(duì)人138種化學(xué)物的敏感性為大鼠的1.8～10.5倍。物種差別也可以表現(xiàn)在質(zhì)方面(毒性效應(yīng)的差別)，如除草劑百草枯(對(duì)草快)對(duì)人引起肺損傷，而對(duì)狗則未見到。因此，需要對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物物種進(jìn)行選擇。物種間毒性反應(yīng)差別的原因，可能歸納為解剖與生理學(xué)差異，遺傳與代謝的差異等。第27頁,共98頁，2024年2月25日，星期天對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物物種選擇的基本原則是：選擇對(duì)受試物在代謝、生物化學(xué)和毒理學(xué)特征與人最接近的物種；自然壽命不太長的物種；易于飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作的物種；經(jīng)濟(jì)并易于獲得的物種。在選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)存在固有的限制。可利用的物種不多，主要原因包括經(jīng)濟(jì)(購買和飼養(yǎng)的費(fèi)用)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的壽命、行為和生活能力、處置，以及對(duì)所研究的毒性的敏感性。要利用對(duì)受試物在代謝、生物化學(xué)和毒理學(xué)特征與人最接近的物種，這就需要了解實(shí)驗(yàn)動(dòng)物物種和人對(duì)受試化學(xué)物的吸收、生物轉(zhuǎn)化等資料，但這往往并不切合實(shí)際，因?yàn)槭紫刃枰M(jìn)行一系列的比較研究，而對(duì)人體的資料在動(dòng)物試驗(yàn)之前是很難得到的。第28頁,共98頁，2024年2月25日，星期天在毒理學(xué)研究中常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物物種如下：大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗。其他可能用到的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有地鼠、獼猴、小型豬、雞等。其中，大鼠、小鼠、豚鼠和地鼠為嚙齒目動(dòng)物。常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生物學(xué)和生理學(xué)參數(shù)見表5-1。第29頁,共98頁，2024年2月25日，星期天參數(shù)猴狗貓兔大鼠小鼠豚鼠地鼠成體體重(kg)3.514.03.33.70.450.0350.430.12壽命(a)161514631.531水消耗(ml/d)45035032030035614530飼料消耗(成本g/d)1504001001801051210成體代謝(cal／kgd)1588080110130600100250體溫(℃)38.838.938.639l438l237.438.638.0呼吸頻率50202553851609083(次／min)(40～60)(10～30)(20～30)(40～65)(65～110)(80～240)(70～100)(35～130)心率(次／min)200100120200328600300450血壓mmHg159／127148／100155／100110／80130/90120／7577/50108/77(收縮／舒張)出生體重(g)500～7001100～22001251005-61.575～1002.0表5-1常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生物學(xué)和生理學(xué)參數(shù)第30頁,共98頁，2024年2月25日，星期天斷乳時(shí)體重(g)440058003000100～150040～5010～1225035開眼(d)出生當(dāng)天8～128～121010～1211出生當(dāng)天15妊娠(d)16863633121206716性周期(d)282215～2815～164～54～516～194動(dòng)情期(d)1～27～139～19301111窩數(shù)量13～61～61～136～91～121～51～12斷乳年齡(周)16～2466～983～4323～4生殖年齡(月)549106～72～3232生殖期(年)10～155～1041～31131生殖季節(jié)任何時(shí)間春，秋冬季2～3個(gè)月任何時(shí)間任何時(shí)間任何時(shí)間任何時(shí)間任何時(shí)間所需面積(ft2)*68330.40.40.70.34環(huán)境溫度(℃)18～2818～2818～2818～2819～2519～2519～2519～25血容量(ML/Kg)7579605365807585凝血時(shí)間(s)90180120300601460143HCT(％紅細(xì)胞)4245404246414250Hb(g／bl)12.516.011.813.614.816.012.412.0*所需面積(ft2)，即為英尺，1ft＝30.48cm．第31頁,共98頁，2024年2月25日，星期天二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系的選擇品系(strain)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)的專用名詞，指用計(jì)劃交配的方法，獲得起源于共同祖先的一群動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按遺傳學(xué)控制分類可分為：第32頁,共98頁，2024年2月25日，星期天①近交系：指全同胞兄妹或親子之間連續(xù)交配20代以上而培育的純品系動(dòng)物。如小鼠有津白I、津白Ⅱ、615，DBA／1和DBA／2，BALB/C，C3H，C57B／6J，A和A／He等。②雜交群動(dòng)物(雜交1代，F(xiàn)1)，指兩個(gè)不同的近交系之間有目的進(jìn)行交配，所產(chǎn)生的第一代動(dòng)物。③封閉群：一個(gè)種群在五年以上不從外部引進(jìn)新血緣，僅由同一品系的動(dòng)物在固定場所隨機(jī)交配繁殖的動(dòng)物群。第33頁,共98頁，2024年2月25日，星期天如昆明種小鼠、NIH小鼠、LACA小鼠、F344大鼠、Wistar大鼠、SD(Sprague-Dauley)大鼠等。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳的均一性排序，近交系最高、雜交群次之、封閉群較低。