《普通植物病理學(xué)》實(shí)驗指導(dǎo)

《普通植物病理學(xué)》實(shí)驗指導(dǎo)前言《普通植物病理學(xué)實(shí)驗指導(dǎo)》主要是配合《普通植物病理學(xué)》的教學(xué)內(nèi)容,幫助學(xué)生理解和掌握《植物病理學(xué)》的基礎(chǔ)理論,學(xué)習(xí)基本知識和基本技能的實(shí)驗指導(dǎo)課。內(nèi)容包括兩大部分,一是植物病害的癥狀識別和病原生物的形態(tài)特征的觀察,二是有關(guān)病害的侵染、流行和有關(guān)實(shí)驗研究的基本技術(shù)。通過實(shí)驗,培養(yǎng)和提高學(xué)生的觀察、思考、分析的能力,鍛煉學(xué)生獨(dú)立操作的能力。實(shí)驗內(nèi)容的安排旨在引導(dǎo)學(xué)生逐步進(jìn)入植物病理學(xué)的領(lǐng)域,并為以后深入學(xué)習(xí)病原生物學(xué)、農(nóng)業(yè)植物病理學(xué)、植物病害防治學(xué)和進(jìn)一步開展試驗研究打下堅實(shí)的基礎(chǔ)。目錄注意事項1.每次實(shí)驗前,學(xué)生要仔細(xì)預(yù)習(xí)實(shí)驗指導(dǎo),明確實(shí)驗的目的與要求,了解實(shí)驗內(nèi)容和應(yīng)注意的事項。2.認(rèn)真昕取老師指導(dǎo),按要求逐項細(xì)心操作,愛護(hù)儀器設(shè)備,節(jié)約材料,損壞物品要及時報告。3.遵守實(shí)驗室紀(jì)律。實(shí)驗時,不準(zhǔn)在實(shí)驗室內(nèi)談笑喧嘩、吸煙與飲食,不要在室內(nèi)來回走動,共同保持室內(nèi)的整潔與安靜。嚴(yán)禁以酒精燈互相點(diǎn)火,以確保安全。4.認(rèn)真記錄實(shí)驗的結(jié)果,繪圖要精確,比例要適當(dāng),按時上交實(shí)驗報告。5.實(shí)驗結(jié)束時,儀器用具要擦干凈并放回原處,清除垃圾,實(shí)驗室要打掃干凈。6.需要進(jìn)一步培養(yǎng)觀察的實(shí)驗材料,應(yīng)寫好標(biāo)簽,注明實(shí)驗內(nèi)容、日期和試驗人員姓名,以防混淆或丟失。7.學(xué)生應(yīng)準(zhǔn)備繪圖紙、報告紙、HB和2H的繪圖鉛筆、直尺、小刀和橡皮等繪圖用具等。實(shí)驗一：植物病害癥狀觀察一、目的要求認(rèn)識各類病害對植物造成的為害，了解植物病害的種類及其多樣性，初步掌握主要病害的癥狀表現(xiàn)及其特點(diǎn)，學(xué)會植物病害癥狀的描述,為今后病害的診斷奠定基礎(chǔ)。二、材料、試劑與儀器按照植物病害的病狀類型(變色、壞死、斑點(diǎn)、腐爛、畸形)和病征類型(粉狀物、霉?fàn)钗?、點(diǎn)狀物、菌核、溢膿等)的盒裝標(biāo)本、瓶裝浸漬標(biāo)本及新鮮標(biāo)本。各類癥狀的掛圖、模型、多媒體課件等。撥針、刀片、木板、酒精燈、火柴、裁玻片、蓋玻片、紗布、乳盼油、二甲苯、顯微鏡、擦鏡紙、吸水紙等。三、內(nèi)容與方法（一）植物病害癥狀觀察植物病害的癥狀是植物患病后由于異常生理活動而發(fā)生在細(xì)胞和組織上的病理變化,最后表現(xiàn)為肉眼可見的形態(tài)變化。植物病害的癥狀可區(qū)別為兩類不同性質(zhì)的特征：病狀和病征。病狀是一定的寄主植物和病原在一定外界條件的影響下相互作用結(jié)果的外部表現(xiàn),是以各自的生理機(jī)能或特性為基礎(chǔ)的。而每種生物的生理機(jī)能,都是在質(zhì)上有特異性,并且是相對穩(wěn)定的。病變,作為這種相互作用過程的結(jié)果,一般說其發(fā)展是定向的。病狀作為病變過程的表現(xiàn),其特征也是較穩(wěn)定的和具有特異性的。這就是利用病狀診斷植物病害的基礎(chǔ)。病征是由病原微生物的群體或器官著生在寄主表面所構(gòu)成的。它更直接地暴露了病原物在質(zhì)上的特點(diǎn)。如真菌子實(shí)體在寄主表面形成的霉層、黑點(diǎn)等。由植物病毒、植原體、許多病原細(xì)菌、非侵染性植物病害等無病征的表現(xiàn)。病征的出現(xiàn)與否和出現(xiàn)的明顯程度,雖受環(huán)境條件的影響很大,但一經(jīng)表現(xiàn)出來卻是相當(dāng)穩(wěn)定的特征,所以根據(jù)病征能夠正確地判定病害。病狀和病征，尤其是前者,作為診斷病害的依據(jù)也有其局限性。首先是許多植物病害常產(chǎn)生相似的病狀,因此要從各方面的特點(diǎn)去綜合判斷；其次,植物常因作物品種的變化或受害器官的不同,而使病狀有一定幅度的變化；第三,病害的發(fā)生發(fā)展是一個過程,有初期和后期,病狀也隨之而發(fā)展變化；第四,環(huán)境條件對病狀和病征有一定的影響,尤其是濕度對病征的產(chǎn)生有顯著地作用,加之發(fā)病后期病部往往會長出一些腐生菌的繁殖器官。因此,癥狀的穩(wěn)定性和特異性只是相對的,要認(rèn)識癥狀的特異性和變化的規(guī)律,在觀察植物病害時,須認(rèn)真地從癥狀的發(fā)展變化中去研究和掌握癥狀的特殊性。觀察和采集植物病害標(biāo)本,仔細(xì)地區(qū)別病征的那種微小的、似同而異的特征,這樣才能正確地診斷病害。1病狀的觀察（1）斑點(diǎn)

觀察玉米大斑病、棉花角斑病、大麥條紋病、大蔥或大蒜紫斑病、番茄早疫病、十字花科霜霉病等標(biāo)本。注意不同類型病害所表現(xiàn)病斑的形狀、大小、顏色等的異同以及病斑上有無輪紋、花紋伴生,同時注意觀察各類病斑上有無病征以及病征的特點(diǎn)。斑點(diǎn)類發(fā)生在葉、莖、果等部位,受病組織局部壞死,一般有明顯的邊緣。斑點(diǎn)中還可以伴生輪紋、花紋等特點(diǎn)。根據(jù)病斑的顏色、形狀等特點(diǎn)而分為褐斑、黑斑、紫斑、角斑、條斑、大斑、小斑、胡麻斑、輪紋斑、網(wǎng)斑等多種類型。（2）腐爛

觀察甘薯黑斑病病薯、馬鈴薯環(huán)腐病病薯、柑橘潰瘍病等病害標(biāo)本,認(rèn)識該類病害對植物所造成的為害,同時掌握這類病害的病狀特點(diǎn)。腐爛類病狀發(fā)生在植物的各個部位,由于組織分解的程度不同,有軟腐、干腐之分。根據(jù)腐爛的部位,有根腐、基腐、莖腐、果腐、花腐等名稱,還伴隨有各種顏色變化的特點(diǎn),如褐腐、白腐、黑腐等。（3）.萎蔫

觀察棉花、黃瓜等植物枯萎病、棉花和茄子黃萎病、玉米和茄科植物青枯病、馬鈴薯環(huán)腐病等標(biāo)本。注意區(qū)別枯萎、黃萎、青枯等病狀類型,必要時可以剖開病株莖稈觀察維管束是否褐變。典型的萎蔫病狀是植物根、莖的維管束組織受到破壞而發(fā)生的葉片或枝條萎垂現(xiàn)象,皮層組織完好,萎蔫病害常無外表的病征。植物受萎蔫菌侵染后,不一定都能引起萎蔫,發(fā)病初期有半邊葉片、半個枝條萎垂的現(xiàn)象,但更常見的是全株性萎蔫。提示：對于萎蔫類病害病狀的觀察應(yīng)以新鮮標(biāo)本為主,有條件時最好在田間進(jìn)行,這類病害發(fā)生具有一定的地域性,觀察時要注意其維管束組織的病變,干標(biāo)本則失去了原有的特點(diǎn)。（4）.變色

變色主要有兩種類型。一種表現(xiàn)為黃化，是整個植株或葉片部分地或全部地均勻褪綠、變黃,或呈現(xiàn)其他的顏色。多數(shù)伴生有整株或部分的畸形。另一種為花葉，病株葉片色澤濃淡不均,深綠與淺綠部分相間夾雜,一般遍及全株,上部葉片較為顯著,無病征表現(xiàn)。比較觀察煙草花葉病、蘋果花葉病、小麥黃矮病、瓜類、十字花科和茄科植物的病毒病病狀，注意每一種病害的病狀特點(diǎn)。（5）.畸形

畸形類病狀由不同組織、器官的病變，如葉片的膨腫、皺縮、小葉、蕨葉；果實(shí)的縮果及其他畸形；整個植株的徒長、矮縮；局部器官如花器和種子的退化變形和促進(jìn)性的變態(tài)等。瘤、瘦、癌、叢枝和發(fā)根也是常見的畸形病狀。觀察桃縮葉病、十字花科根腫病、馬鈴薯癌腫病、果樹根癌病、油菜白銹病、棗瘋病、泡桐叢枝病、玉米黑粉病、小麥粒線蟲病等。2

病征的觀察（1）粉狀物

借助擴(kuò)大鏡或?qū)嶓w解剖鏡觀察麥類銹病、十字花科白銹病、麥類白粉病、玉米黑粉病和麥類黑粉病等病害標(biāo)本。注意粉狀物的顏色、質(zhì)地和著生狀況等。（2）霉?fàn)钗?/p>

借助擴(kuò)大鏡或?qū)嶓w解剖鏡觀察黃瓜霜霉病、瓜類軟腐病、柑橘青霉病、番茄灰霉病和番茄葉霉病等病害標(biāo)本或瓶裝標(biāo)本。注意區(qū)別霜霉、黑霉、綿霉、青霉和灰霉等不同類型的霉?fàn)钗?。?）點(diǎn)狀物

取小麥白粉病、瓜類炭疽病、棉花莖枯病、芹菜斑枯病、蘋果樹腐爛病和麥類赤霉病等病害標(biāo)本,借助擴(kuò)大鏡或?qū)嶓w解剖鏡觀察。注意點(diǎn)狀物是埋生、半埋生還是表生,以及在寄主表面的排列狀況、顏色等。（4）菌核

觀察油菜菌核病等病害標(biāo)本。注意菌核的大小、形狀、顏色、質(zhì)地等,并觀察菌核萌發(fā)狀況。（5）溢膿

溢膿為細(xì)菌性病害特有的病征。觀察十字花科細(xì)菌性軟腐病、棉花角斑病和黃瓜角斑病等病害標(biāo)本。注意溢膿的顏色、出現(xiàn)位置等。用剪刀將植物病組織剪成4mm2的小塊,放于載玻片上,加一滴水,蓋上蓋玻片,在顯微鏡下觀察或直接用載玻片對光觀察噴菌現(xiàn)象。四、實(shí)驗作業(yè)與思考題將植物病害癥狀的觀察結(jié)果填入下表。寄主名稱病害名稱發(fā)病部位病狀類型病癥類型

五、實(shí)驗學(xué)時：2學(xué)時。實(shí)驗二

真菌一般形態(tài)觀察一、目的要求通過觀察，認(rèn)識病原真菌的營養(yǎng)體及其變態(tài),認(rèn)識真菌的子實(shí)體、有性繁殖、無性繁殖產(chǎn)生的各種類型孢子。二、儀器與用品撥針、刀片、木板、酒精燈、火柴、裁玻片、蓋玻片、紗布、乳酚油、二甲苯、顯微鏡、擦鏡紙、吸水紙等。三、實(shí)驗材料1.

