植物組織培養(yǎng)設備及條件

關于植物組織培養(yǎng)設備及條件第一節(jié)實驗室設計及基本技術一、實驗室組成二、儀器設備三、培養(yǎng)器皿及實驗用具四、洗滌技術五、滅菌技術六、無菌操作

第2頁,共91頁，2024年2月25日，星期天

組織培養(yǎng)實驗室布局的總體要求

便于隔離便于操作便于滅菌便于觀察一、實驗室組成第3頁,共91頁，2024年2月25日，星期天基本實驗室輔助實驗室實驗室組成準備室緩沖室無菌操作室培養(yǎng)室細胞生物學實驗室溫室生化分析實驗室第4頁,共91頁，2024年2月25日，星期天水槽實驗臺擱架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架藥品及儀器柜無菌臺無菌臺擱架拉窗冰箱擱架電爐門4.5m3.0m3.5m4.0m準備室緩沖室無菌室培養(yǎng)室第5頁,共91頁，2024年2月25日，星期天組織培養(yǎng)準備實驗室第6頁,共91頁，2024年2月25日，星期天準備室第7頁,共91頁，2024年2月25日，星期天緩沖室第8頁,共91頁，2024年2月25日，星期天無菌室第9頁,共91頁，2024年2月25日，星期天無菌室第10頁,共91頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)室第11頁,共91頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)架第12頁,共91頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)間第13頁,共91頁，2024年2月25日，星期天二、儀器設備1）、基本儀器設備

冰箱、電（磁）爐、酸度計、純水器、天平、移液器、解剖鏡、光照培養(yǎng)箱、搖床、生化培養(yǎng)箱、培養(yǎng)基分裝器、攪拌器等。第14頁,共91頁，2024年2月25日，星期天冰箱酸度計電爐第15頁,共91頁，2024年2月25日，星期天天平純水器第16頁,共91頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基分裝器攪拌器第17頁,共91頁，2024年2月25日，星期天搖床體式顯微鏡倒置顯微鏡冷光源電磁攪拌器搖床第18頁,共91頁，2024年2月25日，星期天2）、滅菌設備蒸汽壓力滅菌鍋、干熱消毒柜、過濾滅菌裝置、噴霧消毒器、紫外燈。第19頁,共91頁，2024年2月25日，星期天蒸汽壓力滅菌鍋第20頁,共91頁，2024年2月25日，星期天第21頁,共91頁，2024年2月25日，星期天高壓滅菌器第22頁,共91頁，2024年2月25日，星期天干熱消毒柜第23頁,共91頁，2024年2月25日，星期天75%酒精噴霧器噴霧消毒器第24頁,共91頁，2024年2月25日，星期天3）、無菌操作設備

超凈工作臺第25頁,共91頁，2024年2月25日，星期天二、設備、儀器超凈工作臺（一）設備第26頁,共91頁，2024年2月25日，星期天1.紫外線滅菌燈2.日光燈3.工作臺4.凳子5.擱物架6.窗7.推拉門8.緩沖間第27頁,共91頁，2024年2月25日，星期天第28頁,共91頁，2024年2月25日，星期天無菌接種箱第29頁,共91頁，2024年2月25日，星期天4、細胞培養(yǎng)設備

搖床第30頁,共91頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)架第31頁,共91頁，2024年2月25日，星期天HZC-250恒溫振蕩培養(yǎng)箱150C

250D

光照培養(yǎng)箱

第32頁,共91頁，2024年2月25日，星期天

光照培養(yǎng)箱烘箱第33頁,共91頁，2024年2月25日，星期天5、細胞學鑒定設備光學顯微鏡、體視顯微鏡、倒置顯微鏡倒置顯微鏡光學顯微鏡第34頁,共91頁，2024年2月25日，星期天電子天平（0.0001g，0.001g）

酸度計第35頁,共91頁，2024年2月25日，星期天1、玻璃器皿三、培養(yǎng)器皿及實驗用具培養(yǎng)皿三角瓶培養(yǎng)瓶第36頁,共91頁，2024年2月25日，星期天2、金屬材質用具鑷子解剖刀接種針第37頁,共91頁，2024年2月25日，星期天（二）各類器皿

1．器皿的類型（1）培養(yǎng)器皿三角瓶、培養(yǎng)瓶、圓形培養(yǎng)瓶、試管、L形管和T形管（2）分注器（3）刻度移液管（4）微量移液器（5）細菌過濾器（三）器械用具打孔器