不同品系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)外源化學(xué)物毒性反應(yīng)有差別，所以毒理學(xué)研究要選擇適宜的品系，對(duì)某種外源化學(xué)物毒理學(xué)系列研究中應(yīng)固定使用同一品系動(dòng)物，以求研究結(jié)果的穩(wěn)定性。第34頁,共98頁，2024年2月25日，星期天遺傳毒理學(xué)一般利用嚙齒類動(dòng)物，主要是小鼠或大鼠。如果有合適的理由，其他物種也可接受。有的文獻(xiàn)報(bào)告在小鼠骨髓微核試驗(yàn)MS／Ae品系比ddy，CD-1或BDF品系更敏感。但一般認(rèn)為還沒能證明某一品系對(duì)所有的遺傳毒性物質(zhì)比其他品系都敏感。在致癌試驗(yàn)中對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的品系有一定的要求，特別重視有關(guān)病理損害的自發(fā)發(fā)生率。例如，某些大鼠品系垂體腫瘤發(fā)生率高，則不適用于靶器官為內(nèi)分泌系統(tǒng)的毒性研究。又如B6C3F1雄小鼠肝腫瘤高發(fā)生率可能有礙于肝致癌反應(yīng)的檢測(cè)。第35頁,共98頁，2024年2月25日，星期天三、對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物控制的選擇按微生物控制分類，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為四級(jí)，見表5-2。對(duì)于毒性試驗(yàn)及毒理學(xué)研究應(yīng)盡可能使用二級(jí)(或二級(jí)以上)的動(dòng)物，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。第36頁,共98頁，2024年2月25日，星期天表5-2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物等級(jí)第37頁,共98頁，2024年2月25日，星期天四、個(gè)體選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)外來化學(xué)物的毒性反應(yīng)還存在個(gè)體差異，應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體選擇。

1.性別同一物種、同一品系的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌雄兩性通常對(duì)相同外源化學(xué)物毒性反應(yīng)類似但雌雄兩性對(duì)化學(xué)物的毒性敏感性上存在著差別。有文獻(xiàn)報(bào)道在149種外源化學(xué)物中雌雄敏感性比值小鼠平均為0.92，大鼠為0.88，這種差別表現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物性發(fā)育成熟開始，直至老年期。可見雌雄兩性動(dòng)物的性激素性質(zhì)和水平是關(guān)鍵因素。第38頁,共98頁，2024年2月25日，星期天如果已知不同性別的動(dòng)物對(duì)受試物敏感性不同，應(yīng)選擇敏感的性別。如對(duì)性別差異不清楚，則應(yīng)選用雌雄兩種性別。如實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)存在性別差異，則應(yīng)將不同性別動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別統(tǒng)計(jì)分析。第39頁,共98頁，2024年2月25日，星期天在遺傳毒理學(xué)體內(nèi)試驗(yàn)中，對(duì)性別的選擇有幾種意見：

(1)對(duì)單個(gè)物種應(yīng)用兩種性別。

(2)對(duì)單個(gè)物種應(yīng)用兩種性別，除非已在一個(gè)性別得到陽性反應(yīng)，就不必對(duì)另一種性別進(jìn)行試驗(yàn)。

(3)對(duì)單個(gè)物種應(yīng)用兩種性別，除非經(jīng)毒代動(dòng)力學(xué)研究證明受試物(和其代謝產(chǎn)物)在雄性和雌性無差別和／或如果在確定劑量的預(yù)試驗(yàn)證明有相等毒性。

(4)對(duì)單個(gè)物種常規(guī)用一種性別(雄性或雌性)，除非預(yù)期／證明存在性別差異。第40頁,共98頁，2024年2月25日，星期天2.年齡和體重

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同人類一樣，生命全程大體上可區(qū)分三個(gè)階段，即幼年期(從出生到性成熟之前)、成年期和老年期。在成年期，各種激素(包括性激素)、代謝酶都處于高峰穩(wěn)定期，并對(duì)外源化學(xué)物的毒性反應(yīng)差異較小，且有代表性。在幼年期和老年期，對(duì)外源化學(xué)物的生物轉(zhuǎn)運(yùn)和生物轉(zhuǎn)化，靶器官和受體的敏感性均與成年期不同。如有報(bào)道外源化學(xué)物對(duì)成年動(dòng)物的致死劑量(或LD50)與新生動(dòng)物比較，其比值在0.002～16之間，表明有的外源化學(xué)物對(duì)新生動(dòng)物毒性低，也有的毒性反應(yīng)強(qiáng)。第41頁,共98頁，2024年2月25日，星期天毒理學(xué)試驗(yàn)選用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡取決于試驗(yàn)的類型。急性試驗(yàn)一般選用成年動(dòng)物;慢性試驗(yàn)因?qū)嶒?yàn)周期長，應(yīng)選用較年幼的或初斷乳的動(dòng)物，以使實(shí)驗(yàn)周期能復(fù)蓋成年期。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡應(yīng)由其出生日期來定，但實(shí)際工作中常以動(dòng)物的體重粗略地判斷動(dòng)物的年齡，作為挑選適齡動(dòng)物的依據(jù)。同一試驗(yàn)中，組內(nèi)個(gè)體間體重差異應(yīng)小于10％，各組間平均體重差異不應(yīng)超過5％。第42頁,共98頁，2024年2月25日，星期天3.生理狀態(tài)在毒理學(xué)試驗(yàn)中動(dòng)物如出現(xiàn)妊娠，則影響體重及其他指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果，并且，性激素對(duì)外源化學(xué)物代謝轉(zhuǎn)化有影響，故應(yīng)選用未產(chǎn)未孕的雌性動(dòng)物。