瓜果腐霉病菌(Pytium

aphanidermatum)2.

立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)3.

鐮刀菌（fusarium）4.小麥白粉病菌（Blumeriagraminis）5.大白菜霜霉病菌（Peronosporaparasitica）6.

甘薯軟腐病菌（Rhizopusstolonifer）7.

小核菌屬（Sclerotium）8.

蘋果或甘薯紫紋羽病菌9.

麥角病菌（Clavicepspurpurea）10.

疫霉菌（Phythophtoraspp.）11.

根霉菌（Rhizopus

spp.）12.毛霉菌（Mucor

spp.）13.犁頭霉菌（Absidia

spp.）14.

玉米小斑?。˙ipolarismaydis）15.小麥白粉病〈無性世代〉〈Oidiummonilioides〉16.馬鈴薯早疫病〈Alternariasolani〉17.

棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporium)18.

桃縮葉病菌〈Taphrinadeformans〉19.小麥赤霉病菌〈Giberellazeae〉20.

小麥腥黑穗病菌〈Tilletiacaries〉四、內(nèi)容與方法病原真菌的營養(yǎng)體即真菌營養(yǎng)生長階段的結(jié)構(gòu)統(tǒng)稱為真菌的營養(yǎng)體。真菌典型的營養(yǎng)體是絲狀體,少數(shù)為單細(xì)胞。單根絲狀的營養(yǎng)體稱為菌絲,許多菌絲在一起就稱為菌絲體。用挑針挑取在培養(yǎng)皿內(nèi)的瓜果腐霉病菌(Pytium

aphanidermatum)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、鐮刀菌（fusarium）的菌絲體,用蒸餾水或乳酚油作浮載劑,制臨時玻片鏡檢,觀察菌絲隔膜的有無、菌絲體直徑變化是否明顯以及顏色有無差別等。（一）真菌營養(yǎng)體的變態(tài)

病原真菌營養(yǎng)體在一定條件下可發(fā)生變態(tài)而形成特殊的結(jié)構(gòu),這些變態(tài)是真菌適應(yīng)性的表現(xiàn),其作用是抵抗不良的環(huán)境條件,有利于傳播、固著吸收和繁殖。主要的變態(tài)有吸器、假根、菌核、子座以及根狀菌索等。1

吸器：吸器的形態(tài)有圓球狀、棒狀、裂片狀、掌狀、根狀等。在示范鏡下觀察小麥白粉病菌（Blumeriagraminis）和大白菜霜霉病菌（Peronosporaparasitica）的吸器形態(tài),也可用小鑷子撕取病葉的表皮,制臨時玻片放在顯微鏡下觀察,注意吸器的形狀和在細(xì)胞內(nèi)的位置。2假根：是由菌絲分化的根狀分枝。從培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基上挑取甘薯軟腐病菌（Rhizopusstolonifer）制片,鏡檢,觀察在孢囊?；康募俑?。3菌核：是菌絲糾結(jié)而成的堅固的顆粒狀休眠體。觀察小核菌屬（Sclerotium）的菌核切片及標(biāo)本,以及水稻和油菜上菌核的標(biāo)本。比較兩種菌核的大小、形狀和色澤有何不同?4根狀菌索：許多菌絲體平行生長并糾結(jié)成繩索狀,稱為根狀菌索。在示范鏡下觀察蘋果或甘薯紫紋羽病菌的根狀菌索。5子座：由菌絲體或由菌絲體和寄主組織共同組成的著生子實(shí)體的墊狀物。在子座上形成無性或有性孢子。在顯微鏡下觀察麥角病菌（Clavicepspurpurea）頭狀子座的切片，注意其內(nèi)部結(jié)構(gòu)與菌核的區(qū)別。（二）病原真菌的繁殖體一一子實(shí)體真菌產(chǎn)生孢子的機(jī)構(gòu)稱為子實(shí)體。病原真菌孢子的形態(tài)特征是鑒定和分類學(xué)上重要的依據(jù)。真菌的孢子可分為無性孢子和有性孢子兩類：1無性孢子

指真菌無性繁殖過程中產(chǎn)生的各種孢子。這類孢子在形成過程中沒有經(jīng)過任何性結(jié)合的過程。（1）游動孢子囊和游動孢子：鞭毛菌亞門真菌的無性繁殖器官是孢子囊。大多數(shù)鞭毛菌孢子囊可釋放出具鞭毛、在水中能游動的孢子,即游動抱子,故其孢子囊又稱為游動孢子囊。鏡檢疫霉菌（Phythophtoraspp.）在水中的培養(yǎng)物,注意觀察菌絲有無分隔、孢子囊的形態(tài)、游動孢子的形成以及釋放過程,游動孢子休止后的形態(tài),注意孢囊梗與菌絲有無區(qū)別。（2）孢子囊和孢囊孢子：接合菌亞門真菌的無性繁殖器官是孢囊孢子。鏡檢根霉菌（Rhizopus

spp.）、毛霉菌（Mucor

spp.）、犁頭霉菌（Absidia

spp.）的孢子囊結(jié)構(gòu)、孢囊孢子、孢囊梗、假根及匍匐絲。（3）分生孢子：半知菌亞門真菌和子囊菌的無性世代繁殖時都可產(chǎn)生分生孢子。分生孢子的色澤、形態(tài)變化較大,從無色至深色、單孢到多抱,并具多種形態(tài)。分生孢子著生在分生孢子梗上,分生孢子梗有色或無色、散生或聚生,或著生在分生孢子盤或分生孢子器內(nèi)。采用挑、刮或切片的方法,觀察玉米小斑?。˙ipolarismaydis）、小麥白粉病〈無性世代〉〈Oidiummonilioides〉、馬鈴薯早疫病〈Alternariasolani〉病害標(biāo)本,注意觀察其分生孢子的顏色,有隔或無隔,隔膜的類型及其形態(tài)，分生孢子梗的形態(tài),是否分枝及分枝的類型、顏色、著生位置等,若著生在分生孢子盤或分生孢子器內(nèi),注意觀察分生孢子盤或器的形態(tài)。（4）厚壁孢子：又稱厚垣孢子。由菌絲中個別細(xì)胞膨大、細(xì)胞壁加厚而形成的一種厚壁孢子。對不良環(huán)境的抵抗能力較強(qiáng)。挑取棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporium)的培養(yǎng)物制片、鏡檢,觀察厚垣抱子的形狀、顏色和壁的厚度。2

有性孢子

真菌有性生殖產(chǎn)生的孢子是由兩個有親和力的性細(xì)胞結(jié)合后發(fā)育形成的,包括卵孢子、接合孢子、子囊孢子和擔(dān)孢子。.,（1）卵孢子：是鞭毛菌亞門真菌產(chǎn)生的有性孢子,常由形態(tài)、大小不同的雌、雄性器官交配形成。卵孢子通常形成于藏卵器內(nèi),每個藏卵器內(nèi)可包含1至多個卵孢子,其數(shù)目因真菌種類不同而異。鏡檢谷子白發(fā)病菌卵孢子玻片標(biāo)本。觀察藏卵器的形態(tài)、色澤、壁光滑或有飾紋,雄器形態(tài)及其位置,卵孢子形態(tài),每個藏卵器內(nèi)卵孢子的數(shù)目、卵孢子是否充滿藏卵器。（2）接合孢子：接合菌亞門真菌產(chǎn)生的有性孢子,由兩個形狀和大小相似的雌、雄配子囊結(jié)合而成。觀察毛霉〈Mucorsp.〉或梨頭霉〈Absidiαsp.〉接合孢子的形狀、表面的飾紋、色澤、配囊柄的形狀,有無絲狀附屬物。（3）子囊孢子：子囊菌亞門真菌的有性孢子,產(chǎn)生在子囊內(nèi)。子囊孢子有色或無色、單孢或多孢,具多種形狀。子囊通常棍棒狀,有的近球狀,散生或著生在一定形態(tài)的子囊果內(nèi)。觀察桃縮葉病菌〈Taphrinadeformans〉子囊孢子的形狀、單細(xì)胞或多細(xì)胞、有色或無色。小麥全蝕病菌〈Gaeomanomicesgraminis〉子囊的形狀,是否具雙層子囊壁,子囊有無固定孔口，子囊果的類型,有閉囊殼、子囊殼、子囊盤或子囊腔。（4）擔(dān)孢子：擔(dān)子菌亞門真菌產(chǎn)生的有性孢子。擔(dān)孢子產(chǎn)生在擔(dān)子上。觀察小麥腥黑穗病菌〈Tilletiacaries〉冬孢子萌發(fā)形成的擔(dān)子及擔(dān)孢子的形態(tài)。五、實(shí)驗作業(yè)繪制有隔菌絲、無隔菌絲、各類無性孢子和有性孢子的形態(tài)圖。六、實(shí)驗學(xué)時：2學(xué)時。實(shí)驗三

鞭毛菌亞門真菌形態(tài)及其所致病害癥狀觀察鞭毛菌亞門真菌是一類低等真菌，其中不少是水生的。它們的共同特征是無性繁殖時產(chǎn)生有鞭毛的游動孢子。根據(jù)菌體的形態(tài)和游動孢子鞭毛的特征分為根腫菌綱、壺菌綱、絲壺菌綱和卵菌綱。其中與植物病害關(guān)系較為密切的有根腫菌綱、壺菌綱、卵菌綱。一、目的要求了解鞭毛菌亞門中根腫菌綱、壺菌綱和卵菌綱真菌的主要形態(tài)特征,掌握與植物病害有關(guān)的重要屬的形態(tài)特征、分類依據(jù)及所致病害的癥狀特點(diǎn)。同時,學(xué)習(xí)使用檢索表來鑒定病菌,為分類鑒定打下初步基礎(chǔ)。二、儀器與用品顯微鏡、幻燈機(jī)、技影儀、計算機(jī)及多媒體教學(xué)設(shè)備；載玻片、浮載劑(蒸餾水或乳酚油)、吸水紙、解剖刀、撥針、鑷子、紗布、酒精燈、無菌水等。三、實(shí)驗材料1.

