生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座

第七章

生物藥品提取純化技術(shù)

第一節(jié)

概

述

第二節(jié)

預(yù)處理及固液分離技術(shù)

第三節(jié)

沉

淀

第四節(jié)

萃取(Extraction)第五節(jié)

吸附(Sorption)第六節(jié)

親和層析第七節(jié)

新型層析分離純化裝置及介質(zhì)

生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第1頁(yè)生物藥品穩(wěn)定性受pH、溫度、離子強(qiáng)度、提取過程所使用溶劑和表面活性劑、金屬離子等方面影響，生物藥品對(duì)剪切力也很敏感，分子量越大，穩(wěn)定性就越差。所以，在分離純化過程中，條件應(yīng)該越溫和。許多生物藥品組分濃度非常低，但生物藥品產(chǎn)品純度卻要求很高，含量要到達(dá)95％甚至98％以上，最好是結(jié)晶態(tài)產(chǎn)品。另外，生物藥品還應(yīng)含有正常顏色、穩(wěn)定性和溶解速率。第一節(jié)概述一. 生物藥品特點(diǎn)生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第2頁(yè)生物藥品提取和純化可分為5個(gè)主要步驟：預(yù)處理、固液分離、濃縮、純化和產(chǎn)品定型(干燥，制丸，擠壓，造粒，制片)。每一步驟都可采取各種單元操作。在提取純化過程中，要盡可能降低操作步驟，因?yàn)槊恳徊僮鞑襟E都不可防止帶來?yè)p失。生物藥品提取工藝流程基本模式如圖7-1所表示。二、提取純化單元操作和基本工藝流程生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第3頁(yè)生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第4頁(yè)依據(jù)主要分離原因排列單元操作分離范圍見表7-1。

生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第5頁(yè)分離純化技術(shù)特點(diǎn)之一是各種技術(shù)相互交叉，新型分離純化方法不停涌現(xiàn)。如沉淀技術(shù)和親和技術(shù)相結(jié)合，形成了親和沉淀技術(shù)；超濾和親和技術(shù)相結(jié)合，形成了親和超濾技術(shù)；萃取與載體膜相結(jié)合，形成了液膜載體萃取法。這些新方法取長(zhǎng)補(bǔ)短，使分離純化過程愈加科學(xué)合理、快速有效、經(jīng)濟(jì)實(shí)用。三、提取純化單元操作技術(shù)特點(diǎn)生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第6頁(yè)生物藥品提取純化技術(shù)另一特點(diǎn)是重視新材料研制開發(fā)，如膜分離介質(zhì)，層析介質(zhì)，親和配基，新型萃取劑等在最近幾十年來發(fā)展非?？?。提取純化設(shè)備方面推陳出新，在設(shè)備計(jì)算機(jī)控制及生產(chǎn)自動(dòng)化、連續(xù)化及GMP規(guī)范化等方面取得了很大成就。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第7頁(yè)膜過濾技術(shù)發(fā)展很快，分為微濾、超濾和納濾，不但用于細(xì)胞分離，還用于蛋白質(zhì)濃縮。超濾技術(shù)主要特點(diǎn)是節(jié)能，對(duì)生物大分子類藥品無破壞作用。液-液萃取廣泛應(yīng)用于抗生素及小分子量藥品提取。溶劑選擇余地大，且易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。高速離心式液體萃取機(jī)是當(dāng)前效率最高，使用最廣裝置。液-液萃取技術(shù)還衍生出許多新萃取技術(shù)，如雙水相萃取，親和萃取，超臨界萃取等。雙水相萃取蛋白質(zhì)類藥品是大規(guī)模提取高純度蛋白質(zhì)類藥品有效技術(shù)。而超臨界萃取利用超臨界流體物理特征，即經(jīng)過壓力和溫度改變控制溶質(zhì)在溶劑中分子擴(kuò)散能力，控制溶質(zhì)溶解度，從而實(shí)現(xiàn)分離。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第8頁(yè)層析(色譜)技術(shù)是最近幾十年來發(fā)展最快純化技術(shù)。層析裝置種類很多，且分離純化機(jī)理也各不相同，適應(yīng)于許多藥品產(chǎn)品分離純化。離子交換色譜是應(yīng)用最廣，且易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)方法。應(yīng)用于抗生素、氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)提取和純化。分子篩層析依據(jù)分子量大小不一樣原理，適應(yīng)于蛋白質(zhì)類藥品純化。層析分離技術(shù)最高層次當(dāng)屬基于分子識(shí)別技術(shù)，如親和層析。這一技術(shù)已衍生出一大批新技術(shù)，如免疫親和層析、染料親和層析、金屬離子螯合層析。疏水性層析是基于分子疏水性能來分離純化。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第9頁(yè)高效液相色譜法本是分析化學(xué)慣用伎倆，現(xiàn)已將其擴(kuò)展到生物藥品分離純化應(yīng)用中。有些設(shè)備不但可進(jìn)行分析，也可進(jìn)行分離純化，在新藥開發(fā)過程中，縮短了分離純化所需時(shí)間。與層析技術(shù)同時(shí)發(fā)展各種分離介質(zhì)是層析分離技術(shù)保障，商品化預(yù)裝柱、緩沖劑、計(jì)算機(jī)程序控制使操作變得簡(jiǎn)單易學(xué)。置換層析與洗脫層析不一樣，是指吸附在層析柱上一個(gè)組分被另一個(gè)置換劑(與層析上介質(zhì)親和力大于原被吸附組分)置換出來層析技術(shù)。該技術(shù)有上樣量高，分辨率高特點(diǎn)。被分離樣品在分離過程中還有濃縮作用。總之，伴隨科技發(fā)展，新分離、提取、純化技術(shù)將不停得到改進(jìn)。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第10頁(yè)1994年開始了各項(xiàng)GMP驗(yàn)證，其中工藝論證是一個(gè)不可缺乏組成部分。產(chǎn)品純化是生產(chǎn)過程中關(guān)鍵一步。這包括到藥品質(zhì)量。所謂工藝驗(yàn)證，就是經(jīng)過系統(tǒng)方法得到關(guān)于生產(chǎn)工藝書面材料，證實(shí)并確保生產(chǎn)過程能一直如一地生產(chǎn)出特定高質(zhì)量產(chǎn)品。提取純化處理工藝驗(yàn)證范圍包含：廠房設(shè)施、工程儀表、機(jī)械設(shè)備、生產(chǎn)環(huán)境、工藝條件、計(jì)算機(jī)軟件、介質(zhì)、原材料、半成品、成品、操作人員素質(zhì)和測(cè)試方法等。四、提取純化工藝論證生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第11頁(yè)以上各個(gè)部分都要有驗(yàn)證材料或試驗(yàn)數(shù)據(jù)，依據(jù)這些材料和數(shù)據(jù)寫出驗(yàn)證匯報(bào)。當(dāng)工藝某一部分有較大變動(dòng)(大修、工藝條件改變)時(shí)，要進(jìn)行重新驗(yàn)證（再驗(yàn)證）。再驗(yàn)證是針對(duì)某一部分行動(dòng)，而不是整個(gè)工藝過程驗(yàn)證，所以比較簡(jiǎn)單、快速、易行。驗(yàn)證實(shí)施過程包含以下步驟：提出驗(yàn)證要求、組織驗(yàn)證小組、制訂驗(yàn)證方案、實(shí)施驗(yàn)證試驗(yàn)、寫出驗(yàn)證匯報(bào)和再驗(yàn)證。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第12頁(yè)一些藥品(如抗癌藥)往往對(duì)生物活細(xì)胞含有毒性，所以必須對(duì)中試或大生產(chǎn)全過程設(shè)置屏蔽防護(hù)裝置。其基本要求是：人員進(jìn)出口要加以控制；在工作場(chǎng)所保持負(fù)壓(一級(jí)、二級(jí)或三級(jí)生物密封室)；空氣排放必須經(jīng)過HEPA過濾器；對(duì)有煙霧產(chǎn)生設(shè)備要有附加屏蔽防護(hù)裝置；有適當(dāng)個(gè)人防護(hù)辦法；生產(chǎn)過程中所排放廢物要有生物學(xué)或化學(xué)除污方法；對(duì)工作人員進(jìn)行醫(yī)療監(jiān)測(cè)；環(huán)境監(jiān)測(cè)。五、生物藥品生產(chǎn)屏蔽防護(hù)技術(shù)(Containmenttechnology)生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第13頁(yè)生物藥品純化工藝技術(shù)要求高，應(yīng)盡可能選取高質(zhì)量設(shè)備，并要求有清潔各級(jí)GMP廠房。純化方法設(shè)計(jì)應(yīng)考慮到盡可能去除污染病毒、核酸、宿主細(xì)胞雜蛋白、糖及其它雜質(zhì)，要預(yù)防純化過程中帶入有害物質(zhì)。六、純化工藝過程質(zhì)量控制生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第14頁(yè)關(guān)于純度要求，可視產(chǎn)品起源、用途和使用方法而制訂，比如經(jīng)重復(fù)屢次使用真核細(xì)胞表示制品，要求純度到達(dá)98％以上；屢次使用原核細(xì)胞表示制品要達(dá)95％以上；外用制品純度可降低要求。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第15頁(yè)純化工藝每一步均應(yīng)測(cè)定純度，計(jì)算提純倍數(shù)和收率等。純化工藝過程中應(yīng)盡可能防止加入對(duì)人體有害物質(zhì)，若不得不加入，應(yīng)設(shè)法除盡；并在最終產(chǎn)品中檢測(cè)殘留量，殘留量應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于危害劑量，還要考慮到屢次使用積蓄作用。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第16頁(yè) 指發(fā)酵液不經(jīng)預(yù)處理，或僅經(jīng)過簡(jiǎn)單預(yù)處理。可采取樹脂吸附法、柱式流化床吸附法等。因?yàn)榭蔁o須先分離菌絲體和固形物，因而可簡(jiǎn)化分離過程，提升產(chǎn)品收率，降低吸附劑損耗，縮短操作時(shí)間。第二節(jié)預(yù)處理及固液分離技術(shù)一.直接從發(fā)酵液中提取產(chǎn)品生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第17頁(yè)(一)細(xì)胞破碎方法分類可分為兩大類：機(jī)械破碎和非機(jī)械方法破碎。對(duì)液相物料，機(jī)械破碎法有超聲波、機(jī)械攪拌和壓力法。對(duì)固相物料，機(jī)械破碎法有研磨法和壓力法。非機(jī)械破碎法分為脫水(空氣干燥、真空干燥、冷凍干燥和有機(jī)溶劑干燥)和裂解(物理法、化學(xué)法和酶法)兩類。裂解法又分為滲透壓突變法、冷凍和解凍法等?；瘜W(xué)法有陰陽(yáng)離子洗滌劑處理法、抗生素處理法和甘氨酸處理法。酶法可用溶菌酶等相關(guān)酶制劑處理，或用噬菌體裂解、抗生素處理等。二.細(xì)胞破碎(Celldisruption)生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第18頁(yè)