雌雄動(dòng)物應(yīng)分籠飼養(yǎng)。但在某些試驗(yàn)如顯性致死試驗(yàn)、致畸試驗(yàn)及繁殖試驗(yàn)等，則需有計(jì)劃地合籠交配。第43頁,共98頁，2024年2月25日，星期天4.健康狀況實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康狀態(tài)對(duì)毒理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果有很大的影響，因此應(yīng)選用健康動(dòng)物。健康動(dòng)物應(yīng)發(fā)育正常、體形健壯，無外觀畸形，被毛濃密、有光澤、順貼而不蓬亂，行動(dòng)靈活、反應(yīng)敏捷，眼睛明亮有神，表皮無潰瘍和結(jié)痂，天然孔道干凈無分泌物等。第44頁,共98頁，2024年2月25日，星期天為確保選擇健康動(dòng)物，一般在實(shí)驗(yàn)前觀察5～7天。對(duì)于大鼠和狗的亞慢性和慢性試驗(yàn)，可在實(shí)驗(yàn)前采血進(jìn)行血液學(xué)和血液生化學(xué)檢查，異常的動(dòng)物應(yīng)剔除。合理的全營養(yǎng)飼料對(duì)維持實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康和正常的生理活動(dòng)是至關(guān)重要的。高溫與低溫時(shí)外源化學(xué)物的毒性一般比常溫為高。這種毒性變化可能是由于溫度影響了毒物動(dòng)力學(xué)所致。高溫、高濕環(huán)境共存時(shí)皮膚更易于外源化學(xué)物經(jīng)皮膚吸收。第45頁,共98頁，2024年2月25日，星期天人工晝夜周期，即，使動(dòng)物處于人工調(diào)控的12小時(shí)白晝(早6點(diǎn)至晚6點(diǎn))及12小時(shí)黑夜(晚6點(diǎn)至次日早6點(diǎn))，以穩(wěn)定其生物時(shí)間節(jié)律。正常、健康的動(dòng)物每天24小時(shí)的生理規(guī)律不盡相同，即存在著生物時(shí)間節(jié)律，對(duì)外源化學(xué)物的毒性反應(yīng)也有晝夜性時(shí)間變化，因此出現(xiàn)毒理學(xué)新的分支學(xué)科，稱為時(shí)間毒理學(xué)(Chronotoxicology)。由于動(dòng)物存在時(shí)間節(jié)律，外源化學(xué)物在不同時(shí)間表現(xiàn)的毒性反應(yīng)有差別，所以在毒理學(xué)實(shí)際工作中，尤其是進(jìn)行亞慢性和慢性染毒時(shí)，每日的染毒時(shí)間應(yīng)固定一致，以防止出現(xiàn)時(shí)間毒性的影響。而且采取動(dòng)物生物樣品(如血、尿等)進(jìn)行各種指標(biāo)的化驗(yàn)或一些生理功能的檢查(如血壓、體溫等)也應(yīng)固定時(shí)間。第46頁,共98頁，2024年2月25日，星期天根據(jù)我國的法規(guī)和有關(guān)規(guī)定，國家實(shí)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量監(jiān)督和質(zhì)量合格證制度。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的保種、飼育、供應(yīng)和應(yīng)用單位，由各級(jí)醫(yī)學(xué)動(dòng)物管理委員會(huì)進(jìn)行定期監(jiān)督、監(jiān)測(cè)，并頒發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)設(shè)施的合格證書(有效期5年)。應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須有完整的資料。進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的人員應(yīng)經(jīng)培訓(xùn)，取得資格認(rèn)可(上崗證)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)設(shè)施、環(huán)境條件及飼料等必須符合有關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)。第47頁,共98頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)食品毒理學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)要點(diǎn)一、體內(nèi)毒理學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.劑量分組在毒理學(xué)試驗(yàn)中，最重要的就是研究劑量-反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系，也就是當(dāng)外源化學(xué)物染毒劑量增加，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒性反應(yīng)(效應(yīng))隨之而增強(qiáng)。劑量-反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系的存在是確定外源化學(xué)物與有害作用的因果關(guān)系的重要依據(jù)，也可證明實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。因此，在毒理學(xué)試驗(yàn)中，一般至少要設(shè)3個(gè)劑量組(即高劑量組、中劑量組、低劑量組)，希望能得到滿意的劑量-反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系。第48頁,共98頁，2024年2月25日，星期天一般要求，高劑量組應(yīng)出現(xiàn)明確的有害作用，或者高劑量組劑量已達(dá)到染毒的極限劑量(如大鼠或小鼠灌胃或注射的最大容量)。低劑量組應(yīng)不出現(xiàn)任何可觀察到的有害作用(即相當(dāng)于NOAEL)，但低劑量組劑量應(yīng)當(dāng)高于人可能的接觸劑量，至少等于人可能的接觸劑量。中劑量組的劑量介于高劑量組和低劑量組之間，應(yīng)出現(xiàn)輕微的毒性效應(yīng)(即相當(dāng)于LOAEL)。高、中、低劑量組劑量一般按等比例計(jì)算，劑量間距應(yīng)為2或