蕓薹根腫菌(Plasmodiophora

brassicae)。2.

玉蜀黍節(jié)壺菌(Physoderma

maydis)。3.瓜果腐霉(Pythium

aphanidermatum)。4.

致病疫霉(Phytophthora

infenstans)。5.禾生指梗霉(Sclerospora

graminis)

。6.

葡萄霜霉病菌(Plasmopara

viticola)。7.

寄生霜霉(Peronospora

parasitica)。8.

瓜類霜霉病菌(Pseudoperonospora

cubensis)。9.

萵苣盤梗霉(Bremia

lactucae)。10.

十字花科白銹病菌(Albugo

candida)。以上病害標(biāo)本或新鮮材料、掛圖、病原菌永久玻片,多媒體教學(xué)課件(包括幻燈片、錄像帶、光盤等影像資料)以及水霉、腐霉和疫霉游動孢子形成與釋放的錄相帶等。四、觀察內(nèi)容和方法(一)根腫菌綱蕓薹根腫菌(Physoderma

maydis)

取甘藍(lán)根腫菌切片,鏡檢切片中的病原菌。有的寄主細(xì)胞內(nèi)可見到許多堆集在一起的魚籽狀顆粒,是病菌的休眠孢子。休眠孢子近球形。(二)壺菌綱玉蜀黍節(jié)壺菌(Physoderma

maydis)

觀察由玉蜀泰節(jié)壺菌引起的玉米褐斑病標(biāo)本。用撥針挑取受害病組織內(nèi)呈黃色粉末狀物制成臨時玻片,或?qū)Σ〗M織作徒手切片,鏡檢可見到許多金黃色扁球狀的休眠孢子。休眠孢子橢圓形,一面扁平有蓋。(三)卵菌綱1

腐霉屬(Pythium)

觀察瓜果的腐爛病病果上的白色菌絲體,將生長旺盛的小塊菌絲體移至清水中培養(yǎng)24~48h,菌絲頂端即形成大量游動孢子囊,用針挑取在清水中培養(yǎng)過的菌絲,觀察腐霉菌的游動孢子囊。游動孢子囊絲狀、姜瓣狀或球狀等,頂生或間生,無特殊分化的孢囊梗。孢子囊不脫落,萌發(fā)時在其頂端產(chǎn)生一管狀物,原生質(zhì)經(jīng)管狀物排出而形成泡囊。游動孢子產(chǎn)生在泡囊內(nèi)。2

疫霉屬(Phytophthora)

取馬鈴薯或番茄晚疫病標(biāo)本制片觀察。孢囊梗2~3支成叢,自氣孔伸出,假軸狀分枝,小?；颗虼?多次產(chǎn)生孢子囊,使孢子囊梗上部呈節(jié)狀；

孢子囊近球狀、卵形或梨形等,具乳突。3霜霉屬(Peronospora)

取十字花科植物(油菜、白菜等)的霜霉病標(biāo)本從葉背面刮取霉層觀察。孢囊梗二叉狀銳角分枝,末端尖銳。按照寄生霜霉的觀察方法,選取禾生指梗霉、葡萄霜霉病菌、瓜類霜霉病菌、萵苣盤梗霉等材料,對照下列檢索表,制片觀察各種霜霉病的病原菌或觀察病菌永久玻片標(biāo)本,掌握霜霉科幾個常見屬的主要形態(tài)特征。霜霉科主要屬的檢索表1.

孢囊梗粗壯,上部為重復(fù)2~3次的不規(guī)則二叉分枝…………指梗霉屬（Sclerospora）孢囊梗較細(xì)………………22.

孢囊梗單軸分校,小軸與主軸成直角,分枝末端平鈍…………單軸霉屬(Plasmopara)孢囊梗呈現(xiàn)銳角二叉分枝………………33.分枝兩側(cè)不對稱,頂端尖銳……………假霜霉屬(Pseudoperonospora)分枝兩側(cè)對稱……………44.分枝頂端尖細(xì)……………………霜霉屬(Peronospora)分枝頂部膨大,呈盤狀,具3~4個指狀周生小梗……盤梗霉屬(Bremia)4

白銹菌屬(Albugo)

鏡檢十字花科白銹病菌組織切片,或取以上病葉徒手切片制成臨時玻片鏡檢。孢囊梗平行排列在寄主表皮下,短棍棒形,

孢子囊串生。白銹菌為害癥狀是在寄主表面產(chǎn)生乳白色或粉狀的病斑,這是病菌在寄主表皮下形成的孢子囊堆,白色粉狀物是成熟的孢子囊。五、實(shí)驗作業(yè)與思考題1.鞭毛菌亞門真菌的共同特征和分類依據(jù)是什么?2.以營養(yǎng)體、無性繁殖、有性生殖來比較鞭毛菌亞門三個綱的區(qū)別。3.觀察十字花科蔬菜根腫病菌、玉米褐斑病菌、水霉菌或綿霉菌,繪休眠孢子囊或游動孢子囊圖。4.繪瓜果腐霉病菌、馬鈴薯晚疫病菌或十字花科蔬菜白銹病菌孢囊梗、孢子囊、卵孢子圖。5.繪瓜類霜霉病菌、萵苣霜霉病菌、葡萄霜霉病菌孢囊梗、孢子囊圖。6.詳繪大白菜霜霉病和粟白發(fā)病的病原形態(tài)圖(包括無性繁殖和有性生殖)7.卵菌綱真菌有哪些特點(diǎn)?結(jié)合它們的生物學(xué)特性、說明本綱真菌進(jìn)化的情況。六、實(shí)驗學(xué)時：3學(xué)時。實(shí)驗四

接合菌亞門真菌形態(tài)及其所致病害癥狀觀察接合菌亞門真菌的共同特征是有性生殖產(chǎn)生接合孢子。大多數(shù)是腐生的,少數(shù)可以引起農(nóng)產(chǎn)品的腐爛。接合菌營養(yǎng)體為發(fā)達(dá)的無隔菌絲體,無性繁殖產(chǎn)生具細(xì)胞壁的孢囊孢子,有性生殖產(chǎn)生接合孢子。

孢子囊的形態(tài)、孢囊孢子釋放以及寄生性等是重要的分類依據(jù)。一

目的要求通過實(shí)驗掌握接合菌的一般形態(tài)及其所致病害的癥狀類型。二儀器與用品顯微鏡、幻燈機(jī)、投影儀、計算機(jī)及多媒體教學(xué)設(shè)備；滅菌培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、浮載劑（蒸餾水或乳酚油）、吸水紙、解剖刀、撥針、鑷子等。三、觀察內(nèi)容和方法(一)

甘薯軟腐?。≧hizopusstolonifer）癥狀觀察受害甘薯變軟腐爛,有時散發(fā)出酒味,病薯表面長出白色、灰色至黑色毛狀物。仔細(xì)觀察,能見到白色菌絲體中有許多小黑點(diǎn)。小黑點(diǎn)是病菌的孢子囊。用針挑取霉層制片、鏡檢,觀察孢子囊、孢囊孢子、孢囊梗及囊軸、假根的形態(tài)。(二)

匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)培養(yǎng)物的鏡檢觀察用撥針仔細(xì)地從培養(yǎng)的匍枝根霉菌中挑取少許連有培養(yǎng)基的培養(yǎng)物,制成臨時玻片,在低倍鏡下檢查,或者用實(shí)體解剖鏡直接觀察培養(yǎng)皿上的菌體。觀察菌絲的形態(tài)和具有分枝的孢囊梗及其基部的假根,

孢囊梗之間有匍枝狀的菌絲相連,在孢囊梗基部有深入寄主細(xì)胞或基質(zhì)中分枝狀的假根。在每一個孢囊梗的頂端產(chǎn)生一個圓球狀的孢子囊。用高倍鏡觀察孢子囊內(nèi)部的構(gòu)造,在未成熟的孢子囊內(nèi),往往只有大量的小顆粒體,接近成熟的或成熟的孢子囊內(nèi)則充滿了許多褐色圓形的孢囊孢子。孢子囊壁破裂后,

孢子散出,露出鑼錘形的囊軸。(三)

接合孢子觀察取根霉屬(Rhizopus)、毛霉屬(Mucor)和犁頭霉屬(Absidia)接合孢子玻片標(biāo)本觀察,并注意原配子囊、配囊柄及配子囊的發(fā)育特點(diǎn)。成熟的接合孢子深褐色,表面粗糙。犁頭霉菌的接合孢子在配子囊柄的著生處有附屬絲。注意觀察配囊柄的形狀及大小。四、實(shí)驗作業(yè)和思考題1.接合菌亞門真菌的主要特點(diǎn)是什么?與鞭毛菌亞門有何區(qū)別?2.繪匍枝根霉菌孢子囊、孢囊梗、孢囊孢子、假根、匍匐菌絲和接合孢子形態(tài)圖。五、實(shí)驗學(xué)時：1學(xué)時。實(shí)驗五：子囊菌亞門真菌形態(tài)及其所致病害癥狀觀察子囊菌是一類高等真菌。菌絲體一般都很發(fā)達(dá),有隔膜,具分枝,有的菌絲體可以形成菌核、子座等機(jī)構(gòu)。子囊菌的共同特點(diǎn)是有性生殖產(chǎn)生子囊和子囊孢子。子囊菌所致病害的種類很多,其中許多是重要的經(jīng)濟(jì)作物病害。子囊菌亞門分綱的主要依據(jù)是子囊果及子實(shí)層的有無、子囊果的類型、子囊的特征等。據(jù)此分6個綱：半子囊菌綱、不整囊菌綱、核菌綱、腔菌綱、盤菌綱和蟲囊菌綱。一

目的要求通過實(shí)驗,了解子囊菌亞門各個綱病原菌的主要形態(tài)特征,掌握子囊菌中與植物病害有關(guān)的重要屬的形態(tài)特征、分類依據(jù)及所致主要病害的癥狀特點(diǎn)。二

儀器與用晶顯微鏡、幻燈機(jī)、投影儀、計算機(jī)及多媒體教學(xué)設(shè)備；載玻片、蓋玻片、浮載劑(蒸餾水或乳酚油)、吸水紙、解剖刀、撥針、鑷子、紗布、刀片、擦鏡紙、無菌水等。三、實(shí)驗材料

1桃縮葉病(Taphrinadeformans)。2散囊菌(Eurotium

sp.)。3禾白粉病菌(Blumeria

graminis)。4向日葵白粉病菌(Erysiphe

cichoracearum)。5瓜白粉病菌(Sphaerotheca

fuliginea)。6桃白粉病菌(Podosphaera

tridactyla

)。7洋槐白粉病菌(Microphaera

sp.)8桑里白粉病菌(Phyllactinia

corylea)。9葡萄白粉病菌(Uncinula

necator)。10甘薯黑斑病菌(ceratocystis

fimbriata)。11玉蜀黍赤霉菌(Gibberella

zeae)。12蘋果樹腐爛病菌(Valsa

mali)。13小麥全蝕病菌(Gaeumannomyces

graminis)。14黑麥麥角菌(Claviceps

purpurea)。15竹多腔菌(Myriangium

haraeanum)。16蔥葉枯病菌（Mycrosphaerella

sp.)。17核盤菌(Sclerotinia

sclerotiorum)。以上病害標(biāo)本或新鮮材料、掛圖、病原菌永久玻片、多媒體教學(xué)課件（包括幻燈片、錄像帶、光盤等影像資料）。四、觀察內(nèi)容和方法(一)半子囊菌綱外囊菌屬(Taphrina)。取桃縮葉病材料作臨時玻片,在顯微鏡下檢查。可看見子囊在寄主葉片的表皮下排列成柵欄狀,形成無包被的子囊層,子囊下有足胞,常含孢子4~8個。子囊圓筒形,近球形或橢圓形。(二)不整囊菌綱散囊菌屬(Eurotium)。觀察示范鏡下散囊菌的閉囊殼、子囊或散在閉囊殼內(nèi)的子囊孢子。閉囊殼壁薄,只有2~3層細(xì)胞構(gòu)成。子囊孢子單胞、近圓形。(三)核菌綱1.白粉菌目