高壓均質(zhì)器法：是當(dāng)前較為理想大規(guī)模破碎細(xì)胞方法?？善扑榻湍妇?、大腸桿菌、假單胞菌、桿菌，甚至黑曲霉菌。將細(xì)胞懸浮液在高壓下通入一個(gè)孔徑可調(diào)排放孔中，菌體從高壓環(huán)境轉(zhuǎn)到低壓環(huán)境，細(xì)胞就輕易破碎。高壓均質(zhì)器操作參數(shù)較簡(jiǎn)單，主要是操作壓力、溫度以及經(jīng)過高壓均質(zhì)器次數(shù)。但機(jī)理卻頗為復(fù)雜。(二)破碎技術(shù)(微生物細(xì)胞破碎)工業(yè)上所用高壓均質(zhì)器操作壓力普通為55MPa，菌懸液一次經(jīng)過均質(zhì)器細(xì)胞破碎率在12％～67％。細(xì)胞破碎率與細(xì)胞種類相關(guān)。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第19頁(yè)可分為離心過濾、離心沉降、離心分離3種類型，所使用設(shè)備有過濾式離心機(jī)、沉降式離心機(jī)和分離機(jī)。過濾式離心機(jī)可用于處理懸浮固體顆粒較大、固體含量較高場(chǎng)所。沉降式離心機(jī)用于分離固體濃度較低固液分離。分離機(jī)用于分離兩種互不相溶、密度有微小差異乳濁液或含微量固體微粒乳濁液。三.離心生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第20頁(yè)離心技術(shù)在生物制藥研究及生產(chǎn)中應(yīng)用極廣，如從培養(yǎng)液中分離搜集細(xì)胞，去除細(xì)胞碎片，搜集沉淀物，從含蛋白質(zhì)液體中除去蛋白質(zhì)吸附劑，也包含用超速離心法分離溶解大分子。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第21頁(yè)膜分離基本原理是：膜作為一個(gè)有選擇性障礙物，允許一些組分經(jīng)過，而不許其它組分經(jīng)過，所以將料液分成透過液和保留液兩部分。膜分離技術(shù)在分離物質(zhì)過程中不包括相變，無二次污染。可分批操作，也可連續(xù)操作，易于自動(dòng)化和擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，分離效率較高。膜分離缺點(diǎn)是膜易污染，使膜性能降低。合成材料制成膜在耐熱、耐化學(xué)腐蝕等方面尚需改進(jìn)，膜分離技術(shù)需要與其它分離技術(shù)結(jié)合起來使用。(一)膜分離原理及特點(diǎn)四、膜分離技術(shù)生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第22頁(yè)按照膜孔徑大小，可將膜分為：微濾膜(0.025～14

m)；超濾膜(0.001～0.02m)；反滲透膜0.000l～0.001m)；納米膜(平均直徑2nm)。(二)膜分離材料及裝置膜能夠是完全可透，也能夠是半透性；有膜是獨(dú)立存在于流體間，也有膜是附著于支撐物或載體上微孔隙中。膜還必須含有高度滲透選擇性。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第23頁(yè)

