動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定

動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第1頁(yè)1、掌握動(dòng)物組織總DNA提取方法及其原理。2、掌握瓊脂糖凝膠電泳分離核酸原理和方法。3、學(xué)習(xí)核酸染色方法。一、試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)：動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第2頁(yè)二、試驗(yàn)原理:要取得純DNA樣品，必須考慮以下幾點(diǎn)：怎樣選材，怎樣破碎組織細(xì)胞？怎樣除去蛋白質(zhì)？(在真核細(xì)胞內(nèi)，DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白形式存在。所以，分離DNA時(shí)必須使其與蛋白質(zhì)解離，并除去蛋白質(zhì)。)設(shè)法除去RNA污染；預(yù)防DNA酶降解作用；（一）動(dòng)物肝臟DNA制備原理動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第3頁(yè)選材要提取動(dòng)物組織DNA，普通選擇細(xì)胞膜較脆弱，輕易破碎動(dòng)物臟器，如胸腺、肝臟、脾臟、胰臟等。動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第4頁(yè)研磨：將剪碎動(dòng)物組織置于研缽或勻漿器中，加入少許石英砂研磨或勻漿，破碎細(xì)胞。這種方法溫和，適合試驗(yàn)室使用。組織搗碎器：較猛烈破碎細(xì)胞方法，為了預(yù)防發(fā)燒和升溫過(guò)高，通常是轉(zhuǎn)10秒—20秒，停10秒—20秒，可重復(fù)屢次。壓榨法：在1000×105Pa—×105Pa高壓下使幾十毫升細(xì)胞懸液經(jīng)過(guò)一個(gè)小孔突然釋放至常壓，細(xì)胞將徹底破碎。溫和、徹底破碎細(xì)胞方法，但儀器費(fèi)用較高。細(xì)胞破碎方法—機(jī)械物理法：動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第5頁(yè)重復(fù)凍融法：將待破碎細(xì)胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室溫(或40℃)快速融化，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩下胞液鹽濃度增高而引發(fā)細(xì)胞溶脹破碎。超聲波處理法：借助超聲波振動(dòng)力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器。使用時(shí)注意降溫，預(yù)防過(guò)熱。冷熱交替法：在90℃左右維持?jǐn)?shù)分鐘，馬上放入冰浴中使之冷卻，如此重復(fù)屢次，絕大個(gè)別細(xì)胞能夠被破碎。細(xì)胞破碎方法—機(jī)械物理法動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第6頁(yè)有機(jī)溶劑處理法：利用氯仿、甲苯等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細(xì)胞，可將細(xì)胞膜溶解，從而使細(xì)胞破裂，此法也能夠與研磨法聯(lián)合使用。溶脹法：細(xì)胞膜為天然半透膜，在低滲溶液和低濃度稀鹽溶液中，因?yàn)榇嬖跐B透壓差，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，將細(xì)胞膜脹破釋放出細(xì)胞內(nèi)含物。細(xì)胞破碎方法—化學(xué)方法動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第7頁(yè)(三)除去RNA方法

脫氧核糖核蛋白在濃NaCl（1-2mol／L）溶液中溶解度很大，但在0.14mol／LNaCl溶液中溶解度很低，而核糖核蛋白則溶于0.14mol／LNaCl溶液中，利用這一性質(zhì)可將脫氧核糖核蛋白與絕大個(gè)別核糖核蛋白分離開(kāi)來(lái)。動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第8頁(yè)(四)除去蛋白質(zhì)方法

用氯仿一異成醇混合液振蕩核蛋白溶液，使蛋白質(zhì)變性，然后離心除去變性蛋白質(zhì)，此時(shí)蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間，而DNA溶于上層水相。用兩倍體積95％乙醇溶液可將DNA鈉鹽沉淀出來(lái)。用十二烷基硫酸鈉（SDS）等去污劑使蛋白質(zhì)變性，能夠直接從生物材料中提取DNA。動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第9頁(yè)純DNA樣品取得為了預(yù)防DNA酶降解，提取時(shí)可加入適量EDTA（乙二胺四乙酸）、檸檬酸，以降低DNA酶活性。加入RNA酶降解剩下RNA，取得純DNA。保留：將DNA于濾紙上干燥，溶于1mlTE中低溫保留。動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第10頁(yè)