是專性寄生菌。白粉菌侵染植物可引起多種植物的白粉病。白粉菌菌絲表生，在寄主體表擴(kuò)展蔓延。一般在葉部引起褪綠或黃色斑,以后葉面出現(xiàn)白色或灰白色的粉狀物,即白粉菌的無性繁殖形成的分生孢子。生長后期,在病部形成許多黑色小顆粒。這些小黑點(diǎn)是白粉菌的閉囊殼。閉囊殼有附屬絲,附屬絲呈絲狀,其形態(tài)因種而異。閉囊殼內(nèi)子囊數(shù)目也不一樣,一至多個。附屬絲的形狀和子囊數(shù)目的多少是分屬的依據(jù)。選取小麥白粉病、向日葵白粉病、瓜白粉病、桃白粉病、洋槐白粉病、桑里白粉病、葡萄白粉病等不同材料。在實(shí)體解剖鏡下觀察閉囊殼及附屬絲的輪廓及形態(tài)。挑取閉囊殼作臨時玻片，在顯微鏡下檢查；注意閉囊殼的形狀、有無孔口、閉囊殼表面附屬絲的形狀和著生部位。然后輕輕擠壓蓋玻片,使閉囊殼破裂。觀察閉囊殼內(nèi)的子囊,數(shù)數(shù)是單子囊還是多子囊。對照下列檢索表,觀察各種白粉病的病原菌永久玻片或標(biāo)本,掌握白粉菌科幾個常見屬的主要形態(tài)特征及所致病害癥狀。白粉菌主要屬檢索表：1.閉囊殼內(nèi)單個子囊……………………2閉囊殼內(nèi)多個子囊……………………32.附屬絲菌絲狀…………………單囊殼屬(Sphaerotheca)附屬絲剛直,較粗,頂端二叉狀重復(fù)分枝,分校末端螺旋狀卷曲…叉絲單囊殼屬(Podosphaera)3.附屬絲菌絲狀…………4附屬絲非菌絲狀………………………54.附屬絲發(fā)育不良,較短-………布氏白粉菌屬(Blumeria)附屬絲較長………白粉菌屬(Erysiphe)5.附屬絲剛直,基部膨大,頂端尖銳……………球針殼屬(Phyllactinia)附屬絲基部不膨大……………………66.附屬絲粗,剛直,頂端二叉狀重復(fù)分枝,分枝末端卷曲………叉絲殼屬(Microphaera)附屬絲不分枝,頂端卷曲…………鉤絲殼屬(Uncinula)2.球殼菌目(1)長嗦殼屬(ceratocystis)

觀察甘薯黑斑病菌培養(yǎng)物,挑取病菌灰白色物中間深褐色或黑色毛刺狀小點(diǎn),觀察病菌的子囊殼。子囊殼深色、球形,有長頸,開口處有須狀物,稱口須。輕壓蓋玻片將子囊殼壓破,成熟的子囊孢子頭盔狀,子囊壁早期膠化消解。(2)赤霉屬(Gibberella)

取培養(yǎng)在麥粒上的玉蜀泰赤霉菌子囊殼,制成臨時玻片在顯微鏡下觀察。子囊殼藍(lán)色或紫色,散生或聚生。子囊孢子多個細(xì)胞,梭形。(3)黑腐皮殼屬(Valsa)

取蘋果樹腐爛病菌切片鏡檢,子囊殼埋生在子座內(nèi),有長頸伸出子座。子囊孢子單細(xì)胞,香蕉形。(4)頂囊殼屬(Gaeumannomyces)

觀察小麥全蝕病害標(biāo)本,注意病株基部根系生長不良,莖基部葉鞘枯腐,葉鞘內(nèi)有黑色小顆粒狀物,即病菌的子囊殼。取含有子囊殼葉鞘做切片,置顯微鏡下觀察子囊殼形態(tài),子囊殼頂端有短喙,子囊孢子細(xì)線狀,多細(xì)胞。(5)麥角菌屬(Claviceps)

取黑麥麥角菌切片,置顯微鏡下觀察。頭狀子座內(nèi)壁周圍有瓶狀子囊殼,子囊殼開口向外。子囊殼內(nèi)有子囊和子囊孢子。子囊細(xì)長,子囊孢子線形。(四)腔菌綱1.多腔菌屬(Myriangium)

取竹多腔菌切片置顯微鏡下觀察,可見到很發(fā)達(dá)的子囊座組織。子囊球形,單生,子囊孢子有縱橫隔膜,磚格狀。2.球腔菌屬(Mycosphaerella

)

取蔥葉枯病菌切片,置顯微鏡下觀察。單腔多子囊，子囊圓柱形至棍棒形,有雙層壁。子囊初期束生,后平行排列；子囊孢子橢圓形,雙胞。3.格抱腔菌屬(Pleospora)

取首宿輪紋病病菌切片,置顯微鏡下觀察。子囊孢子長圓形或卵圓形,磚格狀(多細(xì)胞,有縱橫分隔)。(五)盤菌綱核盤菌屬(Sclerotinia)

取油菜菌核病菌子囊盤切片,置顯微鏡下觀察。子囊盤具長柄,子囊孢子橢圓形或紡錘形。觀察油萊菌核病癥狀及菌核萌發(fā)標(biāo)本。菌核球形至豆瓣形,鼠糞狀,一般生子囊盤4~5個。菌核上形成的子是盤具長柄。五、實(shí)驗作業(yè)與思考題1.子囊菌亞門各綱的主要特征是什么?2.繪外囊菌屬和散囊菌屬的形態(tài)圖。3.白粉屬和單絲殼屬、叉絲殼屬和叉絲單囊殼屬的主要區(qū)別是什么4.繪白粉屬、叉絲單囊殼屬、球針殼屬、鉤絲殼屬的形態(tài)圖。5.繪赤霉屬、多腔菌屬、核盤菌屬形態(tài)圖。6.子囊菌有性繁殖體的病征類型和特點(diǎn)是什么?六、實(shí)驗學(xué)時：4學(xué)時。實(shí)驗六

擔(dān)子菌亞真菌形態(tài)及其所致病害癥狀觀察擔(dān)子菌亞門真菌一般稱作擔(dān)子菌,是真菌中最高等的。其共同特征是有性生殖產(chǎn)生擔(dān)子和擔(dān)孢子。擔(dān)子菌亞門的分綱依據(jù)是擔(dān)子果的有無。擔(dān)子果的發(fā)育類型可分為三個綱：冬孢菌綱、層菌綱、腹菌綱。與植物病害關(guān)系密切的是冬孢菌綱。根據(jù)擔(dān)子的來源及特征,擔(dān)孢子的數(shù)目及位置,冬孢菌綱分為銹菌目和黑粉菌目。銹菌的分類主要依據(jù)冬孢子的形態(tài)、排列和萌發(fā)的方式。而黑粉菌主要依據(jù)冬孢子的萌發(fā)方式、孢子的分隔、排列及其大小、形狀及是否有不孕細(xì)胞等進(jìn)行分類。一、目的要求通過實(shí)驗了解擔(dān)子菌亞門冬孢菌綱主要病原菌的形態(tài)特征,掌握銹菌目和黑粉菌目中與植物病害有關(guān)的重要屬的形態(tài)特征、分類依據(jù)及所致主要病害的癥狀特點(diǎn)。二、儀器與用品顯微鏡、幻燈機(jī)、技影儀、計算機(jī)及多媒體教學(xué)設(shè)備；滅菌培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、浮載劑(蒸餾水或乳酚油)、吸水紙、解剖刀、挑針、鑷子、紗布、蒸館水滴瓶、刀片、擦鏡紙、酒精燈、無菌水、PDA培養(yǎng)基等。三、實(shí)驗材料1.銹菌目(1)

菜豆銹菌(Uromycesappendiculatus)。(2)

禾柄銹菌(Puccinia

graminis

f.sp.tritici)(3)

小麥葉銹菌(Puccinia

recondita)。(4)

小麥條銹菌(Pucciniastriiformis)。(5)

梨膠銹菌(Gymnosporagium

haraeanum)。(6)

薔薇多胞銹菌(Phragmidiumrosae－multiflorae)(7)

亞麻銹菌(Melampsora

lini

)。(8)

花椒鞘銹菌(Coleosporium

xanthoxyli)(9)

松櫪銹菌(Cronartiumquercum)(10)

棗層銹菌(Phakopsora

ziziyphi－vulgaria)2.黑粉菌目(1)

小麥散黑粉菌(Ustilago

tritici

)(2)

玉蜀黍黑粉菌(U.maydis)。(3)

絲孢堆黑粉菌(Sporisorium

reilianum)。(4)

高粱堅孢堆黑粉菌(Sporisorium

sorghi)。(5)

高粱散孢堆黑粉菌(Sporisorium

crtentum)(6)

小麥網(wǎng)腥黑穗菌(Tilletiacaries)。(7)

小麥光腥黑穗菌(Tilletia

tritici)。(8)

稻尾孢黑粉菌(Neovossia

horrida)(9)

稻葉黑粉菌(Entyloma

oryzae)。(10)

小麥條黑粉菌(Urocystis

tritici)。以上病菌引起的病害標(biāo)本或新鮮材料、掛圖、病原菌永久玻片和病菌的PDA培養(yǎng)物；多媒體教學(xué)課件(包括幻燈片、錄像帶、光盤等影像資料)。四、觀察內(nèi)容和方法{一}冬孢子萌發(fā)試驗冬孢菌綱不同類型冬孢子萌發(fā)方法各不相同，幾種常見的冬孢子的萌發(fā)方法如下：1.小麥網(wǎng)腥黑穗菌和光腥黑穗菌

將冬孢子撒在保濕器內(nèi)用1%硝酸鈣液潤濕的濾紙上,在17～22℃下培養(yǎng),每天于日光燈下照射4h,3d后檢查萌發(fā)情況。2.小麥條銹病菌

取帶冬孢子病葉在0.5%~1%檸檬酸中浸15min,再放于兩層潮濕的濾紙之間,于－2～－5℃下冷凍5d后,挑取冬孢子置于水滴內(nèi),在冰箱內(nèi)(4℃)保存48h即可萌發(fā)。(二)銹菌目1.單胞銹菌屬(Uromyces)

觀察菜豆銹病標(biāo)本,挑取冬孢子制成玻片觀察。冬孢子具柄,單細(xì)胞。2.柄銹菌屬(Puccinia)