用于生物制藥工業(yè)中膜材料要求耐溫性能要好、耐酸堿處理、有很好生物相容性（即要求膜對(duì)蛋白質(zhì)和酶等生物大分子不產(chǎn)生變性，無抗原性）。

按照膜結(jié)構(gòu)分為對(duì)稱性膜、不對(duì)稱膜和復(fù)合膜。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第24頁(yè)

按照膜材料可分為合成聚合物膜、無機(jī)材料膜和不銹鋼膜。如慣用微濾膜材料有醋酸纖維酯和硝酸纖維酯、再生纖維素和聚四氟乙烯等，超濾膜材料有聚砜、聚醚砜、聚偏二氟乙烯、硝酸纖維酯(或醋酸纖維酯)、尼龍、丙烯腈-氯乙烯共聚物膜。另外還有不銹鋼膜。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第25頁(yè)(三)膜過濾操作主要膜分離過程以下表

生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第26頁(yè)微濾器、超濾器和反滲透器主要類型有平板式、管式、中空纖維式和螺旋卷繞式4種。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第27頁(yè)當(dāng)溶液中欲被分離蛋白質(zhì)不受妨礙地經(jīng)過超濾膜孔隙時(shí)，假如在膜一側(cè)結(jié)合著親和配基，該蛋白質(zhì)就會(huì)與配基結(jié)合，因而結(jié)聚在膜這一側(cè)。不與配基結(jié)合其它物質(zhì)就將穿過孔而被帶走。再用適宜洗脫劑將該蛋白質(zhì)洗脫下來。(四)親和超濾

1．原理生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第28頁(yè)

決定超濾親和純化效率及質(zhì)量主要原因是：目標(biāo)物代表性分子量、大分子配基及超濾膜截留分子產(chǎn)量。超濾膜孔徑應(yīng)適宜，并要求分布均勻，以預(yù)防漏出配基。要便于蛋白質(zhì)及雜質(zhì)自由經(jīng)過。大分子配基吸附到膜上，會(huì)降低過濾速度，有配基還會(huì)沉淀到膜表面。在膜表面引入電荷能夠預(yù)防這種情況發(fā)生。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第29頁(yè)親和配基和目標(biāo)組分結(jié)合方式有兩種：(1)將含有目標(biāo)物溶液與配基在超濾器內(nèi)混合，或單獨(dú)在混合槽內(nèi)混合：(2)將含有目標(biāo)物溶液及含有配基溶液用泵分別送至膜兩側(cè)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)經(jīng)過膜抵達(dá)膜另一側(cè)(配基所在地)時(shí)，與配基結(jié)合。第1種方法較為慣用，適應(yīng)于相對(duì)較清發(fā)酵液，或發(fā)酵液預(yù)先經(jīng)過預(yù)超濾。2．親和結(jié)合方式生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第30頁(yè)蛋白質(zhì)和酶粗制品脫鹽方法除了離子交換法、凝膠過濾外，還有透析和滲濾。

五.滲濾(Diafiltration)技術(shù)和透析(Dialysis)生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第31頁(yè)

滲濾是利用超濾器，選擇性地使低分子量溶質(zhì)及水分子經(jīng)過超濾膜，而保留分子量較大溶質(zhì)。在操作過程中，要不停補(bǔ)充同體積去離子水，使原溶液中產(chǎn)品得到純化。其特點(diǎn)是：原溶液體積保持恒定，目標(biāo)物濃度也保持恒定。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第32頁(yè)

超濾是在外壓作用下進(jìn)行，而透析是在常壓下依靠小分子物質(zhì)擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)來完成。透析裝置有：透析袋、旋轉(zhuǎn)透析器、平面透析器、連續(xù)透析器、淺流透析器、微管透析器。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第33頁(yè)泡沫分離原理是：將氣體通入含各種組分溶液中，因?yàn)檫@些組分表面活性有差異，所以在溶液表面，一些組分將形成泡沫，泡沫穩(wěn)定性取決于操作條件及溶液生物學(xué)特征。泡沫中含有更多表面活性成份，故泡沫組分種類及其含量與溶液中不相同。這么，溶液中不一樣組分就得以分離。六、泡沫分離生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第34頁(yè)生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第35頁(yè)在泡沫分離過程中，要選擇好操作條件，以保持酶蛋白天然結(jié)構(gòu)不變，活力不降低。

泡沫分離法特點(diǎn)是分離所用機(jī)械結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，可連續(xù)操作，輕易放大，費(fèi)用也不高。

泡沫分離目標(biāo)，首先提升酶蛋白富集率(泡沫中蛋白質(zhì)濃度/最初溶液中蛋白質(zhì)濃度)，另首先提升酶蛋白提取率(泡沫中蛋白質(zhì)質(zhì)量/最初蛋白質(zhì)質(zhì)量)，或使多組分混合物中某一組分分配系數(shù)最大。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第36頁(yè)影響蛋白質(zhì)沉淀原因有蛋白質(zhì)溶解性、蛋白質(zhì)及沉淀劑濃度、溶液pH、離子強(qiáng)度、溫度和混合物中其它成份濃度。沉淀劑狀態(tài)(固態(tài)或飽和溶液)，沉淀劑加入速度、混合時(shí)間及混合程度、沉淀物分離提取等原因也必須考慮。沉淀普通只能到達(dá)初步純化目標(biāo)。技術(shù)較為成熟，在大規(guī)模生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。

第三節(jié)沉淀一、沉淀生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第37頁(yè)去除沉淀經(jīng)典操作是用洗滌法，利用溶解度差異將目標(biāo)物與雜質(zhì)分離。假如沉淀劑和目標(biāo)物在溶解性相同，可考慮用超濾方法或?qū)游龇椒▽⑺鼈兎蛛x。慣用分離沉淀方法有：沉淀、懸浮法、離心法、過濾法或錯(cuò)流膜過濾。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第38頁(yè)(二)鹽析劑用量確實(shí)定