鑷子

解剖刀

接種針剪刀電熱滅菌器

第38頁,共91頁，2024年2月25日，星期天四、洗滌技術1、玻璃器皿洗滌已用過的玻璃器皿1%稀HCl浸漬12h洗衣粉洗滌清水沖洗晾干備用新購置玻璃器皿第39頁,共91頁，2024年2月25日，星期天2、塑料用品洗滌新的塑料器皿打開即用已用過的塑料器皿2%NaOH浸泡12h清水沖洗2%—5%鹽酸浸泡30min清水沖洗蒸餾水沖洗晾干備用第40頁,共91頁，2024年2月25日，星期天3、金屬用品洗滌熱洗衣粉水洗凈沖洗擦干第41頁,共91頁，2024年2月25日，星期天五、滅菌技術物理方法：干熱、濕熱、射線處理、過濾除菌等化學方法：消毒劑、抗菌素滅菌1、滅菌方法第42頁,共91頁，2024年2月25日，星期天2、滅菌（1）培養(yǎng)基滅菌：高溫高壓濕熱滅菌法壓力在0.1M—0.2MPa

溫度在121℃

滅菌10—30min（2）玻璃器皿滅菌：蒸汽高壓消毒滅菌干熱消毒滅菌第43頁,共91頁，2024年2月25日，星期天飽和蒸汽壓力與其對應的溫度飽和蒸汽壓力溫度（℃）飽和蒸汽壓力溫度（℃）kg/cm21b/m2kg/cm21b/m20.00.1410.2810.4420.5630.7030.8440.98402468101214100103.6106.9109.8112.6115.2117.6119.91.0551.1251.2661.4061.5431.6811516182022243050121.0122.0124.1126.0127.8129.6134.5147.6第44頁,共91頁，2024年2月25日，星期天（3）塑料器皿滅菌：多采用高壓蒸汽消毒滅菌（4）金屬用具滅菌：灼燒滅菌浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼燒，冷卻后使用第45頁,共91頁，2024年2月25日，星期天（5）接種室滅菌空氣消毒滅菌接種室超凈工作臺紫外燈照射70%—75%的酒精擦洗培養(yǎng)材料的接種紫外燈照射第46頁,共91頁，2024年2月25日，星期天（6）外植體滅菌流水沖洗10—20min或更長時間70%—75%酒精中浸泡30s0.1%—0.2%氯化汞液中浸泡10min左右蒸餾水沖洗4—5次在10%的次氯酸鈉、飽和漂白粉浸泡30min左右備用第47頁,共91頁，2024年2月25日，星期天常用消毒劑消毒滅菌比較表消毒劑使用濃度（%）去除難易消毒時間（min）效果次氯酸鈣次氯酸鈉漂白粉溴水過氧化氫升汞酒精抗生素硝酸銀9~102飽和溶液1~210~120.1~170~754~5（mg/L1易易易易最易較難易中較難5~305~305~302~105~152~100.2~230~605~30很好很好很好很好好最好好較好好第48頁,共91頁，2024年2月25日，星期天消毒，更換實驗服、帽子與鞋子，進入接種室。打開超凈工作臺和無菌操作室的紫外燈，照射40min左右，后關閉。開啟過濾風機，使無菌風吹拂工作臺面和四周的臺壁。用70%—75%的酒精擦拭工作臺和雙手。（7）接種準備第49頁,共91頁，2024年2月25日，星期天六、無菌操作實驗員消毒實驗室、無菌臺滅菌實驗器材的滅菌無菌接種消毒實驗臺衛(wèi)生培養(yǎng)室培養(yǎng)第50頁,共91頁，2024年2月25日，星期天植物組織培養(yǎng)是在嚴格無菌的條件下進行的，要做到無菌的條件，需要一定的設備、器材和用具，同時還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。準備室：器具的洗滌、干燥、保存、滅菌，各種藥品的儲備、稱量、溶解、配制、培養(yǎng)基分裝等，設備：藥品柜、防塵廚、冰箱、天平、純水儀、酸度計、操作臺、滅菌鍋、烘箱。

實驗室設計原則：保證無菌操作，達到工作方便，防止污染?；瘜W室/準備室、接種室、培養(yǎng)室。小結第51頁,共91頁，2024年2月25日，星期天

接種室：植物材料的消毒、接種、培養(yǎng)物轉移、試管苗繼代、原生質體制備及其它需要進行的無菌操作。設備：紫外光源、超凈工作臺、消毒器、酒精燈、接種器械（鑷子、剪刀、解剖刀、接種針）。清潔和消毒，減少與外界空氣對流，穿實驗服及換鞋以減少帶入雜菌。