觀察小麥軒銹病、小麥葉銹病或小麥條銹病標(biāo)本,冬孢子堆黑色。將有冬孢子堆的寄主葉片組織切下,制切片于顯微鏡下觀察。冬孢子有一隔膜,分隔處稍縫縮,柄不膠化。3.膠銹菌屬(Gymnosporagium

)

從用水浸泡過的膠銹菌冬孢子角上用挑針挑取冬孢子制片觀察。冬孢子雙胞,分隔處不縫縮或稍縫縮。柄絲狀,很長,含膠質(zhì)。4.多胞銹屬(Phragmidium)

挑取攻瑰銹病組織上的冬孢子,制片觀察。冬孢子多細(xì)胞,通常下部膨大易膠化。5.柵銹菌屬(Melampsora)

取亞麻銹菌病組織制作徒手切片觀察。冬孢子無柄,集成殼狀或墊狀,冬孢子僅側(cè)面結(jié)合成一層,埋生于寄主表皮下。6.鞘銹菌屬(Coleosporium)

取花椒銹病組織制作切片觀察。冬孢子堆生于葉背或排列成環(huán)狀,圓形黃褐色。冬孢子無柄,集成殼狀或墊狀的孢子粒,集生于寄主表皮層下。7.柱銹菌屬(Cronartium)

取馬尾松銹病標(biāo)本制片觀察。冬孢子堆生于葉背,毛狀,冬孢子梭形。8.層銹菌屬(Phakopsora)

取棗銹病組織制作切片觀察。冬孢子堆呈黑色,冬孢子排成2~4層,長橢圓形或多角形。(三)黑粉菌目1.黑粉菌屬(Ustilago)

孢子堆外露,很少由寄主組織長期包裹。擔(dān)子分隔,擔(dān)孢子生在擔(dān)子每一細(xì)胞的側(cè)面。挑取小麥散黑粉(穗)病組織上的冬孢子制成玻片觀察。冬孢子球形或近球形。另取冬孢子萌發(fā)切片觀察。冬孢子萌發(fā)產(chǎn)生4個細(xì)胞的擔(dān)子,從擔(dān)子的不同細(xì)胞分別生出絲狀分枝,不產(chǎn)生擔(dān)孢子。挑取玉米瘤黑粉病組織上的冬孢子制片觀察,冬孢子球形至卵形。另取冬孢子萌發(fā)切片觀察。冬孢子萌發(fā)時產(chǎn)生有隔擔(dān)子,擔(dān)子頂端或分隔處側(cè)生梭形的擔(dān)孢子。2.孢堆黑粉菌屬(Spoisorium)

冬孢子堆周圍有膜(不孕菌絲),中央有寄主組織,擔(dān)子分隔,擔(dān)孢子生在擔(dān)子每一細(xì)胞的側(cè)面。挑取高粱絲黑穗病組織上的冬孢子制片觀察。冬孢子卵圓形或球形,暗褐色,有時混生有不孕細(xì)胞。不孕細(xì)胞無色透明。取高粱堅粒黑穗病標(biāo)本觀察。孢子堆生于子房中。冬孢子多圓形或近圓形,不孕細(xì)胞長圓形至近圓形。取高粱散粒黑穗病標(biāo)本觀察。冬孢子堆有由菌絲體組成的灰白色被膜。冬孢子球形,分散。3.腥黑粉菌屬(Tilletia)

取小麥網(wǎng)腥黑穗病或小麥光腥黑穗病標(biāo)本觀察。冬孢子單生,

孢子堆成熟時呈粉末狀,冬孢子較小。孢子堆生于子房內(nèi),外包果皮,內(nèi)部充滿黑紫色粉狀子包子,有腥味。4.尾孢黑粉菌屬(Neovossia)

取水稻粒黑穗病標(biāo)本挑片觀察。孢子堆寄生于子房內(nèi),產(chǎn)生黑粉。挑取黑粉制片,顯微鏡下可見,

孢子球形,常有一部分未成熟的透明孢子。5.葉黑粉菌屬(Entyloma)

取水稻葉黑粉病標(biāo)本,切片觀察。孢子堆生于葉的兩面,圓形至長條形。孢子多角形，結(jié)合緊密。取萌發(fā)的擔(dān)孢予玻片觀察,擔(dān)孢子頂生于擔(dān)子上,紡錘形。6.條黑粉菌屬(Urocystis)

取小麥秤黑粉病標(biāo)本,制片觀察。一至多個厚垣孢子集結(jié)成牢固的孢子球,

孢子球外有淡色而小的不孕細(xì)胞包圍。五、實(shí)驗作業(yè)1.繪黑粉菌屬、腥黑粉菌屬和條黑粉菌屬冬孢子形態(tài)圖。2.繪腥黑粉菌屬冬孢子萌發(fā)圖。3.繪柄銹菌屬、單胞銹菌屬、柵銹菌屬和膠銹菌屬冬孢子形態(tài)圖。實(shí)驗七

半知菌亞門真菌形態(tài)及其所致病害癥狀觀察半知菌亞門真菌的種類很多,其中不少是植物病害的重要病原菌。半知菌的分類主要是根據(jù)無性階段的形態(tài)特征,包括分生孢子的形態(tài)、載孢體的類型、產(chǎn)孢方式等。半知菌亞門分3個綱。芽孢綱：營養(yǎng)體為單細(xì)胞或發(fā)育程度不同的菌絲體或假菌絲,通過產(chǎn)生芽孢子繁殖；絲孢綱：營養(yǎng)體是發(fā)達(dá)的菌絲體,分生抱予不產(chǎn)生在分生孢子盤或分生孢子器內(nèi)；腔孢綱：分生孢子產(chǎn)生在分生孢子盤或分生孢子器內(nèi)。與植物病害關(guān)系比較密切的是絲孢綱和腔孢綱。一、目的要求通過實(shí)驗認(rèn)識半知菌子實(shí)體的類型及重要致病菌屬的形態(tài)特征,掌握常見植物病原半知菌屬的鑒別特征。二、儀器與用品顯微鏡、幻燈機(jī)、投影儀、計算機(jī)及多媒體教學(xué)設(shè)備；滅菌培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、浮載劑(蒸餾水或乳酚油)、吸水紙、解剖刀、挑針、鑷子、紗布、刀片、酒精燈、放大鏡、恒溫箱、方木塊、剪刀等。三、實(shí)驗材料半知菌引起的病害標(biāo)本或新鮮材料、掛圖、病原菌永久玻片和病菌的PDA培養(yǎng)物；多媒體教學(xué)課件(包括幻燈片、錄像帶、光盤等影像資料)。1.絲孢綱(1)

立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)。(2)

齊整小核菌(Sclerotiumrolfsii)。(3)

稻梨孢(Pyriculariaoryzae)。(4)

玉蜀黍平臍蠕孢(Bipolaris

maydis)。(5)

玉米大斑突臍蠕孢(Exerohilum

turcicum)。(6)

大麗輪枝菌(Verticillium

dahliae)。(7)

蕓薹鏈格孢(Alternaria

brassicae)。(8)

球座尾孢(Cercospora

personata)。(9)

梨黑星孢(Fusicladium

virescens)。(10)

灰葡萄孢(Botrytis

cinerea)。(11)

粉紅聚端孢(Trichotheheciumroseum)。(12)

意大利青霉(Penicillium

italicum)。(13)

褐孢霉(Fulvia

fulva)。(14)

尖孢鐮刀菌(Fusarium

oxysporium)。2.腔孢綱(1)

膠孢炭疽菌(Colletotrichum

gloeosporioides)。(2)

葡萄痂圓孢(Sphaceloma

ampelinum)。

(3)

梨殼囊孢(Cytospora

carphosperma)。(4)

芹菜生殼針孢(Septoria

apiicola)。(5)

高粱生殼二孢(Ascochyta

sorghina)。(6)

甜菜蛇眼病菌(Phoma

beta

)。(7)

梨葉點(diǎn)霉(Phyllosticta

pyrina)。四、觀察內(nèi)容和方法(一)絲孢綱1.絲核菌屬(Rhizoctonia)

觀察預(yù)先培養(yǎng)的棉花立枯病菌或小麥紋枯病菌菌落。菌核褐色至黑褐色。挑取菌絲制片觀察。菌絲粗壯,菌絲分校呈直角,分隔處?？O縮。2.小核菌屬(Sclerotium)

取花生白絹病或小麥、大豆、棉花、煙草等白絹病菌標(biāo)本或培養(yǎng)觀察。病菌菌絲白色絹絲狀；菌核圓形至長圓形,褐色至黑色,表面暗色,中心無色,組織致密,干時極硬,彼此無菌絲相連。3.梨孢屬(Pyricularia)

取水稻稻瘟病標(biāo)本,用挑針挑取病葉上的霉?fàn)钗镏破^察。分生孢子梗細(xì)長,淡褐色,頂部以合軸式延伸,呈屈膝狀,分生孢子多胞,梨形。4.平臍蠕孢屬(Bipolaris)

取玉米小斑病葉,挑取病斑上的霉層觀察。分生孢子梗單生或叢生,上部呈屈膝狀彎曲；分生孢子蠕蟲形或長橢圓形,,多胞,臍點(diǎn)稍微突出,平截狀。5.突臍蠕孢屬(Exerohilum)

取玉米大斑病病葉,用挑針挑或刮取其上的黑色霉?fàn)钗镏破?置顯微鏡下觀察。其分生孢子梗暗色,具分隔,一般少分枝,上部呈屈膝狀。分生孢子棱形,多胞,臍點(diǎn)明顯突出于基細(xì)胞外部。提示：觀察時注意與平臍蠕孢屬的區(qū)別,主要在于其臍點(diǎn)是否突出。6.鐮孢屬(Fusarium)

取瓜類枯萎病菌培養(yǎng)觀察。氣生菌絲白色,絨毛狀,在PDA培養(yǎng)基上底部呈淡黃色或淡紫色。撥針挑取培養(yǎng)物制片觀察。小型分生孢子量大,無色,卵圓形,單胞,偶爾雙胞；大型分生孢子無色,紡錘形或鐮刀形，1~5個隔膜,基部有時有一顯著的突起,稱足胞。提示：有時可觀察到厚垣孢子,頂生或間生于菌絲體上。7.輪枝孢屬(Verticillium)

取培養(yǎng)好的棉花黃萎病菌平皿,直接放于顯微鏡載物臺上觀察。其分生孢子梗細(xì)長,直立,具分隔,呈輪狀分枝。分生孢子梗呈直角分枝。分生孢子單胞,生于分枝頂端。提示：培養(yǎng)菌用的培養(yǎng)基不宜太厚,以便透射光能穿透,平皿放到載物臺上小心移動,使視野覆蓋菌落邊緣,這樣才能找到理想的輪狀分枝結(jié)構(gòu)。8.鏈格孢屬(Alternaria)

取白菜黑斑病病葉,用挑針挑取病斑上的黑色霉?fàn)钗镏破?顯微鏡下觀察。分生孢子長棍棒狀,具縱橫分隔,呈磚格狀,頂端有一長條形喙?fàn)罴?xì)胞。9.尾孢屬(Cercospora).