生產(chǎn)中所需硫酸銨飽和度，需經(jīng)過試驗(yàn)決定。(一)鹽析劑選擇

慣用鹽析劑包含硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉等。最慣用是硫酸銨。二.鹽析生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第39頁(yè)pH值操作：從酶溶解度考慮，鹽析操作pH值常選擇在酶等電點(diǎn)附近。但從酶穩(wěn)定性方面來考慮，有些酶在等電點(diǎn)時(shí)穩(wěn)定性較差，所以要選擇最正確pH值。普通要求在酶最穩(wěn)定pH值前提下，再考慮最適宜于酶沉淀pH值。在操作時(shí)，一旦確定最正確pH值后，在添加硫酸銨之前，加入酸或堿，調(diào)整好酶液pH值，要盡可能防止pH值忽高忽低，以免破壞酶穩(wěn)定性。在添加硫酸銨時(shí)，要注意攪拌，并注意硫酸銨加入速度。普通是由少到多，遲緩加入，硫酸銨盡可能磨成細(xì)粉。(三)鹽析操作生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第40頁(yè)酶液靜置：加完硫酸銨后，酶液要靜置一段時(shí)間，使酶蛋白完全沉淀下來，酶靜置后，就不要再攪拌。溫度控制：有些酶在較高溫度下穩(wěn)定性能很好，可在常溫下進(jìn)行鹽析操作，而對(duì)于大多數(shù)酶，盡可能在低溫下進(jìn)行鹽析操作。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第41頁(yè)用有機(jī)溶劑處理時(shí)，盡可能用稀有機(jī)溶劑沉淀，而且一定要在低溫下進(jìn)行，最好在0℃以下。用有機(jī)溶劑沉淀得到酶蛋白，不要放置過久，要盡快加水溶解。(一)有機(jī)溶劑選擇可用于酶蛋白質(zhì)沉淀有機(jī)溶劑包含醇類物質(zhì)等。(二)有機(jī)溶劑沉淀操作三、有機(jī)溶劑沉淀生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第42頁(yè)許多食用級(jí)和藥用級(jí)酶制劑，慣用酒精作為沉淀劑。酒精用量應(yīng)依據(jù)試驗(yàn)來確定。沉淀宜在低溫下進(jìn)行，普通取15℃以下，但溫度太低，會(huì)使濾液中溶解度較低蛋白質(zhì)也沉淀下來。沉淀時(shí)pH值，盡可能靠近酶等電點(diǎn)附近。酒精是蛋白質(zhì)變性劑，酒精濃度太高時(shí)，易引發(fā)變性。加酒精后，在酶沉淀之前，變性愈加厲害，所以酒精最好在沉淀還未發(fā)生之前加完。酒精不能一次性全部加完，應(yīng)分批加入，加入時(shí)應(yīng)不停攪拌。加入一定量高嶺土或硅藻土，作為酶沉淀載體，便于離心搜集。離心分離結(jié)束后，應(yīng)馬上加水或緩沖液將酶沉淀物溶解，及時(shí)降低沉淀物內(nèi)酒精濃度，以防酶變性。(三)影響酒精沉淀收率主要原因生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第43頁(yè)將配基與可溶性載體偶聯(lián)后形成載體-配基復(fù)合物(親和沉淀劑)，該復(fù)合物與生物分子結(jié)合，在一定條件下可沉淀出來(即經(jīng)過誘導(dǎo)沉淀)。

(一)原理四、親和沉淀(Affinityprecipitation)生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第44頁(yè)配基-載體復(fù)合物可選擇性地與蛋白質(zhì)結(jié)合。配基包含：酶基質(zhì)、輔酶、免疫配基及有機(jī)染料等。溶液中pH、離子強(qiáng)度及蛋白質(zhì)濃度等條件對(duì)親和結(jié)合影響力并不大。只有競(jìng)爭(zhēng)性配基會(huì)降低產(chǎn)物與原配基親和結(jié)協(xié)力，甚至使親和結(jié)合發(fā)生逆轉(zhuǎn)。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第45頁(yè)引導(dǎo)產(chǎn)生沉淀方法有：離子交聯(lián)、加入帶相反電荷聚合物、加入帶相反電荷疏水基團(tuán)、改變pH、誘導(dǎo)產(chǎn)生疏水性沉淀、溫度誘導(dǎo)沉淀。

親和沉淀收率取決于親和反應(yīng)效率，也取決于沉淀性能。親和反應(yīng)之后，假如沉淀效果不好，可加入一些天然多聚物促進(jìn)沉淀。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第46頁(yè)

親和結(jié)合：將親和配基加到含有目標(biāo)物蛋白質(zhì)溶液中，調(diào)整好相關(guān)沉淀?xiàng)l件，使之有利于親和結(jié)合。(二)親和沉淀操作生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第47頁(yè)

洗滌：假如是在未經(jīng)處理粗制液中發(fā)生親和沉淀，可能會(huì)發(fā)生一些非特異性結(jié)合，一些無關(guān)物質(zhì)會(huì)陷于其中，所以在分離目標(biāo)物之前，要洗滌沉淀。其做法是：加入適當(dāng)清洗劑重新溶解沉淀，再沉淀；或在專一性洗脫之前，徹底洗滌沉淀。

生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第48頁(yè)

配基-載體復(fù)合物與目標(biāo)蛋白質(zhì)分離：分離結(jié)束之后，要確保回收目標(biāo)物蛋白質(zhì)和配基-載體復(fù)合物，目標(biāo)蛋白質(zhì)要到達(dá)一定純度，收率要高，要重新利用配基-載體復(fù)合物。配基價(jià)格較為昂貴時(shí)，多加入些天然載體可使配基-載體復(fù)合物循環(huán)使用效率提升以降低配基損失。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第49頁(yè)慣用沉淀技術(shù)還有用聚合物絮凝劑沉淀法、金屬離子沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法等。五、其它沉淀技術(shù)生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第50頁(yè)萃取指物質(zhì)在兩相之間傳質(zhì)過程。最常見是液液萃取，用有機(jī)溶劑作為萃取劑，萃取水溶液中某種組分。原溶劑和萃取劑普通是互不混溶。依據(jù)溶質(zhì)在這兩個(gè)互不混溶液相中分配系數(shù)差異，而實(shí)現(xiàn)將溶質(zhì)濃縮到萃取劑中。萃取是經(jīng)過溶質(zhì)在兩相之間競(jìng)爭(zhēng)性溶解(分配)而實(shí)現(xiàn)。萃取多用于小分子生物藥品，如抗生素和核苷酸，但也可萃取生物大分子，如雙水相萃取技術(shù)萃取蛋白質(zhì)。(一)定義和原理第四節(jié)萃取(Extraction)一、概述生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第51頁(yè)pH值影響分配系數(shù)，因而對(duì)萃取收率影響很大。影響萃取操作原因主要有：1．pH值二、萃取操作影響原因生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第52頁(yè)普通來說，低溫萃取速度較慢，可適當(dāng)提升溫度；不過因?yàn)檩腿┒酁橛袡C(jī)溶劑，在高溫下，產(chǎn)品穩(wěn)定性較差而受破壞，故萃取盡可能在低溫或常溫下進(jìn)行。溫度還影響分配系數(shù)。2．溫度生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第53頁(yè)加入鹽析劑，可使溶質(zhì)水中溶解度降低而易于轉(zhuǎn)入到溶劑中去。鹽析劑加入，也能降低有機(jī)溶劑在水中溶解度。3．鹽析生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第54頁(yè)萃取劑選擇依據(jù)主要是對(duì)所要萃取組分有較大溶解度，還應(yīng)含有良好選擇性。三、溶劑選擇選擇性可用分離因數(shù)來表示。依據(jù)相同相溶原理，應(yīng)選擇與目標(biāo)物結(jié)構(gòu)相近溶劑。在工業(yè)上還要求價(jià)格低廉，揮發(fā)性小，毒性小，起源廣等特點(diǎn)。另外，還要考慮對(duì)產(chǎn)品選擇性能，與原溶劑相不相混溶，兩相有較大密度差，產(chǎn)品對(duì)萃取劑敏感程度，萃取劑應(yīng)易于回收。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第55頁(yè)在萃取時(shí)要盡可能防止乳濁液形成?？山?jīng)過過濾和離心分散法、加熱、稀釋、加電解質(zhì)、吸附、頂替、轉(zhuǎn)型等方法破壞乳濁液。在生產(chǎn)中，應(yīng)盡可能防止采取強(qiáng)毒性溶劑，慣用溶劑有乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲醇、丁醇。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第56頁(yè)