，低劑量組劑量一般為高劑量組劑量的1/10～1/20。第49頁,共98頁，2024年2月25日，星期天毒理學(xué)試驗(yàn)常用的對(duì)照有4種：

(1)未處理對(duì)照組(以前有稱為空白對(duì)照組)：即對(duì)照組不施加任何處理因素，不給受試物也不給以相應(yīng)的操作。未處理對(duì)照組往往用于遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)中，確定指示生物的生物學(xué)特征的本底值，進(jìn)行質(zhì)量控制。第50頁,共98頁，2024年2月25日，星期天(2)陰性對(duì)照：不給處理因素但給以必須的實(shí)驗(yàn)因素(溶劑／賦形劑)，以排除此實(shí)驗(yàn)因素(溶劑／賦形劑)的影響，陰性對(duì)照作為與染毒組比較的基礎(chǔ)。沒有陰性對(duì)照組就不能說明受試物染毒與有害作用之間的關(guān)系。例如，在實(shí)驗(yàn)中，染毒各劑量組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)某些異常、甚至死亡；如果陰性對(duì)照組沒有發(fā)現(xiàn)異常，我們可以認(rèn)為此種異常和死亡是由于受試物的毒作用；如果陰性對(duì)照組也出現(xiàn)同樣的異常和死亡，則應(yīng)考慮是由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物患某種傳染病或其他非實(shí)驗(yàn)因素所致，必須重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。液體制劑中的防腐劑、抗氧劑、矯味劑、芳香劑、助溶劑、乳化劑、增溶劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、著色劑等均可稱為賦形劑。

第51頁,共98頁，2024年2月25日，星期天(3)陽性對(duì)照：用已知的陽性物(如致突變物)檢測(cè)試驗(yàn)體系的有效性。陽性對(duì)照組最好與受試物用相同的溶劑、染毒途徑及采樣時(shí)間。在遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)、致畸試驗(yàn)和致癌試驗(yàn)中都使用了陽性對(duì)照組，陽性對(duì)照組是用已知的致突變物、致畸物或致癌物染毒，應(yīng)該得到肯定的陽性結(jié)果(即致突變性、致畸性或致癌性)。這是由于這些試驗(yàn)，特別是遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)的變異較大，為了進(jìn)行質(zhì)量控制而設(shè)置陽性對(duì)照組。當(dāng)同時(shí)進(jìn)行的陰性(溶劑／賦形劑)對(duì)照組不能得到陰性結(jié)果，陽性對(duì)照組不能得到陽性結(jié)果，說明此次實(shí)驗(yàn)質(zhì)量有問題，全部數(shù)據(jù)無效，必須重新實(shí)驗(yàn)。在遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)中，陽性對(duì)照與受試物應(yīng)該用同樣的途徑和溶劑／賦形劑，但如有困難，則不同的染毒途徑、不同溶劑／賦形劑也可以接受。第52頁,共98頁，2024年2月25日，星期天(4)歷史性對(duì)照：由本實(shí)驗(yàn)室過去多次實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組數(shù)據(jù)組成，上述三種對(duì)照都可構(gòu)成相應(yīng)的歷史對(duì)照。歷史對(duì)照的最好用途是通過同質(zhì)性檢驗(yàn)檢查試驗(yàn)體系的穩(wěn)定性，即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和保證。由于實(shí)驗(yàn)毒理學(xué)的各種參數(shù)至今尚沒有公認(rèn)的參考值，因此歷史性對(duì)照均值及其范圍在評(píng)價(jià)研究結(jié)果時(shí)至為重要。第53頁,共98頁，2024年2月25日，星期天以上所述適用于大多數(shù)的毒理學(xué)體內(nèi)試驗(yàn)。在急性毒性試驗(yàn)測(cè)定LD50或LC50時(shí)，劑量組數(shù)根據(jù)選用的設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法而定，可以是4組，也可以是5～7組。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，希望所設(shè)計(jì)的中間劑量組的劑量與最后得到的LD50(LC50)接近。由于急性毒性試驗(yàn)的觀察指標(biāo)是死亡，并伴有嚴(yán)重的中毒癥狀，對(duì)于有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)者可以不設(shè)陰性對(duì)照組。當(dāng)然，如果使用了一種不常用的溶劑或者要測(cè)定某種其他的參數(shù)如MTD、急性LOAEL和NOAEL，則需要設(shè)置陰性對(duì)照組。第54頁,共98頁，2024年2月25日，星期天2.各組動(dòng)物數(shù)毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)各組動(dòng)物數(shù)取決于很多因素，如實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮O(shè)計(jì)，要求的敏感度、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的壽命、生殖能力，經(jīng)濟(jì)的考慮及動(dòng)物的可利用性。各組動(dòng)物數(shù)的設(shè)計(jì)應(yīng)考慮到統(tǒng)計(jì)學(xué)的要求。第55頁,共98頁，2024年2月25日，星期天3.試驗(yàn)期限某些試驗(yàn)(如致畸試驗(yàn)和多代生殖試驗(yàn))的試驗(yàn)期限是由受試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物物種或品系而決定的。而其他毒性試驗(yàn)的期限在某種程度上由定義所決定。如急性毒性是一次或1天內(nèi)多次染毒觀察14天，亞慢性毒性試驗(yàn)規(guī)定為染毒持續(xù)至實(shí)驗(yàn)動(dòng)物壽命的10％，對(duì)大鼠和小鼠為90天，對(duì)狗應(yīng)為1年。慢性毒性試驗(yàn)／致癌試驗(yàn)一般規(guī)定為持續(xù)至實(shí)驗(yàn)動(dòng)物壽命的大部分。又可分為兩類，即規(guī)定試驗(yàn)期限的試驗(yàn)，或直到最敏感的組死亡率達(dá)到某一水平(通常為80％)的試驗(yàn)。第56頁,共98頁，2024年2月25日，星期天二、體外毒理學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)此處簡要討論在遺傳毒理學(xué)體外試驗(yàn)共同考慮的幾個(gè)問題。