取芹菜早疫病(斑點(diǎn)病)病葉,挑取霉層制片觀察。分生孢子梗不分枝或少有分枝。分生孢子單生,鞭狀,具多數(shù)分隔。10黑星孢屬(Fusicladium)

挑取梨黑星病葉上的煤煙狀霉層制片觀察。分生孢子梗暗色,頂部稍屈曲,

孢痕明顯。分生孢子淡褐色,1~2胞,瓜子形。提示:注意分生孢子梗的孢痕,在顯微鏡透射光源照射下呈現(xiàn)亮點(diǎn)。11.葡萄孢屬(Botrytis)

取黃瓜或番茄灰霉病標(biāo)本,挑取其上的灰霉?fàn)钗镏破^察。分生孢子梗頂端分校,末端膨大,并產(chǎn)生小突起,其上著生多數(shù)分生抱子,外觀呈葡萄穗狀。12.聚端孢屬(Trichothehecium)

取棉鈴紅粉病標(biāo)本,挑取霉層制片觀察。分生孢子梗直立,少分隔或不分隔。分生孢子元色,雙胞,洋梨形,常以基部交錯相連的方式在孢子梗頂端聚集成孢子鏈。13.青霉屬(Penicillium

)

取柑桶青霉病標(biāo)本或病菌培養(yǎng),挑片觀察。分生孢子梗集結(jié)成束,“掃帚狀”分枝,分枝末端為瓶狀小梗,分生孢子著生在瓶狀小梗上。14.褐孢霉屬(Fulvia)

取番茄葉霉病標(biāo)本,挑取霉層制片顯微鏡下觀察。分生孢子?；考?xì),上部粗。分生孢子串生,

孢子鏈常分枝,并有芽狀突起。

(二)腔孢綱1.炭疽菌屬(Colletotrichum)

取蘋果炭瘟病標(biāo)本制片觀察。分生孢子盤埋生于寄主表皮下,墊狀無剛毛,成熟后突破表皮,分生孢子梗平行排列成一層。分生孢子單胞。提示：切片時最好用新鮮采集的標(biāo)本,如果標(biāo)本干燥可用蒸餾水濕潤一下再進(jìn)行切片,切出的絲條越薄越好,若用乳酚油作浮載劑效果更好。2.痂圓孢屬(Sphaceloma)

取葡萄黑癥病標(biāo)本,切片觀察。孢子梗排列緊密,自盤狀子座基部產(chǎn)生。分生孢子盤黑色。分生孢子梗極短,緊密排列于子座上。分生孢子無色單胞,中部縫縮,內(nèi)含1~2個油球。3殼囊孢屬(Cytospora)

取梨樹腐爛病病樹皮,徒手切片觀察。子座暗褐色,多腔室,似迷宮狀。分生孢子器著生于瘤狀子座組織內(nèi)。分生孢子香蕉形,與膠體物質(zhì)混合,吸水膨脹后連同孢子自孔口擠出，成為分生孢子角。4.殼針孢屬(Septoria)

取芹菜斑枯病病葉,做徒手切片觀察。分生孢子器球形。分生孢無色,針狀,多胞。提示：分生孢子的橫隔須經(jīng)染色后才能觀察清楚；切片操作的最后一步即將切片放到載物臺上時再加水浮載樣晶,這樣立即觀察可看到分生孢子自孔口向外噴射的現(xiàn)象。5.殼二孢屬(Ascochyta)

取高粱粗斑病標(biāo)本制作切片觀察。分生孢子器黑色,分生孢子器扁球形。分生孢子圓筒形,雙胞無色。6.莖點(diǎn)霉屬(Phoma)

取甜菜蛇眼病標(biāo)本,切片觀察。分生孢子器著生于寄主表皮下,呈輪紋狀排列,球形,分生孢子無色,單胞,卵圓形。7.葉點(diǎn)霉屬(Phyllosticta)

多寄生于葉上。取蘋果灰斑病葉,制作徒手切片觀察,分生孢子器球形,有孔口。分生孢子極小(小于15μm),卵圓形。提示：葉點(diǎn)霉屬的形態(tài)與莖點(diǎn)霉屬很難區(qū)分,應(yīng)結(jié)合發(fā)病部位。五、實(shí)驗作業(yè)1.繪梨孢屬、尾孢屬和鐮孢霉屬的分生孢子梗和分生孢子形態(tài)圖。2.繪炭疽菌屬、盤二孢屬的分生孢子盤和分生孢子形態(tài)圖。3.繪莖點(diǎn)霉屬、殼二孢屬和殼囊孢屬分生孢子器和分生孢子形態(tài)圖。實(shí)驗八

植物病原原核生物病害的癥狀觀察及病害診斷植物病原原核生物是僅次于真菌和病毒的第三大類病原生物。植物病原原核生物病害的發(fā)生和分布非常普遍,幾乎每種作物上都有一種或幾種原核生物病害。有些原核生物病害為害嚴(yán)重,如茄科植物青枯病、大白菜軟腐病、果樹根癌病和水稻白葉枯病等。有些原核生物病害在國內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn),被列為對外檢疫對象,禁止傳入,如梨火疫病、玉米細(xì)菌性枯萎病、椰子致死黃化病和菜豆細(xì)菌性萎蔫病等。有些原核生物病害在國內(nèi)區(qū)域性發(fā)生,是對內(nèi)檢疫對象,如柑橘黃龍病和水稻細(xì)菌性條斑病等。植物病原原核生物引起的病害癥狀類型很多,有變色、壞死、腐爛、萎蔫和畸形等。一種病害可以有幾種癥狀相繼出現(xiàn)或同時出現(xiàn),同一癥狀又可以由多種原核生物引起。原核生物病害的癥狀表現(xiàn)復(fù)雜,類型多樣,同時也各具特點(diǎn)。診斷者要善于掌握病害的典型癥狀,抓住同一寄主上各病害的區(qū)別,結(jié)合鏡檢,做出癥狀診斷。一、目的要求通過對各種病害標(biāo)本及病害照片的觀察,熟悉植物原核生物病害的主要癥狀特點(diǎn),掌握常規(guī)診斷技術(shù)。二、材料、試劑與儀器1.植物病原原核生物病害標(biāo)本及消耗性病害材料(1)

水稻白葉枯病(Xanthomonasoryzae

pv.

oryzae)。(2)

水稻細(xì)菌性條斑病(X.oryzae

pv.oryzicola)。(3)

柑橘潰瘍病(X.competrstris

pv.

citri)。(4)

甘藍(lán)黑腐病(X.competrstris

pv.

campestris)。(5)

桃細(xì)菌性穿孔病(X.competrstris

pv.

pruni)。(6)

黃瓜細(xì)菌性角斑病(Pseudomonas

syringae

pv.lachrymans)。(7)

桑疫病(P.syringae

pv.

mori)。(8)

白菜軟腐病(Erwinia

subsp.

carotovora)。(9)

番茄青枯病(Burkholderia

solanacearum)。(10)

馬鈴薯環(huán)腐病(Clavibactermichiganensis

subsp.

sepedonicum)(11)

果樹根癌病(Agrobacterium

tumefanciens).(12)

蘋果發(fā)根病(A.rhizogenes)。(13)

馬鈴薯瘡痂病(Streptomyces

scalbies)。(14)

柑橘黃龍病(Candidatus

liberobacter

asiaticum)。(15)

棗瘋病(Jujubewitchesbroomdisease)。(16)

泡桐叢枝病(Paulowniawitches

broomdisease)。2.儀器與用品顯微鏡、放大鏡、載玻片、蓋玻片、浮載劑(蒸餾水或乳酚油)、紗布、刀片、剪刀、挑針等。三、實(shí)驗操作

(一)植物原核生物病害癥狀觀察1.壞死

觀察水稻白葉枯病、水稻細(xì)菌性條斑病、柑桶潰瘍病、甘藍(lán)黑腐病、桃細(xì)菌性穿孔病、黃瓜角斑病、桑疫病、馬鈴薯瘡痂病的病狀與病征。病原細(xì)菌通過侵害薄壁細(xì)胞組織,引起細(xì)胞和組織的局部死亡,形成局部病斑。病斑形狀、顏色、大小各異,有圓斑、條斑、角斑等。有的病斑在后期會自動脫落形成穿孔，有的病斑發(fā)展成潰瘍斑,有的病斑木栓化形成瘡痂。細(xì)菌病害的病斑在初期呈水漬狀半透明,有的病斑上還有淡黃色或灰白色的菌膿，干燥后形成魚籽狀黏附在病斑上。2.腐爛

幼嫩、柔軟多汁的組織被細(xì)菌為害后,細(xì)胞間果膠質(zhì)分解,細(xì)胞離析,組織解體造成寄主器官呈軟腐狀,并常伴有惡臭氣味。觀察大白菜軟腐病、水稻莖腐病的癥狀,注意腐爛部位、顏色變化,辨識特殊臭味。挑取少量新鮮腐爛組織制成玻片,鏡檢,可見寄主植物細(xì)胞單個游離的情況。3.萎蔫

細(xì)菌侵染寄主植物維管束組織,破壞導(dǎo)管的供水能力,引起植物枝葉萎垂,初期為暫時性萎蔫,幾天后變?yōu)橛谰眯晕?。番茄青枯病菌從根部傷口侵?然后在維管束組織中蔓延形成萎蔫。馬鈴薯環(huán)腐病菌侵染塊莖維管束組織而引起薯塊環(huán)狀腐爛。萎蔫癥狀一般在生長后期表現(xiàn)特別明顯。注意觀察縱剖莖稈和橫切薯塊的維管束變色情況。4.畸形

原核生物侵染寄主植物薄壁細(xì)胞,引起寄主細(xì)胞過度分裂和細(xì)胞體積增大,促使局部組織過度發(fā)育形成腫瘤。觀察葡萄根癌病,根頸處形成似愈傷組織的瘤狀物,褐色,表面粗糙,內(nèi)部組織常木質(zhì)化,較堅硬;觀察蘋果發(fā)根病，根部或嫁接處產(chǎn)生大量的畸形細(xì)根；觀察泡桐叢枝病、甘薯叢枝病,腋芽大量萌發(fā),側(cè)枝叢生；觀察棗瘋病,芽大量萌發(fā)呈叢枝狀,花器退化,尊片、花瓣變成葉片狀。5.變色

原核生物侵染植物可引起典型的變色癥狀。觀察柑橘黃龍病,葉片褪綠,黃化、黃綠相間呈斑駁或花葉、葉脈變黃成黃色網(wǎng)絡(luò)狀；觀察棗瘋病,該病除表現(xiàn)畸形外,葉片黃化。(二)原核生物所致植物病害的診斷1.癥狀診斷