萃取操作流程分單級(jí)萃取和多級(jí)萃取。多級(jí)萃取中又有多級(jí)錯(cuò)流萃取和多級(jí)逆流萃取。工業(yè)上萃取操作包含3個(gè)步驟：①混合：料液和萃取劑充分混合，形成含有很大比表面積乳濁液產(chǎn)物，自料液轉(zhuǎn)入萃取劑中；②分離：將乳濁液分成萃取相和萃余相；③提取及回收：產(chǎn)品提取及回收萃取劑，有時(shí)也要從萃余相中回收萃取劑。四、萃取方式生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第57頁(yè)雙水相系統(tǒng)普通是指將兩種親水性聚合物都加在水溶液中，當(dāng)超出某一濃度時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生兩相，兩種聚合物分別溶于互不相溶兩相中。經(jīng)典兩相系統(tǒng)如表7-11所表示。(一)雙水相形成雙水相萃取法一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是可直接從細(xì)胞破碎勻漿中萃取蛋白質(zhì)，而無需分離細(xì)胞碎片。因而可直接萃取，到達(dá)固液分離和純化目標(biāo)。五、雙水相萃取生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第58頁(yè)生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第59頁(yè)影響物質(zhì)分配平衡主要原因有：聚合物及成鹽濃度，聚合物平均相對(duì)分子質(zhì)量，體系pH值及其它鹽種類及濃度，菌體或細(xì)胞種類及含量，體系溫度等。(二)影響物質(zhì)分配平衡原因生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第60頁(yè)將一些小分子配基共價(jià)連接到形成相多聚物之上，在雙水相系統(tǒng)中，配基如聚集于上層，目標(biāo)物蛋白質(zhì)就經(jīng)過形成生物特異性復(fù)合物而轉(zhuǎn)移到上層，從而到達(dá)純化該種蛋白質(zhì)目標(biāo)。(三)雙水相親和分配純化生物分子生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第61頁(yè)親和分配雙水相萃取技術(shù)可用于酶及蛋白質(zhì)分離純化，還可分離一些特定細(xì)胞。

許多配基都可用于親和分配，包含酶、抗原及抗體、激素及其相對(duì)應(yīng)接收體等。慣用聚合物有聚乙二醇、葡聚糖和變性淀粉等，其中使用最多是聚乙二醇。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第62頁(yè)反膠束是表面活性劑分散于連續(xù)有機(jī)相中自發(fā)形成納米尺度一個(gè)聚集體。反膠束溶液是透明、熱力學(xué)穩(wěn)定系統(tǒng)。六、反膠束提取純化技術(shù)生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第63頁(yè)

影響反膠束萃取蛋白質(zhì)主要原因有：水相pH值、離子強(qiáng)度、溫度、親和表面活性劑。

反膠束系統(tǒng)作為液液萃取方法，更含有選擇性。這種方法優(yōu)點(diǎn)是使熱敏性、親水蛋白質(zhì)在一個(gè)近似于水相環(huán)境中提取出來，使蛋白質(zhì)活性不受到損失。在反膠束萃取蛋白質(zhì)研究中，慣用是陰離子表面活性劑。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第64頁(yè)超臨界流體萃取技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是節(jié)能，可使用生理惰性溶劑在低溫下分離組分，當(dāng)前這一新技術(shù)應(yīng)用即使還不普遍，但潛在應(yīng)用前景很廣。七、超臨界萃取技術(shù)生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第65頁(yè)廣義吸附是有選擇性地將一個(gè)或各種溶質(zhì)從流動(dòng)相中轉(zhuǎn)移到固定相中過程。利用固定相和流動(dòng)相之間相互作用將組分分離開來。吸附機(jī)理可分為5類：分子大小、范德華力、極性、離子交換、親和。在此主要介紹層析、吸附(Adsorption)和離子交換技術(shù)。第五節(jié)吸附(Sorption)生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第66頁(yè)

層析也稱為色譜，利用各組分與固定相親和力或相互作用方面差異實(shí)現(xiàn)分離。層析技術(shù)廣泛用于生物藥品分離和純化，主要包括液-固柱層析系統(tǒng)。液-固層析滯留分子機(jī)理有吸附、離子交換、親和、分配、凝膠過濾等。主要層析技術(shù)如表7-13所表示。(一)層析原理一、層析基本知識(shí)生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第67頁(yè)生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第68頁(yè)在填充床中進(jìn)行層析，是最為常見層析操作。層析柱內(nèi)填充層析材料，含有樣品液體(盡能夠濃縮)加到柱頂部(這稱為順上柱)，然后加入洗脫劑，在重力或壓力作用下，向下流動(dòng)，流經(jīng)填充床層析柱內(nèi)固定相，依據(jù)組分與固定相之間相互作用力，目標(biāo)物分子在固定相和流動(dòng)相中分配，因而在每一相中均停留一定時(shí)間。在固定相中停留時(shí)間短分子將很快地被流動(dòng)相帶走，而在固定相中停留時(shí)間長(zhǎng)分子在柱中流動(dòng)較慢。不一樣種類分子因它們?cè)诓灰粯酉嘀蟹峙洳町?，而被分離成不一樣區(qū)帶。所以，層析是利用不一樣組分在層析介質(zhì)中遷移速度差異而進(jìn)行分離純化。其基本原理如圖7-20所表示。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第69頁(yè)生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第70頁(yè)層析柱操作取決于許多原因，如所用介質(zhì)、洗脫劑空柱流速、柱孔隙率、介質(zhì)可滲透性能、組分在固定相和流動(dòng)相中分配系數(shù)、處理量等原因。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第71頁(yè)