1．測(cè)定受試物溶解性應(yīng)該測(cè)定受試物在試驗(yàn)介質(zhì)中的溶解性。已注意到在試驗(yàn)系統(tǒng)暴露期內(nèi)，受試物的溶解性可能改變。因此，在試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)評(píng)價(jià)溶解性是有意義的。溶解性限度就是出現(xiàn)沉淀的最低濃度。第57頁,共98頁，2024年2月25日，星期天2．試驗(yàn)最高劑量的推薦對(duì)可溶性受試物濃度高于10mmol/L時(shí)可因高滲透壓在哺乳動(dòng)物細(xì)胞引起損傷或人工假象，對(duì)細(xì)菌則無此影響。由于受試物的分子量并不一定知道(如聚合物或混合物)，因此，在大多數(shù)情況下，可溶性受試物的試驗(yàn)上限應(yīng)該是：(1)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞為10mmol/L或5mg/ml。(2)對(duì)細(xì)菌試驗(yàn)為5mg/平板。當(dāng)受試物供應(yīng)困難或非常昂貴(如生物藥劑)，最高劑量低于10mmol/L或5mg/ml(或／平板)是可以接受的。第58頁,共98頁，2024年2月25日，星期天對(duì)于有毒性的受試物，最高濃度在細(xì)菌試驗(yàn)中應(yīng)該是明顯顯示毒性的劑量，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)最高劑量，基因突變?cè)囼?yàn)應(yīng)達(dá)到10％～20％存活率，而染色體畸變和UBS試驗(yàn)應(yīng)達(dá)到50％存活率。對(duì)于沒有適當(dāng)溶劑，完全不溶的受試物，則可以按5mg/平板或10mmol/L(5mg/ml)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)雜質(zhì)的致突變性。或者，采用生理鹽水提取物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。第59頁,共98頁，2024年2月25日，星期天3.代謝活化代謝活化常規(guī)使用多氯聯(lián)苯1254預(yù)處理的雄性成年大鼠肝勻漿90000g離心上清液(S9)，及相應(yīng)的輔因子(NADPH再生系統(tǒng))。由于各國禁用限用多氯聯(lián)苯，可用苯巴比妥和β-萘黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)制備S9(El1iott，1992)。對(duì)體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)，還可利用大鼠肝原代培養(yǎng)細(xì)胞等作為代謝活化系統(tǒng)。第60頁,共98頁，2024年2月25日，星期天4.陽性對(duì)照陽性對(duì)照的劑量應(yīng)選擇其劑量-反應(yīng)的直線部分，并且構(gòu)成歷史性資料(歷史性對(duì)照)，并以其作為實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制的措施之一。5.重復(fù)由質(zhì)控良好的實(shí)驗(yàn)得到明確的陰性結(jié)果和陽性結(jié)果，不強(qiáng)調(diào)要求重復(fù)?？梢山Y(jié)果則應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，最好改變劑量范圍／劑量間隔、改變S9濃度或改變實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行重復(fù)。第61頁,共98頁，2024年2月25日，星期天第五節(jié)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的染毒和處置本節(jié)簡要介紹在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備、受試物的準(zhǔn)備、染毒途徑和方法、動(dòng)物處死和生物標(biāo)本采集的基本內(nèi)容。第62頁,共98頁，2024年2月25日，星期天一、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在購進(jìn)之后，應(yīng)雌雄分開飼養(yǎng)。一般應(yīng)進(jìn)行5～7天的檢疫，在此期間應(yīng)多次觀察動(dòng)物，及時(shí)剔除不健康的動(dòng)物。觀察期結(jié)束，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求進(jìn)行標(biāo)記和分組。第63頁,共98頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的標(biāo)記方法對(duì)嚙齒動(dòng)物常用染色法，可用苦味酸(黃色)、品紅(紅色)的酒精飽和溶液在動(dòng)物被毛上染色，不同的顏色和染色部位表示不同的編號(hào)，可標(biāo)出1～99號(hào)。由于被毛上顏色會(huì)逐步消失，故需重復(fù)染色。對(duì)嚙齒動(dòng)物還可用剪耳法標(biāo)記。對(duì)狗等大動(dòng)物一般用掛牌法。利用耳號(hào)鉗在動(dòng)物的耳朵上打號(hào)，每剪一個(gè)耳缺代表一個(gè)數(shù)字，兩個(gè)耳朵的耳缺相加所得數(shù)字為該動(dòng)物編號(hào)。耳號(hào)鉗第64頁,共98頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組的原則要求所有的動(dòng)物分配到各劑量組和對(duì)照組的機(jī)會(huì)均等，避免主觀選擇傾向，減少偏性，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。正確的分組方法是隨機(jī)分組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按性別、體重順序編號(hào)，然后利用統(tǒng)計(jì)學(xué)的隨機(jī)數(shù)字表，按完全隨機(jī)分組法或配伍組隨機(jī)分組法，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分配到各劑量組和對(duì)照組。