（二）瓊脂糖凝膠電泳分離核酸原理：瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖凝膠作為支持介質(zhì)一個(gè)電泳分離方法，是一個(gè)簡(jiǎn)便、快速分離判定核酸方法，已成為分子生物學(xué)及基因工程研究中常見(jiàn)試驗(yàn)方法之一。瓊脂糖英文名agarose，是從瓊脂中提取出來(lái)，由半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖相互結(jié)合鏈狀多糖。瓊脂糖和瓊脂都可在不一樣濃度水溶液下可形成多孔凝膠，電泳中含有分子篩效應(yīng)。但瓊脂糖含硫酸根比瓊脂少，電滲作用降低，因而分離效果顯著提升。動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第11頁(yè)DNA分子在pH高于其等電點(diǎn)溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)（電荷效應(yīng)）。DNA分子泳動(dòng)速率大小除與DNA分子帶電量相關(guān)外，還與DNA分子大小和空間構(gòu)象相關(guān)（瓊脂糖凝膠分子篩效應(yīng)）。電泳時(shí)，用溴酚藍(lán)做前沿指示劑，用溴化乙啶（ethidiumbromide，EB）指示DNA樣品在凝膠中確實(shí)切位置。溴化乙啶是一個(gè)熒光染料，可插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)兩個(gè)堿基對(duì)之間，與DNA分子形成絡(luò)合物，在紫外光激發(fā)下發(fā)出橙黃色熒光。動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第12頁(yè)熒光來(lái)自兩方面，一是核酸吸收260nm紫外光，并將能量傳給EB；二是EB本身吸收波長(zhǎng)為302nm和360nm紫外光。這兩方面能量最終激發(fā)EB發(fā)出波長(zhǎng)為590nm紅橙色熒光。溴化乙啶可加入凝膠中，也能夠在電泳后，將凝膠放在含EB溶液中浸泡.溴化乙啶檢測(cè)DNA靈敏度很高，可檢出10ng甚至更少DNA。動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第13頁(yè)瓊脂糖凝膠電泳分離核酸影響原因（1）核酸大小與瓊脂糖凝膠電泳分離關(guān)系

凝膠中，DNA片段遷移率與DNA分子大小(堿基正確對(duì)數(shù))成反比(≤20kb)，所以經(jīng)過(guò)已知大小標(biāo)準(zhǔn)物移動(dòng)距離與未知片段移動(dòng)距離時(shí)行比較，便可測(cè)出未知片段大小。（2）核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離關(guān)系

不一樣構(gòu)型DNA移動(dòng)速度次序?yàn)椋洪]環(huán)DNA>直線DNA>開(kāi)環(huán)雙鏈環(huán)狀DNA.（3）不一樣大小DNA需要用不一樣濃度瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。

瓊脂糖濃度/%

0.3

0.6

0.7

0.9

1.2

1.5

2.0

線狀DNA大小/kb

60-5

20-1

10-0.8

7-0.5

6-0.4

3-0.2

2-0.1

注：DNA片段在5-500bp之間時(shí)，普通用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）進(jìn)行電泳分離。動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第14頁(yè)瓊脂糖凝膠電泳含有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）操作簡(jiǎn)單、制備輕易快速、凝膠機(jī)械性能好、電泳速度快、分離DNA片段范圍廣、樣品不需事先處理就能夠進(jìn)行電泳。

（2）凝膠結(jié)構(gòu)均勻，對(duì)樣品吸附小，電泳圖譜清楚，分辨率高，重復(fù)性好。

（3）瓊脂糖透明無(wú)紫外吸收，電泳過(guò)程和結(jié)果可直接用紫外光檢測(cè)及定量測(cè)定。

（4）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測(cè)定。制成干膜可長(zhǎng)久保留。

所以，瓊脂糖凝膠電泳已成為分子生物學(xué)及基因工程研究中常見(jiàn)試驗(yàn)方法之一，DNA樣本分離、純化、判定以及相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定常見(jiàn)瓊脂糖凝膠電泳。動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第15頁(yè)

熒光染料EB染色后，在紫外燈(λ305nm)下觀察到電泳結(jié)果：動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第16頁(yè)

*熒光染料EB染色原理和優(yōu)點(diǎn)是什么？1、原理：

EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲錠溴鹽(EthidiumBromide)。

EB是一個(gè)扁平分子，它能夠嵌入核酸堿基之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅橙色熒光。激發(fā)熒光能量起源于兩個(gè)方面：一是核酸吸收260nm紫外線后將能量傳遞給EB，二是EB本身吸收302nm和360nm紫外線能量。這兩方面能量最終激發(fā)EB發(fā)射波長(zhǎng)為590nm可見(jiàn)光（紅橙區(qū)）。動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第17頁(yè)2、優(yōu)點(diǎn)：（1）染色比較簡(jiǎn)便、快捷，普通在10－15min就可反應(yīng)。（2）EB對(duì)核酸分子無(wú)破壞作用，這是其它染料所不能做到。（3）EB靈敏度高，可檢測(cè)出10ng或更少DNA含量。（4）既可用于DNA也可用于RNA檢測(cè)。（5）EB可加到樣品中，也可加到凝膠中，可隨時(shí)用紫外燈檢測(cè)電泳進(jìn)程和效果。（6）EB-DNA復(fù)合物中EB發(fā)出熒光比游離EB強(qiáng)10倍，所以不需洗凈凝膠中游離EB也可檢測(cè)出DNA條帶。動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第18頁(yè)3、缺點(diǎn)：