常見的植物病原原核生物不同的屬引起的病害癥狀有所不同：土壤桿菌屬(Agrobacterium)主要引起腫瘤、發(fā)根等畸形癥狀；假單胞桿菌屬(Pseudomonas)、黃單胞桿菌屬(Xanthomonas)主要引起葉斑、葉枯等壞死癥狀；軟腐癥狀則主要是由歐文氏菌屬(Erwinia)為害造成的。而萎蔫癥狀可由幾個屬的病原引起,如布克氏菌屬(Burkholderia)、棒形桿菌屬(Clavibacter)、歐文氏菌屬、黃單胞桿菌屬等；植原體屬(Phytoplasma)主要引起植株黃化、叢枝、叢根、花變?nèi)~等。細(xì)菌病害的病征簡單,在病斑上可見到污白色、黃白色或黃色的菌膿。一些菌膿干燥后呈魚籽狀菌膠珠。腐爛型的細(xì)菌病害產(chǎn)生特殊臭味,且無菌絲,可與真菌引起的腐爛區(qū)別。萎焉型的細(xì)菌病害,橫切病株莖基部,稍加擠壓可見污白色菌膿溢出,并且維管束變褐。也可將一段病葉或病稈插在濕砂中,經(jīng)保溫保濕后,在上方切口處可見混濁的菌膿溢出。有無菌膿溢出是細(xì)菌性萎蔫同真菌性萎蔫的最大區(qū)別。2.噴菌現(xiàn)象

觀察許多細(xì)菌性葉斑病的病斑上無菌膿、菌膠珠,診斷上比較可靠的方法是在顯微鏡下檢查病組織中是否有大量細(xì)菌存在。剪取一小塊新鮮的病健交界處組織,平放在載玻片上,加蒸餾水一滴，蓋上蓋玻片后,立即在低倍顯微鏡下觀察。如果是細(xì)菌病害,則在切口處可看到大量細(xì)菌涌出,呈云霧狀,積聚于切口處。在田間,用放大鏡或肉眼對光觀察玻片標(biāo)本,也能看到云霧狀細(xì)菌溢出。提示：所取病組織在4mm2較合適,盡量避開葉片主脈,蓋上蓋玻片后如果蒸餾水未將材料完全浸泡,可從蓋玻片邊緣再加一小滴蒸餾水。在顯微鏡下觀察時,光線要弱,如果光線太強(qiáng),即便有大量細(xì)菌涌出,也看不見。材料必須是新鮮病斑,否則,寄主組織中滋生的腐生細(xì)菌會導(dǎo)致誤診。3病組織切片觀察

取一塊病組織作徒手切片,將切片放入載玻片上的一滴蒸餾水中,蓋上蓋玻片鏡檢。如果是侵染維管束組織的細(xì)菌病害,可見大量細(xì)菌堵塞導(dǎo)管(如水稻白葉枯病)；如果是侵染薄壁細(xì)胞織，可看到薄壁細(xì)胞間或細(xì)胞內(nèi)大量細(xì)菌的存在(如柑橘潰瘍病)。

但是細(xì)菌引起的根癌病、發(fā)根病,由于在薄壁細(xì)胞組織中的細(xì)菌量極少,不易檢查。五、實(shí)驗作業(yè)1.記錄植物原核生物病害標(biāo)本的主要癥狀特點(diǎn)。2.診斷2~3種病害標(biāo)本,初步判斷是否是細(xì)菌病害,六、實(shí)驗學(xué)時：1學(xué)時。實(shí)驗九

植物病原細(xì)菌形態(tài)觀察一、目的要求學(xué)習(xí)并初步掌握革蘭氏染色法和鞭毛染色法；了解革蘭氏染色和鞭毛染色的原理及其在細(xì)菌分類鑒定中的重要性。二、基本原理1

革蘭氏染色

革蘭氏染色是丹麥病理學(xué)家ChristainGram在1884年創(chuàng)立的,是細(xì)菌學(xué)中最重要的鑒別染色法。革蘭氏染色法將細(xì)菌分為革蘭氏陽性菌(G+菌)和革蘭氏陰性菌(G-菌),這是由這兩類細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同決定的。實(shí)際上,當(dāng)用結(jié)晶紫初染后,所有細(xì)菌都被染成藍(lán)紫色。再用碘液媒染,它能與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫－腆的復(fù)合物,增強(qiáng)了染料與細(xì)菌的結(jié)合力。當(dāng)用脫色劑(乙醇或丙酮)處理時,兩類細(xì)菌的脫色效果是不同的。革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成,壁厚、類脂含量低,用乙醇或丙酮脫色時,細(xì)胞壁脫水,使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小、透性降低,從而使結(jié)晶紫一腆的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi),經(jīng)脫色和復(fù)染后仍保留藍(lán)紫色。革蘭氏陰性菌則不同,由于其細(xì)胞壁肽聚糖層較薄、類脂含量高,所以經(jīng)脫色處理后,類脂被乙醇或丙酮溶解,細(xì)胞壁透性增大,使結(jié)晶紫一腆的復(fù)合物比較容易被洗脫出來,用紅色復(fù)染劑復(fù)染后,細(xì)胞被染成紅色。2.鞭毛染色

鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動“器官”,細(xì)菌是否具有鞭毛,以及鞭毛著生的位置和數(shù)目是細(xì)菌的一項重要鑒別特征。細(xì)菌的鞭毛纖細(xì),直徑通常為0.02~0.03μm,不能用光學(xué)顯微鏡直接觀察到。要用普通光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌的鞭毛,必須用鞭毛染色法。鞭毛染色是先用媒染劑處理,使它沉積在鞭毛上,使鞭毛直徑加粗,然后再進(jìn)行染色。三、材料、試劑與儀器（一）試驗用菌種(1)甘藍(lán)黑腐病菌（X.competrstris

pv.

campestris）。(2)茄青枯病菌(Burkholderia

solanacearum)。(3)白菜軟腐病菌(Erwinia

subsp.

carotovora)。(4)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。菌種必須在使用前5d移植,臨用前18~36h再轉(zhuǎn)管一次,以保證菌體處于分裂活躍時期。(二)革蘭氏染液1.結(jié)晶紫草酸銨染劑溶液I結(jié)晶紫2.0g

95%酒精20.0ml。溶液Ⅱ草酸銨0.8g

蒸餾水80.0ml?；旌先芤篒和Ⅱ,濾紙過濾,貯存于試劑瓶中,24h后使用。2.魯戈爾碘液碘1.0g

碘化鉀2.0g

蒸餾水300.0ml。將碘和碘化鉀放入同一研缽中研磨,研磨時緩慢加水直至碘和碘化鉀溶解,然后加水稀釋到300m1,裝入棕色試劑瓶,放暗處備用。3.復(fù)染劑

先配制原液,用蒸餾水稀釋后為復(fù)染劑。原液

番紅O(藏紅)2.5g

95%酒精100.0ml。復(fù)染劑

原液10.0ml

蒸餾水90.0ml。提示：配制好的染液不可超過一年,特別是魯戈爾碘液要裝在棕色試劑瓶中,置于暗處保存,否則會褪色無效。(三)鞭毛染色液西薩一基爾(Ceseres-Gill)法染液(1)媒染劑：單寧酸10.0g

AlCl3·6H2018.Og

ZnC1210.0g

堿性品紅1.5g

60%酒精40.0ml。在研缽中盛10ml酒精,加入以上各藥品,充分研磨混合后,再加入剩下的酒精。使用前用蒸餾水稀釋2倍,染色時經(jīng)濾紙過濾,濾液直接滴在涂片上。(2)苯酚品紅染液：溶液I

堿性品紅0.3g

95%酒精10.0ml。溶液Ⅱ

苯酚(結(jié)晶)5.0g

蒸餾水95.0ml。混合溶液I和溶液Ⅱ,裝入試劑瓶備用。(四)載玻片的準(zhǔn)備及其他用具和試劑最好選用新的載玻片,首先將新載玻片用清水沖洗,去掉載玻片上的灰塵雜質(zhì)。然后將載玻片一張一張地放入濃鉻酸洗液中浸泡4~5d,撈出后清水沖洗。再放人洗滌液溶液中,煮沸1h,在自來水下用脫脂棉擦洗玻片至完全沖掉洗滌液,再用蒸餾水洗凈后,浸泡在95%酒精中備用。也可在新的脫脂紗布上晾干,保存在密閉的容器中備用。酒精燈、火柴、吸水紙、洗瓶、香柏油、小玻璃漏斗、鐵架、移菌環(huán)、牙簽、無菌試管、試管架、3%KOH溶液。四、實(shí)驗操作

(一)革蘭氏染色(1)用無菌蒸餾水將培養(yǎng)18～24h的菌種配制菌懸液。(2)在潔凈無脂的載玻片上,用移菌環(huán)取菌液涂片,在同一張載玻片的一端(2/3處)分別涂上枯草芽抱桿菌(G+菌對照)、甘藍(lán)黑腐病菌(G-菌對照)和茄青枯病菌(待測菌),晾干后在酒精燈火焰上通過兩次,固定涂片,并寫上標(biāo)記。(3)滴加結(jié)晶紫草酸鍍(覆蓋三條菌膜)，染色1min。(4)水洗數(shù)秒鐘,甩去載玻片上的水,用吸水紙吸干(或用魯戈爾碘液沖余下的水)。(5)滴加魯戈爾碘液,染色1min。(6)水洗數(shù)秒鐘,甩去載玻片上的水，用吸水紙吸干。(7)將載玻片傾斜,在白色背景下,從上端滴下酒精,使其順著整個載玻片均勻地向下流,直至流下的酒精無色。褪色時間不超過30s。(8)水洗數(shù)秒鐘,甩去載玻片上的水,用吸水紙吸干。(9)滴加番紅O復(fù)染10s。(10)水洗,吸干,鏡檢。革蘭氏陽性菌呈紫色或藍(lán)黑色,革蘭氏陰性菌呈紅色。提示：注意使用活躍生長期的培養(yǎng)物,菌齡18~24h。菌懸液不能太濃,涂片不宜過厚,以免脫色不完全造成假陽性。火焰固定涂片,以載玻片不燙手為宜；酒精脫色是革蘭氏染色的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。脫色不足,陰性菌被誤染成陽性菌；脫色過度,陽性菌可誤染為陰性菌。脫色時間一般20~30s,不超過30s；為避免實(shí)驗錯誤,用已知革蘭氏陽性菌和陰性菌作對照,與待測菌同涂在一張載玻片上。當(dāng)對照菌呈現(xiàn)正確的顏色,實(shí)驗成功；否則,失敗。此外,還有氫氧化鉀溶解試驗,其結(jié)果與革蘭氏染色反應(yīng)一致,可作為參考方法。原理是KOH溶液可破壞革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁,從而釋放出原生質(zhì)等黏性物質(zhì),使菌懸液變得黏稠;而革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁則不被KOH所破壞,加入KOH后菌懸液不變黏稠。實(shí)驗操作時,將3%KOH溶液一小滴點(diǎn)在干凈載玻片上,用移菌環(huán)取一環(huán)待測細(xì)菌菌液放入KOH液滴中,用牙簽攪動片刻,再將菌液向上提起,觀察提起的時候有無黏絲。如果有,是陰性菌;如果無則是陽性菌。(二)鞭毛染色西薩一基爾(Ceseres-Gill)染色法：(1)用無菌蒸餾水將培養(yǎng)18~24h的菌種配制菌懸液(如果室溫過低,可將已加入無菌水的菌種試管放入26℃溫箱中靜置20~30min)。(2)用移菌環(huán)取菌液3~6環(huán),分別點(diǎn)在潔凈無脂的載玻片上。傾斜載玻井,自然風(fēng)干(一張玻片上可同時鑒定兩個菌)。(3)媒染劑經(jīng)濾紙過濾直接滴在載片上,處理5~7min。(4)用水洗去媒染劑,甩去載玻片上的余水,自然風(fēng)干。(5)滴加苯酚品紅染劑染5min。(6)水洗去染液,自然干燥后油鏡下鏡檢,菌體和鞭毛呈紅色。五、實(shí)驗作業(yè)與思考題1.記載染色結(jié)果,并繪簡圖。2.討論染色成功與失敗的體會。六、實(shí)驗學(xué)時：2時。實(shí)驗十、植物病毒的接種與傳染植物病毒不能主動侵入寄主,但病毒病仍然十分普遍,這是與病毒侵染的機(jī)制和傳播的有效性密切相關(guān)的。實(shí)驗室中常用病株汁液作為人工接種的材料,可有效地將大多數(shù)病毒接種到試驗材料上。但有些病毒則不能用汁液接種,必須用介體來傳染,例如昆蟲介體等,它們以不同的方式來傳播病毒。不同的病毒有不同的傳播方式,因此這也是病毒鑒定時的重要性狀之一。一、目的要求