然后應(yīng)計(jì)算各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，必要時(shí)可將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適當(dāng)調(diào)組，以使各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重的均值的差別不超過允許范圍。第65頁,共98頁，2024年2月25日，星期天二、受試物和樣品的準(zhǔn)備應(yīng)了解受試物的純度及雜質(zhì)成分，了解受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，特別是其揮發(fā)性和溶解性。查閱文獻(xiàn)，檢索與受試物化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)相似的化合物的毒性資料，以作參考。對(duì)各個(gè)毒理學(xué)試驗(yàn)應(yīng)該用同一種、同一批號(hào)受試物。受試物成分和配方必須固定。如是異構(gòu)體混合物，異構(gòu)體比例必須固定?；钚猿煞值陌俜趾亢涂蓹z測(cè)的雜質(zhì)的濃度也應(yīng)固定。受試物在貯存期內(nèi)穩(wěn)定性和在飼料中的穩(wěn)定性必須進(jìn)行研究并報(bào)告。受試物應(yīng)一次備齊全部實(shí)驗(yàn)的用量。第66頁,共98頁，2024年2月25日，星期天所需受試物總量＝(A×B×C×D)×1.2

式中：A為每組動(dòng)物數(shù)；B為各處理組的劑量和(如0.1+0.3+1.0mg/kg＝1.4mg/kg)；C為染毒次數(shù)(通常為天)；D為動(dòng)物的平均體重；1.2為安全因子，防止損耗。第67頁,共98頁，2024年2月25日，星期天染毒前根據(jù)染毒途徑的不同，應(yīng)將受試物制備成一定的劑型。常用的是制備成水溶液、油溶液或混懸液。對(duì)溶劑和助溶劑的要求是，所用的溶劑或助溶劑應(yīng)該是無毒的，與受試物不起反應(yīng)，受試物在溶液中應(yīng)穩(wěn)定。對(duì)水溶性受試物，體內(nèi)試驗(yàn)適當(dāng)?shù)娜軇樗?經(jīng)口染毒)和等滲鹽水(胃腸道外染毒)。水不溶性受試物應(yīng)溶于或懸浮于適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑中。外源化學(xué)物用溶劑稀釋，一般講濃溶液比稀溶液毒性大，但是也有的外源化學(xué)物稀釋之后毒性反而增加，即存在所謂“稀釋毒性”，其原因尚不清楚。第68頁,共98頁，2024年2月25日，星期天在準(zhǔn)備染毒制劑時(shí)的要點(diǎn)：①在準(zhǔn)備制劑時(shí)加熱受試物不應(yīng)接近改變其化學(xué)性質(zhì)或物理性質(zhì)的溫度。②如受試物為固體，并且評(píng)價(jià)其對(duì)皮膚的毒性，應(yīng)保持其形狀和顆粒大小。③多成分的受試物(混合物)應(yīng)按配方配制，以使染毒制劑準(zhǔn)確地反映原混合物(即其成分不應(yīng)被選擇性地懸浮或溶解)。④制劑應(yīng)保持化學(xué)穩(wěn)定性和受試物的一致性。⑤制劑應(yīng)減少總試驗(yàn)容積，利用溶劑或賦形劑的量不應(yīng)過多。⑥制劑應(yīng)易于準(zhǔn)確染毒。⑦如可能，制劑pH應(yīng)為5～9。⑧不應(yīng)用酸或堿使受試物解離(基于保護(hù)動(dòng)物的原因，并避免改變腸道或腎小管內(nèi)的PH)。⑨如果應(yīng)用非胃腸道途徑，終溶液應(yīng)盡可能接近等滲。第69頁,共98頁，2024年2月25日，星期天對(duì)于各種染毒途徑的最大容積，以受試的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物物種或制劑來確定。一般規(guī)定，染毒最大容積為：①經(jīng)口20ml/kg(對(duì)空腹動(dòng)物);②經(jīng)皮2ml/kg(根據(jù)體表面積計(jì)算，限于染毒的準(zhǔn)確性)；③靜脈1ml/kg(5分鐘以上)；④肌肉注射0.5ml/kg(一個(gè)部位)；⑤每眼0.01ml;⑥直腸0.5ml/kg；⑦陰道：大鼠0.2m1，兔1ml；⑧吸入2mg/L；⑨鼻：猴或狗每鼻孔0.1ml。第70頁,共98頁，2024年2月25日，星期天染毒的通常容積(最大容積)：大鼠灌胃為1.0(3.0)ml／100g體重(BW)，靜注為0.5(3.0)ml／100gBW;小鼠灌胃為0.2(1.0)ml/20gBW，靜注為0.2(0.5)ml/20gBw；狗灌胃為50(100)ml/10kgBw，靜注為30(50)ml／10kgBW。各種規(guī)范可能有不同的規(guī)定，應(yīng)按規(guī)定進(jìn)行。第71頁,共98頁，2024年2月25日，星期天三、染毒途徑毒理學(xué)試驗(yàn)中染毒途徑的選擇，應(yīng)盡可能模擬人在接觸該受試物的方式。最常用的染毒途徑為經(jīng)口、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮及注射途徑。不同途徑的吸收速率，一般是：靜脈注射＞吸入＞肌肉注射＞腹腔注射＞皮下注射＞經(jīng)口＞皮內(nèi)注射＞其他途徑(如經(jīng)皮等)。第72頁,共98頁，2024年2月25日，星期天1.經(jīng)口(胃腸道)染毒常用有灌胃、喂飼和吞咽膠囊等方式。

(1)灌胃：將受試物配制成溶液或混懸液，以注射器經(jīng)導(dǎo)管注入胃內(nèi)。一般灌胃深度從口至劍突下，最好是利用等容量灌胃法，即受試物配制成不同濃度，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單位體重的灌胃容量相同。大鼠隔夜禁食，小鼠可禁食4小時(shí)(因小鼠消化吸收和代謝速度較快)，均不停飲水。灌胃后2～4小時(shí)提供飼料。經(jīng)口多次染毒，一般不禁食，但應(yīng)每日定時(shí)染毒。灌胃法優(yōu)點(diǎn)是劑量準(zhǔn)確，缺點(diǎn)是工作量大，并有傷及食道或誤入氣管的可能。第73頁,共98頁，2024年2月25日，星期天(2)吞咽膠囊：將一定劑量的受試物裝入膠囊中，放至狗的舌后部，迫使動(dòng)物咽下，此法劑量準(zhǔn)確，適用于易揮發(fā)、易水解和有異味的受試物。(3)喂飼：將受試物摻入動(dòng)物飼料或飲水中供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自行攝入。飼料中摻入受試物不應(yīng)超過5％，以免造成飼料營養(yǎng)成分改變而影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生長發(fā)育。喂飼法符合人類接觸受試物的實(shí)際情況，但缺點(diǎn)多，如適口性差的受試物，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物拒食；易揮發(fā)或易水解的受試物不適用。第74頁,共98頁，2024年2月25日，星期天