溴化乙啶是一個(gè)強(qiáng)致突變劑，在操作和配制試劑時(shí)應(yīng)戴手套。含溴化乙啶溶液不能直接倒入下水道，應(yīng)進(jìn)行處理。（1）每100ml溶液中加入100mg粉狀活性炭；（2）室溫下放置1小時(shí)，不時(shí)搖動(dòng)；（3）用新華一號(hào)濾紙過(guò)濾，棄濾液；（4）用塑料袋封裝濾紙和活性炭，作為有害廢物處理。*溴化乙啶在260℃分解，在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行焚化后不會(huì)有危險(xiǎn)性。動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第19頁(yè)(一)材料：動(dòng)物肝臟

(二)試劑：

（1）0.14mol／LNaCl－0.15mol／LEDTA-Na溶液：（2）20％SDS溶液：（3）氯仿一異戊醇(24:1)混合液：（4）95％乙醇溶液。（5）80％乙醇溶液。（6）pH8.0TE緩沖液：10mmol／LTris－HCI，lmmol／LEDTANa，其中含RNA酶20ug／mL。二、試驗(yàn)材料、試劑和儀器:

動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第20頁(yè)（7）電泳緩沖液：Tris-硼酸－EDTA（50×TBE）pH8.0。（8）加樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)（BPB）40%蔗糖。（9）溴化乙啶（EB）溶液：10μg/ml。（10）瓊脂糖凝膠：濃度為0.7%。(三)儀器（1）穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（2）可調(diào)微量移液器

（3）水平電泳槽（4）暗箱紫外透射儀等。動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第21頁(yè)移液器使用

自動(dòng)取液器結(jié)構(gòu)

自動(dòng)取液器使用

吸入液體

排出液體使用注意事項(xiàng)：不超量程使用；不倒置；使用完成調(diào)至最大刻度上。動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第22頁(yè)三、試驗(yàn)步驟：1．取新鮮動(dòng)物肝，稱取2g，切成小塊，加入4ml0.14mol／LNaCl－0.15mol／LEDTA溶液，于研缽中研磨至勻漿，再加4ml清洗轉(zhuǎn)入離心管中，以4000r／min轉(zhuǎn)速離心10min。動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第23頁(yè)2．在上述沉淀物中加入4mL0.14mol／LNaCl－0.15mol／LEDTA溶液，然后在60℃下，滴加20％SDS溶液3－5滴，邊加邊搖動(dòng)，再搖動(dòng)10min，使核酸與蛋白質(zhì)分離。3.加固體氯化鈉0.4g混勻，使其最終濃度到達(dá)l.4mol／L，水浴30min。動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第24頁(yè)

4．加等體積氯仿一異戊醇，混勻，搖動(dòng)5min，以4000r／min轉(zhuǎn)速離心10min。離心管內(nèi)物質(zhì)分為三層，上層為含DNA水相層，下層為氯仿一異成醇混合物，中間層為變性蛋白凝膠。動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第25頁(yè)5．吸出上清液，加入2倍體積95％乙醇溶液（預(yù)冷），產(chǎn)生沉淀。6.再以4000r／min轉(zhuǎn)速離心溶液10min，棄去上清液(沉淀用80％乙醇溶液離心洗滌)。7．將沉淀置于吸水紙上，除盡乙醇，室溫自然干燥后，加入200ul電極緩沖液，使DNA充分溶解，待用。動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第26頁(yè)8.凝膠板制備：（1）取瓊脂糖0.7g，加1×TBE緩沖溶液100ml，于沸水浴中至熔化，制成0.7%瓊脂糖膠液。（2）膠床兩頭貼上防水膠帶，形成8mm高擋墻，壓緊膠帶，置水平臺(tái)面上。（3）插入梳子，梳齒下端離板底0.5－1mm。（4）在膠床上滴加2－3滴0.5μg/mLEB溶液。（5）將60℃凝膠不間斷倒入膠床，高3－4mm，防止氣泡，搖勻，室溫下凝固。（6）完全凝固后，撕掉膠帶，置于電泳槽中，加入電泳緩沖液，高于膠面1－2mm，從一頭輕輕斜拉出梳子，除去產(chǎn)生氣泡。動(dòng)物肝臟dna提取和鑒定第27頁(yè)9.加樣：

將樣品DNA溶液與加樣緩沖液以5：1體積比混合，用微量移液器加樣，每加完一個(gè)樣品，沖洗三次。加樣量15～20

l（加樣時(shí)應(yīng)預(yù)防碰壞樣品孔周圍凝膠面以及穿透凝膠底部）。10.電泳：為了取得電泳分離DNA片段最大分辨率，電場(chǎng)強(qiáng)度不應(yīng)高于5V/cm（兩電極間距離）開(kāi)始時(shí)用較高電壓(80V)，樣品一進(jìn)入膠內(nèi)則將電壓調(diào)至5V/cm。當(dāng)染料前沿移至底邊1-2mm時(shí)，電泳畢。11.觀察