培養(yǎng)室：墻壁要求絕熱防火的性能，培養(yǎng)架由金屬制成，底層離地高約10cm，層間隔40cm，總高1.7m左右，長度根據(jù)日光燈的長度而設計，寬度為60cm。第52頁,共91頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)植物組織培養(yǎng)所需的環(huán)境條件及營養(yǎng)成分一、環(huán)境條件

與自然條件一樣，組織培養(yǎng)中的外植體的生長要受到溫度、光照、濕度等各種物理條件，不同培養(yǎng)基組成、pH值、滲透壓等各種化學條件，以及外植體部位、大小、細胞密度等各種生物條件等環(huán)境條件的影響。如何根據(jù)需要來控制培養(yǎng)條件是組織培養(yǎng)中的一個重要問題。第53頁,共91頁，2024年2月25日，星期天溫度光照濕度氣體滲透壓pH值一般最適溫度在25±2℃之間環(huán)境條件最常用的是光照16h，黑暗8h一般情況下，培養(yǎng)器內(nèi)相對濕度應達100%，培養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境的相對濕度在70%—80%

氧氣是愈傷組織生長所必需的調(diào)節(jié)滲透壓常常從糖入手

培養(yǎng)基的pH值大多在5.0—6.5，5.8第54頁,共91頁，2024年2月25日，星期天溫度在20-27℃左右，空調(diào)控溫，濕度恒定，相對濕度在70-80%，光照由定時開關控制，每天光照10-16h左右，不同植物決定光照時間，培養(yǎng)室可采用太陽光為能源，易成活，陰雨天用室內(nèi)燈光補光。第55頁,共91頁，2024年2月25日，星期天二、營養(yǎng)成分

植物體內(nèi)至少含有幾十種化學元素，其中大部分元素在植物體內(nèi)起到一定的生理作用：a、組成各種化合物，參與機體的建造，成為結構物質；b、構成一些特殊的生理活性物質，參與活躍的新陳代謝；c、元素之間相互協(xié)調(diào)，以維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡點等化學方面的作用；d、發(fā)育方面，特定的元素影響植物的形態(tài)發(fā)生和組織、器官建成。第56頁,共91頁，2024年2月25日，星期天Arnon和Stout（1939）提出的確定植物必需營養(yǎng)元素的3個標準:A、缺乏該元素，植物生育發(fā)生障礙，不能完成其生活史;B、缺乏該元素，就表現(xiàn)為專一的病癥，且這種缺素癥可以用補充該元素來預防和恢復;C、該元素在植物營養(yǎng)生理上表現(xiàn)直接的效果，而不是由于土壤的物理、化學、微生物條件的變化而產(chǎn)生的間接效果。第57頁,共91頁，2024年2月25日，星期天

國內(nèi)外公認的高等植物所必需的營養(yǎng)元素有16（17）種：

C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni）在植物中含量差別很大，同一元素在植物不同時期、不同條件下含量也不同。第58頁,共91頁，2024年2月25日，星期天根據(jù)植物體內(nèi)含量多少，可把這些元素分為※大量營養(yǎng)元素：占干物質重量的0.1%以上；C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9種※微量營養(yǎng)元素：占干物質重量的0.1%以下，有的只含0.1mg/kg，F(xiàn)e、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7種按照國際植物生理協(xié)會的建議：

所需濃度>0.5mmol/L的元素為大量元素所需濃度<0.5mmol/L的元素為微量元素第59頁,共91頁，2024年2月25日，星期天1、大量元素N是蛋白質、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，在植物生命活動中占有重要的位置。

P是磷脂的主要成分。培養(yǎng)基中常用KH2PO4

、NaH2PO4等。

K對碳水化合物合成，轉移，以及氮素代謝等有密切關系。第60頁,共91頁，2024年2月25日，星期天Mg、S、Ca是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑，對核蛋白體結構具有穩(wěn)定作用；S是含S氨基酸的蛋白質的組成成分。Ca是構成細胞壁的成分，對細胞分裂，穩(wěn)定質膜結構有顯著作用，此外，Ca及鈣調(diào)素在細胞信號轉導中起重要作用。第61頁,共91頁，2024年2月25日，星期天2、微量元素

在微量元素中，鐵的使用最大：◆一些氧化酶的組成成分◆葉綠素形成的必要條件◆使用乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Fe）鰲合物防止鐵的沉淀第62頁,共91頁，2024年2月25日，星期天