不一樣組分所形成區(qū)帶相隔越遠(yuǎn)，這說明層析柱選擇性能越好；不過當(dāng)組分在柱中向下移動(dòng)時(shí)，往往會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)散，表現(xiàn)為區(qū)帶變寬，在一定長(zhǎng)度色譜柱內(nèi)所產(chǎn)生區(qū)帶越窄，色譜系統(tǒng)效率也就越高。(二)層析兩個(gè)基本問題：區(qū)帶分離和峰形變寬生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第72頁(yè)

選擇性和效率是相輔相成：效率高色譜系統(tǒng)，即使其選擇性較差，也能對(duì)被分離組分進(jìn)行很好分離(即區(qū)帶之間不會(huì)重合)。一樣道理，選擇性好系統(tǒng)，即使它效率較差，也能使物質(zhì)得到良好分離。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第73頁(yè)(四)層析流動(dòng)相操作方式

層析分離照操作方法主要有迎頭法、置換法和洗脫法。當(dāng)前主要以洗脫法為主。(三)層析分辨率分辨率可定義為兩個(gè)被分離區(qū)帶之間寬度與區(qū)帶寬度之比值。若兩個(gè)被分離區(qū)帶之間寬度越大，每個(gè)組分區(qū)帶寬度越小，則分辨率越高，分離效果越好。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第74頁(yè)

柱式層析系統(tǒng)組成主要是蠕動(dòng)泵、層析柱、檢測(cè)器、統(tǒng)計(jì)儀和部分搜集器。試驗(yàn)室所用多為玻璃柱，工業(yè)所用層析柱用金屬或聚丙烯材料制成。層析用介質(zhì)種類很多，如表7-14所表示。(五)層析裝置和操作生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第75頁(yè)層析操作包含：裝柱、加樣、洗滌、洗脫和再生。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第76頁(yè)

裝柱質(zhì)量好壞，對(duì)層析分離效果影響很大；盡可能清液上柱；洗脫前普通要用清水或緩沖液將雜質(zhì)洗滌下來；要依據(jù)被吸附物特點(diǎn)(如組分溶解度，吸附劑性質(zhì)，洗脫溶劑極性等)來選擇適當(dāng)洗脫劑，然后采取恒定洗脫法、逐次洗脫法或梯度洗脫法進(jìn)行洗脫；目標(biāo)物洗下后，要用再生劑處理層析介質(zhì)。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第77頁(yè)

離子交換色譜利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結(jié)協(xié)力差異進(jìn)行物質(zhì)分離操作技術(shù)。二、離子交換技術(shù)

生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第78頁(yè)離子交換法生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第79頁(yè)常見離子交換劑分為離子交換樹脂、大孔離子交換樹脂、離子交換纖維素和葡聚糖凝膠離子交換劑等。各種交換劑均可按其可解離交換基團(tuán)分為陽(yáng)離子交換劑(強(qiáng)酸、中強(qiáng)酸、弱酸)和陰離子交換劑(強(qiáng)堿、中強(qiáng)堿性和弱堿性)兩大類。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第80頁(yè)離子交換法廣泛用于提取抗生素、氨基酸、核苷酸、有機(jī)酸及生物大分子。在生物制藥工業(yè)中，發(fā)酵培養(yǎng)液中同時(shí)存在著各種離子，目標(biāo)物離子與樹脂親和力越大，就越輕易被樹脂吸附。離子化合價(jià)與水合半徑、溶液酸堿度都會(huì)影響交換選擇性。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第81頁(yè)將大網(wǎng)格離子交換樹脂功效團(tuán)去掉，僅保留多孔骨架后，其性質(zhì)就可和活性炭、硅膠等吸附劑相同，這種稱為大網(wǎng)格聚合物吸附劑。大網(wǎng)格吸附劑是一個(gè)非離子型共聚物，它能夠借助范德華力從溶液中吸附各種有機(jī)物質(zhì)。三．大網(wǎng)格聚合物吸附生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第82頁(yè)大網(wǎng)格吸附劑吸附能力，不但與樹脂化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理性能相關(guān)，而且與溶質(zhì)及溶液性質(zhì)相關(guān)。依據(jù)“類似物輕易吸附類似物“標(biāo)準(zhǔn)，普通非極性吸附劑適宜于從極性溶劑(如水)中吸附非極性物質(zhì)；反之亦然；而中等極性吸附劑則對(duì)上述兩種情況，都含有吸附能力。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第83頁(yè)大網(wǎng)格吸附劑含有孔隙小，選擇性好，解吸輕易，機(jī)械強(qiáng)度好，可重復(fù)使用和流體阻力較小優(yōu)點(diǎn)。能夠用于弱電解質(zhì)或非電解質(zhì)或非離子型物質(zhì)。

生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第84頁(yè)

凝膠過濾又稱為凝膠擴(kuò)散層析、排阻層析、分子篩層析等。凝膠層析柱中裝有多孔填料，如交聯(lián)聚苯乙烯；多孔玻璃、多孔硅膠、交聯(lián)葡聚糖等，這些固體載體，含有細(xì)微孔，其孔徑大小可準(zhǔn)確控制，溶劑分子能夠自由出入，溶質(zhì)分子依據(jù)分子大小，在孔中擴(kuò)散情況則很不相同。大分子只能進(jìn)入較大孔內(nèi)，小分子不但能進(jìn)入大孔內(nèi)，而且也能進(jìn)入小孔內(nèi)，因?yàn)榇蠓肿右驗(yàn)樗?jīng)過旅程較短，先被溶劑帶出，而小分子溶質(zhì)后被洗脫下來。另外，分子形狀及溶質(zhì)與凝膠之間存在非特異性吸附作用也影響洗脫結(jié)果。(一)凝膠層析基本原理四、凝膠過濾(Gelmtration)生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第85頁(yè)層析(色譜）生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第86頁(yè)分子篩—凝膠過濾法生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第87頁(yè)生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第88頁(yè)用交聯(lián)葡聚糖凝膠可分離相對(duì)分子質(zhì)量數(shù)百到數(shù)十萬物質(zhì)，用瓊脂糖凝膠可分離相對(duì)分子質(zhì)量為數(shù)十萬到上億物質(zhì)。粘度高溶液會(huì)顯著影響分辨率，凝膠還輕易受到蛋白質(zhì)阻塞。

凝膠材料有葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、微孔玻璃等。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第89頁(yè)凝膠過濾和層析放大方法較為簡(jiǎn)單。首先要對(duì)試驗(yàn)室所取得純化方案進(jìn)行優(yōu)化。再放大時(shí)，先要保持柱床高度、線性流速及上樣濃度不變，然后增加上樣量，增加體積流速和柱直徑。(二)凝膠過濾及層析放大生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第90頁(yè)