2.經(jīng)呼吸道染毒經(jīng)呼吸道染毒可分為吸入染毒和氣管內(nèi)注入。(1)靜式吸入染毒：將一定數(shù)量的嚙齒類動(dòng)物放在密閉的染毒柜中，加入易揮發(fā)的液態(tài)受試物或氣態(tài)受試物使成一定濃度。一般50升的染毒柜接觸2小時(shí)，可放小鼠6～10只或大鼠1只。靜式吸入染毒簡易，但缺點(diǎn)較多，主要是隨試驗(yàn)進(jìn)行氧分壓降低(因此，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量有限制)，柜內(nèi)受試物濃度也逐漸下降(由于動(dòng)物吸入消耗、為被毛及染毒柜壁吸附所致)，而且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有經(jīng)皮吸收的可能。靜式吸入染毒多以計(jì)算方法得到染毒柜內(nèi)受試物濃度，以mg/m3表示。第75頁,共98頁，2024年2月25日，星期天(2)動(dòng)式吸入染毒：由染毒柜、機(jī)械通風(fēng)系統(tǒng)和配氣系統(tǒng)三部分構(gòu)成。對(duì)設(shè)備的要求較高，優(yōu)點(diǎn)是在染毒過程中染毒柜內(nèi)氧分壓及受試物濃度較穩(wěn)定，缺點(diǎn)是消耗受試物的量大，并易于污染環(huán)境。動(dòng)式吸入染毒又分為整體接觸和口鼻接觸兩種。動(dòng)式吸入染毒柜中受試物的濃度應(yīng)實(shí)際監(jiān)測(cè)。

(3)氣管內(nèi)注入：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在麻醉后，將受試物注入氣管，使之分布至兩肺。此法用于建立急性中毒模型及塵肺研究。第76頁,共98頁，2024年2月25日，星期天3.經(jīng)皮膚染毒經(jīng)皮膚染毒的目的有兩種。一種是經(jīng)皮染毒毒性試驗(yàn)，如經(jīng)皮LD50測(cè)定常用大鼠，皮膚致癌試驗(yàn)常用小鼠。另一種是皮膚刺激和致敏試驗(yàn)，皮膚刺激試驗(yàn)常用兔和豚鼠，皮膚致敏試驗(yàn)用豚鼠。試驗(yàn)前用機(jī)械法(剃毛)或化學(xué)法(硫化鈉或硫化鋇)脫毛。要求是不應(yīng)損傷脫毛區(qū)的表皮，脫毛區(qū)面積不大于動(dòng)物體表面積的10％～15％。于脫毛后24小時(shí)涂抹一定量受試物，蓋上一層塑料薄膜，再用無刺激性的膠布固定，接觸規(guī)定的時(shí)間。第77頁,共98頁，2024年2月25日，星期天4.注射染毒注射用藥品，應(yīng)以注射途徑染毒，對(duì)大小鼠可用靜脈注射，對(duì)非嚙齒類可模擬臨床用藥途徑，如狗可用后肢隱靜脈注射，而嚙齒類的尾靜脈和肌肉注射難以多次染毒，必要時(shí)可改為皮下注射。注射染毒，應(yīng)調(diào)整受試物的pH及滲透壓，pH應(yīng)5～8，最好是等滲溶液，動(dòng)物對(duì)高滲的耐受力比低滲強(qiáng)。靜脈注射應(yīng)控制速度，大鼠尾靜脈注射最好控制在10秒以上。腹腔注射在遺傳毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中有時(shí)也用，但在致畸試驗(yàn)、肝UDS研究不應(yīng)該用腹腔注射，以避免可能的損傷和局部高濃度對(duì)靶器官的影響。第78頁,共98頁，2024年2月25日，星期天四、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死及生物標(biāo)本采集1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死方法應(yīng)盡量減少因處死方法不當(dāng)而影響對(duì)病理及其他指標(biāo)的檢查。大小鼠可用頸椎脫臼法，然后股動(dòng)脈放血。兔、豚鼠、狗等一般用股動(dòng)脈放血處死。應(yīng)盡量采用適當(dāng)?shù)奶幩婪椒?，減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的痛苦。2．血液采集大小鼠如需血量小可用鼠尾采血，如需血量較多可用眼眶靜脈叢采血或處死時(shí)股動(dòng)脈放血采血。狗可用后肢隱靜脈抽血。不影響動(dòng)物生理功能的最大取血量為其總血量(50ml/kg體重)的10％。第79頁,共98頁，2024年2月25日，星期天3．尿液采集對(duì)大小鼠可用代謝籠，下部有糞尿分離器。對(duì)狗可用接尿法或?qū)蚍ā５?0頁,共98頁，2024年2月25日，星期天4.病理解剖和標(biāo)本留取毒性病理學(xué)檢查是毒理學(xué)試驗(yàn)重要的組成部分，病理學(xué)研究有助于確定有害作用和靶器官。毒性病理學(xué)檢查包括大體解剖和組織病理學(xué)檢查兩部分。急性毒性試驗(yàn)中在試驗(yàn)期中死亡或試驗(yàn)結(jié)束處死的動(dòng)物都應(yīng)進(jìn)行尸體解剖，因?yàn)榧毙远拘栽囼?yàn)的目的是得到有關(guān)可能的靶器官信息以及進(jìn)行重復(fù)染毒試驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)的信息。在亞慢性、慢性、致癌試驗(yàn)，病理學(xué)是一個(gè)重要的終點(diǎn)。第81頁,共98頁，2024年2月25日，星期天（1）大體解剖：在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死后半小時(shí)內(nèi)進(jìn)行，解剖方法采用胸腔、腹腔臟器聯(lián)出法。應(yīng)觀察有關(guān)臟器的外形和表面情況、顏色、邊界和大小、質(zhì)地、切面。對(duì)指定的臟器稱重，并計(jì)算臟器系數(shù)。推薦的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病理解剖標(biāo)準(zhǔn)操作程序見圖5-1。