硼與蛋白質合成、糖類運輸有著密切的關系

銅是某些氧化酶的成分，能夠促進離體根的生長

錳參與植物的光合、呼吸代謝

鉬參與氮素的代謝

氯是光合作用水光解的活化劑微量元素的主要作用是作為酶的輔助因子或激活劑參與代謝的調(diào)節(jié)。第63頁,共91頁，2024年2月25日，星期天

組織培養(yǎng)的條件營養(yǎng)條件（培養(yǎng)基），組織培養(yǎng)的重要基質，不同植物的組織對營養(yǎng)有不同的要求，合適培養(yǎng)基才能成功。MS培養(yǎng)基：1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細胞設計，無機鹽濃度較高，硝酸鹽含量高，用于植物器官、花藥、細胞的組培，有些培養(yǎng)基是由它演變而來。B5培養(yǎng)基：1968年由Galmborg為培養(yǎng)大豆根細胞設計，含有較低的銨鹽，適合雙子葉植物、木本植物第64頁,共91頁，2024年2月25日，星期天White培養(yǎng)基：1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖設計，MgSO4、硼鹽濃度高，無機鹽濃度低，適于生根培養(yǎng)。N6培養(yǎng)基：1974年由朱至清為禾谷類花藥培養(yǎng)而設計，KNO3和（NH4）2SO4濃度高，適于花藥培養(yǎng)。KM-8P培養(yǎng)基：1974年為原生質體培養(yǎng)而設計，有機成分復雜，包括了所有的單糖及維生素，適于原生質體融合培養(yǎng)。第65頁,共91頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基成分主要是水、無機鹽、有機物、天然復合物、培養(yǎng)基中的凝膠無機鹽：大量元素（大于0.5mmol/L的元素）、微量元素。N：是蛋白、維生素、核酸、磷脂等的組成成分，培養(yǎng)基中有NO3--、NH4+供應形式，如KNO3、NH4NO3、（NH4）2SO4等。P：磷脂、ATP等的組成成分，常用的有KH2PO4、NaH2PO4等K：與糖類合成、蛋白代謝有關，常以KCL、KNO3在培養(yǎng)基中提供Mg、S、Ca：是葉綠素、酶、細胞壁的組成成分，MgSO4·7H2O、CaCL2·7H2O第66頁,共91頁，2024年2月25日，星期天微量元素：小于0.5mmol/L，F(xiàn)e、Zn、B、Mn、Cu、Mo、Co等；FeSO4·7H2O與Na2-EDTA配成鐵鹽溶液。碳水化合物：常用的是蔗糖、葡萄糖，常用濃度為3%。維生素：以輔酶的形式參與多種代謝，對生長、分化有促進作用，VB1（鹽酸硫胺素）、VB6（鹽酸吡哆醇）、VB12、VPP（煙酸）、VC（抗壞血酸）、生物素、葉酸。肌醇：環(huán)己六醇，參與細胞壁、細胞膜構建，100mg/L第67頁,共91頁，2024年2月25日，星期天氨基酸---有機氮源，細胞直接吸收，甘氨酸、天冬氨酸、谷酰胺、水解乳蛋白（氨基酸混合物）等，10-1000mg/L天然復合物---椰子乳、香蕉、馬鈴薯濾液、酵母提取液、麥芽提取液、番茄汁等，不易培養(yǎng)時使用。植物激素---培養(yǎng)基的關鍵物質，生長素類（IAA、NAA、IBA、2,4-D；細胞分裂素（6-BA、KT、ZT）；赤霉素（GA3）生長素/細胞分裂素：高—利于根、愈傷組織形成；適中—利于根、芽分化；低—利于芽的形成第68頁,共91頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基的支持物—瓊脂（固體培養(yǎng)時的固化劑，低于40度為凝膠，6-10g/L），玻璃纖維、濾紙橋、海綿、脫脂棉、卡拉膠等，總的要求是降低培養(yǎng)材料產(chǎn)生的有害物影響抗生素----卡那霉素、頭孢、青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，5-20mg/L，防止菌類污染?；钚蕴?--吸附培養(yǎng)基中的雜質、酚、醌類、滅菌副產(chǎn)物等，0.5-10g/L第69頁,共91頁，2024年2月25日，星期天第70頁,共91頁，2024年2月25日，星期天第71頁,共91頁，2024年2月25日，星期天第72頁,共91頁，2024年2月25日，星期天

缺鐵癥狀：葉面呈綠色網(wǎng)紋狀失綠。隨病勢發(fā)展，葉片失綠程度加重，出現(xiàn)整葉變?yōu)榘咨~緣枯焦，引起落葉。嚴重缺鐵時，新梢頂端枯死。桃樹第73頁,共91頁，2024年2月25日，星期天第74頁,共