選擇凝膠基質(zhì)時(shí)要考慮原因有：操作模式、分辨率(通?；|(zhì)顆粒直徑越小，分辨率越高)及基質(zhì)穩(wěn)定性能。

生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第91頁(yè)親和層析主要過程是：(1)配基固定化，即選擇適當(dāng)配基與不溶性載體偶聯(lián)，或共價(jià)結(jié)合成含有特異親和性分離介質(zhì)；(2)吸附樣品，用親和層析介質(zhì)選擇性地吸附生物活性物質(zhì)，雜質(zhì)不能被吸附而在洗滌時(shí)被去除；(3)樣品解吸(洗脫)，選擇適宜條件，使被吸附在親和介質(zhì)上生物活性物質(zhì)解吸下來。第六節(jié)親和層析一．親和層析概述生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第92頁(yè)親和層析生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第93頁(yè)生物親和層析包含以下類型：疏水反應(yīng)層析、金屬螯合親和層析、免疫親和層析、共價(jià)親和層析、固定化染料親和層析、特殊基團(tuán)親和層析、親和分配、親和電泳、亞基交換層析、高壓親和層析、定量親和層析、膜親和層析、置換親和層析。1．親和層析技術(shù)類型生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第94頁(yè)

載體是與配基親和結(jié)合層析介質(zhì)，在親和層析中作用是使配基固定化，同時(shí)提供形成親和正確兩物質(zhì)特異性結(jié)合空間環(huán)境。慣用載體有纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠，多孔玻璃珠等。2．親和層析載體(Matrix)和配基(Ligand)生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第95頁(yè)在親和層析中起可逆結(jié)合特異性物質(zhì)稱為配基。按照親和層析原理，親和層析任何一方都可作為配基，普通用小分子量親和配基分離蛋白質(zhì)，但也能夠反過來，用固定化配基專一性蛋白質(zhì)來純化小分子量配基。

生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第96頁(yè)(2)抗體與抗原、病毒、細(xì)胞；在生物親和層析中，可利用下述生物親和關(guān)系進(jìn)行分離純化。也可將配基分為兩大類：通用配基和特殊配基。特殊配基包含以下一些類型：(1)酶與底物或底物類似物、酶抑制劑、輔助因子(如輔酶，金屬離子)；生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第97頁(yè)

通用配基包含蛋白質(zhì)A-SepharoseCL-4B、conA-Sepharose、小扁豆外源性凝集素、小麥芽外源性凝集素等。(3)激素、維生素與受體蛋白和載體蛋白；(4)外源凝集素(Lectin)與多糖化合物、糖蛋白、細(xì)胞表面受體蛋白、細(xì)胞；(5)核酸與互補(bǔ)堿基鏈段、組蛋白、核酸聚合酶及核酸結(jié)合蛋白。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第98頁(yè)配基偶聯(lián)是采取化學(xué)合成方法，將配基與載體結(jié)合在一起。不一樣配基種類有不一樣方法。有時(shí)，可在載體和配基之間插入一個(gè)“接枝”或稱“手臂”，以消除空間障礙，對(duì)提升吸附容量有利。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第99頁(yè)親和層析選擇性非常好，所以可降低提純步驟。不過親和介質(zhì)普通價(jià)格昂貴，處理量不大，大規(guī)模應(yīng)用較少，在試驗(yàn)室制備時(shí)，普通只是在純化后期使用。3．親和層析優(yōu)缺點(diǎn)生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第100頁(yè)

基本原理是生物大分子中功效團(tuán)與層析劑上互補(bǔ)結(jié)構(gòu)形成可逆性共價(jià)鍵。二、共價(jià)親和層析

含有共價(jià)反應(yīng)活性二硫鍵層析劑可用葡聚糖凝膠或瓊脂糖凝膠為載體?，F(xiàn)已經(jīng)有商品化供給層析介質(zhì)。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第101頁(yè)

基于疏水特征吸附功效，是疏水層析技術(shù)基礎(chǔ)。將一系列長(zhǎng)度不一樣碳?xì)浠衔锝拥江傊禽d體上，從而得到一系列對(duì)應(yīng)疏水性瓊脂糖層析介質(zhì)，可用它們從粗提取液中分離純化一些可溶性蛋白質(zhì)。三、疏水層析

理想疏水配基應(yīng)該是親水性，而且是生物惰性，不應(yīng)該產(chǎn)生非特異性二次吸附。瓊脂糖最慣用。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第102頁(yè)鹽析離子存在會(huì)增強(qiáng)蛋白質(zhì)吸附在碳?xì)浠衔锝又Ν傊巧?，而鹽溶離子則可用來洗脫被強(qiáng)烈吸附蛋白質(zhì)。在高濃度鹽析離子(如硫酸銨)存在下進(jìn)行吸附是當(dāng)前最常見操作方法。經(jīng)過逐步降低鹽濃度而洗脫。當(dāng)洗脫液表面張力降低到蛋白質(zhì)表面張力時(shí)，蛋白質(zhì)就開始洗脫下來。在水相環(huán)境中，溫度和pH對(duì)吸附和洗脫都有影響。疏水層析可用于蛋白質(zhì)純化。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第103頁(yè)

蛋白質(zhì)分子能夠與金屬離子發(fā)生親和反應(yīng)，并與之結(jié)合，可用于吸附純化蛋白質(zhì)。四、固定化金屬離子親和層析固定化金屬離子親和層析柱制法：將柱子浸沒于某種金屬離子(如Cu2+、Zn2+、Ni2+、CO2+)緩沖溶液中，直至螯合到固定相上金屬離子和溶液中金屬離子到達(dá)平衡。固相載體，通常是硅或多聚物(如交聯(lián)化瓊脂糖、葡聚糖)，與配位體(如亞氨基二乙酸，IDA)共價(jià)連接。當(dāng)在緩沖溶液中，浸泡平衡后，經(jīng)洗滌，可將含有生物活性物質(zhì)樣品上柱，與固定化金屬-配基復(fù)合物有親和力分子都將被滯留，其余則流出柱外。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第104頁(yè)若要將蛋白質(zhì)從柱上洗脫下來，則可經(jīng)過改變鹽濃度、改變pH，或由競(jìng)爭(zhēng)性試劑將蛋白質(zhì)置換下來，這些方式機(jī)理都是經(jīng)過降低固定化金屬離子和蛋白質(zhì)之間親和常數(shù)。可采取分級(jí)洗脫或梯度洗脫方式。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第105頁(yè)IMAC方法主要優(yōu)點(diǎn)是：可用不一樣金屬離子固定到螯合載體上，所以可用一個(gè)更強(qiáng)螯合劑將所使用螯合劑洗脫下來，從而實(shí)現(xiàn)再生。螯合劑較穩(wěn)定，金屬結(jié)合特征不會(huì)大幅下降。經(jīng)過選擇適宜金屬離子，可選取不一樣分離方法；將不一樣金屬離子固定到柱上，可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)和配基之間不一樣吸附特征。在大多數(shù)情況下，從IMAC柱上洗脫下來蛋白質(zhì)，依然含有生物活性。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第106頁(yè)