第82頁,共98頁，2024年2月25日，星期天第83頁,共98頁，2024年2月25日，星期天(2)組織病理學(xué)檢查：對(duì)指定的器官或組織用鋒利的刀剪取材，應(yīng)統(tǒng)一取材部位。組織塊一般在10倍體積的10％福爾馬林中固定，此后常規(guī)制片(組織石蠟包埋、切片、HE染色)。應(yīng)詳細(xì)記錄顯微鏡下觀察到的病變，并做出病理診斷。第84頁,共98頁，2024年2月25日，星期天第六節(jié)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理和分析在毒理學(xué)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和實(shí)施中應(yīng)貫徹實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的對(duì)照、隨機(jī)和重復(fù)的原則，實(shí)驗(yàn)的各劑量組所得到的結(jié)果應(yīng)與陰性對(duì)照組比較。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(指標(biāo))的變量類型是數(shù)值變量(計(jì)量資料)還是分類變量(計(jì)數(shù)資料)，選用不同的統(tǒng)計(jì)分析方法。近年來，隨著毒理學(xué)的研究方法的發(fā)展，也對(duì)生物統(tǒng)計(jì)學(xué)提出了更高的要求。在評(píng)價(jià)毒理學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果時(shí)，應(yīng)綜合考慮生物學(xué)意義和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的假設(shè)是關(guān)于總體特征的假設(shè)，檢驗(yàn)方法是以統(tǒng)計(jì)量的抽樣分布為根據(jù)的，得到的結(jié)論是概率性的，不是絕對(duì)的肯定或否定，不等同于有或無生物學(xué)意義。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果作出科學(xué)的判斷和解釋，應(yīng)該根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的結(jié)果、生物學(xué)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)。第85頁,共98頁，2024年2月25日，星期天一、毒理學(xué)試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)觀點(diǎn)及方法在毒理學(xué)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和結(jié)果評(píng)價(jià)中起關(guān)鍵的作用，毒理學(xué)試驗(yàn)的發(fā)展也促進(jìn)了生物統(tǒng)計(jì)學(xué)的發(fā)展。毒理學(xué)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)的主要進(jìn)展是劑量—反應(yīng)關(guān)系研究和對(duì)超離差數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)。第86頁,共98頁，2024年2月25日，星期天1.毒理學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求毒理學(xué)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)應(yīng)遵循隨機(jī)、重復(fù)及對(duì)照三個(gè)原則，要求各觀察值具有代表性，并且是相互獨(dú)立的。毒理學(xué)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)具體涉及到劑量水平數(shù)目及間隔，每個(gè)劑量點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)單位數(shù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)單位接種及計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)，對(duì)照組的設(shè)置等。實(shí)驗(yàn)單位的確定對(duì)于樣品的獨(dú)立性是很重要的，實(shí)驗(yàn)單位(experimentalunit)是進(jìn)行處理時(shí)或觀察時(shí)獨(dú)立的最大采樣單位。以動(dòng)物和培養(yǎng)物作為實(shí)驗(yàn)單位要比以細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)單位更為可取。此外，如果同時(shí)評(píng)價(jià)幾個(gè)不同因素的效應(yīng)，應(yīng)注意均衡的原則。第87頁,共98頁，2024年2月25日，星期天樣本的代表性要求具有同質(zhì)性，即各處理組和對(duì)照組的非實(shí)驗(yàn)因素的條件均一致，為此，各實(shí)驗(yàn)單位(動(dòng)物或培養(yǎng)物)的分組及整個(gè)實(shí)驗(yàn)的全部操作都應(yīng)遵循隨機(jī)化原則。在利用形態(tài)學(xué)指標(biāo)的毒理學(xué)試驗(yàn)，必須采用盲法觀察結(jié)果，以消除實(shí)驗(yàn)者觀察結(jié)果的偏性。樣本應(yīng)有足夠的大小和適當(dāng)?shù)闹貜?fù)次數(shù)，以估計(jì)處理之間、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間的變異性。一般可根據(jù)顯著性水準(zhǔn)、檢驗(yàn)把握度、容許誤差、總體標(biāo)準(zhǔn)差等來估計(jì)樣本的大小。嚴(yán)格執(zhí)行毒理學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的上述要求，才可能得到可靠性和重復(fù)性良好的結(jié)果，也是進(jìn)行正確的統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)。良好的質(zhì)量保證和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可以監(jiān)控系統(tǒng)誤差，而統(tǒng)計(jì)處理則用來確定隨機(jī)誤差。第88頁,共98頁，202