通過人工摩擦接種,學(xué)習(xí)常規(guī)的汁液接種法和關(guān)鍵技術(shù)；通過對一套鑒別寄主的接種,了解鑒別寄主的鑒別作用、篩選作用和定量作用。通過蚜蟲或葉蟬的傳毒實(shí)驗，學(xué)習(xí)利用介體傳播病毒的技術(shù),從而加深對介體作用的認(rèn)識。有些病毒材料在研磨過程中易被氧化而鈍化,因此還要加入少量的緩沖液,常用的是0.01M的磷酸鹽緩沖液〈PBS,pH7.2〉,有時還加有Na2SO3或巰基乙醇（0.1%）(Mercaptoethanol)、抗壞血酸等還原劑以保護(hù)病毒。二、材料和用具

植物病毒標(biāo)樣1號、2號、3號；4～5葉期的心葉煙、普通煙、莧色黎、千日紅、蠶豆和菜豆苗等,幼苗生長健壯,無病蟲害。肥皂或肥皂水、消毒的研缽與研棒、洗瓶、金剛砂或硅藻土（600目）、0.05MpH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)、塑料標(biāo)簽、鉛筆、小毛筆、養(yǎng)蟲籠、養(yǎng)蟲罩,擬除蟲菊品、噴霧器、指形管、塑料封口膜、洗瓶。蚜蟲〈必須是不帶任何病毒的健康的無翅蚜,盡量不用有翅蚜〉：桃赤蚜〈Myzuspersicae〉、豆蚜〈A.crassivora〉和甘藍(lán)蚜(Brevicorgnebrassicae)等。三、內(nèi)容與方法（一）人工摩擦接種1因為每個人的手指甲和手指上都可能污染有多種病毒，因此在做實(shí)驗之前都應(yīng)先用肥皂水洗手,將病毒鈍化和洗除干凈,以防污染。2供試植物也面如有污物，應(yīng)先用自來水沖洗干凈,晾于后均勻地撒上摩擦。3剪取小塊病毒病樣本的葉片放在研缽中,加入少量磷酸鹽緩沖液,研碎成糊狀。4用食指或研棒蘸取少量病葉汁液,在供接種的植物葉面輕抹2～3次,注意摩擦要輕,不要來回擦,應(yīng)單向地從葉基向葉尖方向抹,接種葉用手掌或手指托住,不要用力過大,更不能弄破葉片。5接種后即可用洗瓶將葉面的病汁液和摩擦劑沖洗干凈。注意：一定要將摩擦劑沖洗掉,否則將影響日后的癥狀觀察。6

用鉛筆在接種過的葉片尖端刺一小孔作為接種葉的記號。7

各組要用一盆植物做空白對照，即用緩沖液代替病葉汁液做接種。8

用鉛筆寫好標(biāo)簽后插入花盆中，標(biāo)簽要注明：病毒標(biāo)樣代號，寄主符號，接種日期和接種者。例如T1，心葉煙，日/月，張/劉。9

接種過的植物要放在有光的溫室中培養(yǎng)，每2～3天觀察記載一次發(fā)病情況，尤其要注意接種葉和新葉上的癥狀是否相同？10

為了提高接種的成功率，通常將待接種的植物幼苗放在黑暗處8～10小時后再接種。11

癥狀記載的常用符號：枯斑：ll；壞死：N；褪綠：Ch；斑駁：Mo；花葉：M；環(huán)斑：RS；脈明：Vc；蕨葉：F。如：接種葉枯斑，新葉無癥狀可記載為ll/－。（二）

蚜蟲飼毒接種

能傳播病毒的媒介物很多，以刺吸式口器的昆蟲為主，其次是真菌等。1

從隔離的養(yǎng)蟲籠中收集無翅蚜，用振落法使蚜蟲跌落到大培養(yǎng)皿或白瓷盤中，用毛筆沾取蚜蟲收集在指形管或三角瓶中,紗布封口,在叫右溫箱叫4～6小時。2將病毒病葉摘下放在大培養(yǎng)皿中。3取出饑餓的揚(yáng)蟲,抖落在病葉上,蜘蟲稍經(jīng)爬行后立即停住取食〈頭朝下,尾部朝上〉,也可將螃蟲直接挑放在病株上飼毒。4經(jīng)取食5～10分鐘或特定的時間后,用毛筆輕觸蚜蟲的尾部,使蚜蟲拔出口針,然后用毛筆將蚜蟲挑起,移放到待接種植株的心葉片上，并用養(yǎng)蟲罩罩??；也可將蚜蟲挑放在特制的接蟲紗罩中,然后將紗罩夾在供接種植株上部嫩葉的背面。植株放在溫室中培養(yǎng)。524小時后噴撒殺蟲劑殺死蚜蟲,移去養(yǎng)蟲罩或接蟲紗罩。6植物放在溫室中培養(yǎng)。、7定期觀察記載接種和新葉上的癥狀。四、實(shí)驗作業(yè)與思考題1列表記載接種毒源在各鑒別寄主上的癥狀及發(fā)病過程,查閱有關(guān)資料,分析核對你接種樣本可能是哪一種病毒?2為何一定要先洗手,后接種?3如何測定病毒/螃蟲是持久性傳播還是非持久性傳播〈提出試驗方案來〉?4為何要用緩沖液?為何要有作空白對照的植株?5有些病態(tài)人工接種不發(fā)病，可能有哪些原因?六、實(shí)驗學(xué)時：2學(xué)時。實(shí)驗十一

植物病毒粒體的生物學(xué)測定一、目的要求掌握測定TMV病汁液物理穩(wěn)定性狀的方法。二、基本原理不同的病毒對外界條件的穩(wěn)定性不同。對汁液傳染的病毒,可通過病株汁液的體外性狀(鈍化溫度、稀釋限點(diǎn)和體外存活期)來測定。這些性狀雖易受各種因素影響,但仍可作為區(qū)別不同病毒的依據(jù)之一,而且對病毒混合侵染的分離及制定病毒提純方案具有參考價值。三、材料、試劑與儀器1.材料

TMV病株(煙草)、健康心葉煙植株。2.儀器與用品

消毒研缽、紗布、薄壁小試管(口徑相同)、燒杯、水浴鍋、溫度計、醫(yī)用藥棉、1ml及10ml吸管和試管等。四、實(shí)驗操作(一)

鈍化溫度測定(1)

取TMV病葉在研缽中磨碎,雙層紗布過濾壓汁，用1ml吸管將病汁分別裝入5個薄壁小試管中,分別標(biāo)記溫度。(2)

將恒溫水浴鍋調(diào)至95℃,90℃,80℃,70℃,60℃五種溫度。(3)

從高溫至低溫,依順序每個溫度放入一盛有TMV汁液的薄壁小試管,處理10min,取出立即置冷水中冷卻。(4)

按常規(guī)方法汁液摩擦接種各處理病汁液于心葉煙上。每處理接種1株心葉煙3張平展葉,掛牌標(biāo)記。(5)

第3～5d觀察接種葉的枯斑出現(xiàn)情況,記錄結(jié)果,失去產(chǎn)生枯斑能力的某一處理溫度即為該病毒的鈍化溫度。(二)釋限點(diǎn)的測定(1)

取6個試管,分別標(biāo)記稀釋度10－1,10－2,10－3,10－4,10－5,10－6。(2)

用10ml吸管吸取蒸館水,每試管9ml。(3)

吸取1mlTMV汁液,放入10-1的試管中,往返吸吐3次,得1:10稀釋液。(4)

從10－1試管中吸取1ml,移入第二試管中,得10-2稀釋液。同法依次得六種不同稀釋度的病汁液。(5)

從稀至濃,將六種不同濃稀釋度病汁液分別用常規(guī)摩擦接種法接種于心葉煙上。(6)

第3～5d觀察枯斑的出現(xiàn)，記錄結(jié)果。失去侵染力的一個稀釋度即為該病毒的稀釋限點(diǎn)。(三)體外存活期的測定將TMV病汁液20ml裝入試管中,放在室溫(20~25℃)或溫箱(20℃)'中。間隔1,2,4,6,8,16,32,64d……,分別取出少許病汁,在心葉煙上進(jìn)行常規(guī)摩擦接種,每次接種后第二天記錄發(fā)病情況,連續(xù)兩次不再出現(xiàn)枯斑,停止接種。最后一次失去侵染力的間隔日期即為該病毒的體外存活期。五、實(shí)驗作業(yè)與思考題1.記錄實(shí)驗操作過程,分析試驗結(jié)果,寫出試驗報告。2.病汁液物理性質(zhì)測定有何意義？3.不能經(jīng)汁液摩擦傳染的病毒如何測定其物理性質(zhì)？六、實(shí)驗學(xué)時：1學(xué)時。實(shí)驗十二

植物病原線蟲的分離一、目的要求了解從土壤和植物組織中分離線蟲的基本原理，掌握從土壤和植物組織中分離線蟲的方法。學(xué)習(xí)在解剖鏡或擴(kuò)大鏡下用鑷子、竹針、毛針、毛筆等工具從水中和濾紙上挑取線蟲的方法。二、基本原理植物寄生線蟲主要存在于土壤和植物組織中,分離線蟲的方法有許多,要根據(jù)線蟲的種類、研究目的等來選擇適宜的方法。植物寄生線蟲的個體很小,除極少數(shù)可從植物組織中直接挑出以外,絕大多數(shù)需借助特定的工具和方法才能完成。線蟲的分離主要是利用它的趨水性、大小、比重以及與其他雜質(zhì)的差異,采用過篩、離心、漂浮等措施,將線蟲從植物組織、土壤中分離出來。三、材料、試劑與儀器1.實(shí)驗材料

感染根結(jié)線蟲病的植物病根、病土、感染大豆孢囊線蟲或其他孢囊線蟲的病士、感染甘薯莖線蟲的病薯塊等。2.儀器或?qū)嶒炗镁?/p>

解剖鏡、漏斗分離裝置、漂浮分離裝置、淺盤分離裝置、紗布或銅紗、記數(shù)皿或平皿、小燒杯