抗原和抗體作用含有高度專一性，而且它們結(jié)合親和力極強(qiáng)。所以用適當(dāng)方法將抗原或抗體結(jié)合到層析劑上，便可用來有效地分離和純化各自互補(bǔ)免疫物質(zhì)。五、免疫親和層析生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第107頁(yè)免疫親和層析有時(shí)也稱為抗體親和層析，該技術(shù)慣用蛋白A和蛋白G對(duì)于各種起源免疫球蛋白IgGFc區(qū)域高度親和和高度專一性結(jié)合為基礎(chǔ)。用這些蛋白作為配基與載體(如瓊脂糖)結(jié)合來制備層析載體。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第108頁(yè)

一些有機(jī)染料如蒽醌化合物和偶氮化合物含有類似于NAD+結(jié)構(gòu)，所以一些需要核苷酸類物質(zhì)為輔酶酶，對(duì)這些染料有一定親和力，假如這些染料作為配基共價(jià)偶聯(lián)到纖維素或瓊脂糖等多糖載體上，就能制得染料親和層析柱。親和染料層析已成功地分離純化了許多酶。六、染料配基層析生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第109頁(yè)

凝集素是一類能與糖殘基專一性結(jié)合蛋白質(zhì)，所發(fā)生結(jié)合反應(yīng)是可逆。它們能與多糖、糖蛋白及紅細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞凝集體產(chǎn)生專一性結(jié)合。與固定化凝集素結(jié)合物質(zhì)可用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試劑或離子濃度梯度洗脫下來。

七、凝集素親和層析生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第110頁(yè)置換層析是指吸附在層析柱上一個(gè)組分被另一個(gè)組分或試劑置換出層析柱技術(shù)。首先用起始緩沖液平衡，再用一樣緩沖液溶解或充分透析平衡樣品上柱；然后再由一樣緩沖液配制置換劑溶液進(jìn)行置換洗脫。因?yàn)橹脫Q劑對(duì)層析柱中固定相親和性大于被分離樣品親和性，當(dāng)加入置換劑后，置換劑前沿迫使樣品最終后沿組分解吸附，這一被解吸附組分又去置換前面親和性弱組分。這么不一樣組分因?yàn)槠鋵?duì)固定相親和能力不一樣，在對(duì)吸附部位競(jìng)爭(zhēng)和相互置換中，按照各組分對(duì)固定相親和力大小而被分離并形成相互毗鄰無拖尾純組分峰區(qū)帶。八、置換層析生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第111頁(yè)置換劑在被分離樣品后面移動(dòng)，推進(jìn)著樣品區(qū)帶以相同速度向前移動(dòng)。在置換層析中，樣品分離是因?yàn)楸晃浇M分之間對(duì)固定相吸附部位直接競(jìng)爭(zhēng)作用結(jié)果。這種直接競(jìng)爭(zhēng)造成各組分按照它們對(duì)固定相親和性大小形成一置換序列，而且在置換劑推進(jìn)下，以相同速度向下移動(dòng)。理想置換洗脫圖譜中，每一組分不是形成鐘罩形洗脫曲線，而是形成矩形平臺(tái)洗脫峰。相毗鄰各組分平臺(tái)洗脫峰組成了一個(gè)臺(tái)階式層析圖譜。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第112頁(yè)圖7-25是置換層析原理圖。

生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第113頁(yè)置換層析所使用層析系統(tǒng)與洗脫層析相同。如可用吸附層析、離子交換層析、反向?qū)游龅?。整個(gè)操作過程包含層析柱平衡，上樣，加置換劑置換，分步搜集，層析柱再生。置換層析允許上樣量能夠比傳統(tǒng)常規(guī)層析高得多，而且樣品組分是以濃縮狀態(tài)被分離。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第114頁(yè)這種技術(shù)將蛋白質(zhì)等物質(zhì)等電點(diǎn)特征與離子交換色譜特征結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)分離。首先假定用陰離子交換劑分離某種蛋白質(zhì)，當(dāng)介質(zhì)pH值低于其等電點(diǎn)時(shí)，不與陰離子交換劑發(fā)生交換，而是伴隨洗脫液向下移動(dòng)。當(dāng)環(huán)境pH值高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，才可與離子交換劑結(jié)合。在洗脫過程中，環(huán)境pH值是不停下降，當(dāng)pH下降至蛋白質(zhì)等電點(diǎn)之下時(shí)，蛋白質(zhì)又重新脫離交換劑而被洗脫，移至pH大于等電點(diǎn)時(shí)又重新結(jié)合，這么不停重復(fù)，直至蛋白質(zhì)從柱下流出。1、原理九、色譜聚焦生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第115頁(yè)當(dāng)某種蛋白質(zhì)在柱上隨洗脫液下移至等電點(diǎn)處時(shí)，其移動(dòng)速度顯著減慢。假如此時(shí)再加入另一份含有相同蛋白質(zhì)組分樣品，該蛋白質(zhì)將以洗脫液速度下移，直至追到上一次進(jìn)樣、正在慢速移動(dòng)、靠近等電點(diǎn)處蛋白質(zhì)處，從而實(shí)現(xiàn)聚焦。第二個(gè)樣品加入時(shí)間要掌握好，必須在第一個(gè)樣品蛋白質(zhì)峰還未洗脫之前加入，不然就不能聚焦。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第116頁(yè)pH梯度形成：色譜聚焦系統(tǒng)pH梯度，是利用離子交換劑本身帶電基團(tuán)緩沖作用自動(dòng)形成。如選取陰離子交換劑，色譜柱先用起始緩沖液平衡到pH9，洗脫液pH選定為6，加入洗脫液，開始加洗脫液時(shí)，流出液pH值靠近于9，伴隨洗脫液加入，流出液pH值逐步下降，最終柱內(nèi)完全被洗脫液所平衡，流出液pH到達(dá)6。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第117頁(yè)多緩沖交換劑：用于色譜聚焦交換劑是一個(gè)專門開發(fā)交換劑，商品通常是以懸浮液形式提供。緩沖劑也是專門開發(fā)兩性電解質(zhì)緩沖劑，由分子量大小不一樣各種組分多羧基多氨基化合物組成。與這兩種多緩沖劑相匹配多緩沖交換劑通常以無菌液體形式提供，用前加以稀釋。2．交換劑和緩沖液體系生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第118頁(yè)3、操作步驟生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第119頁(yè)在含蛋白質(zhì)溶液中，應(yīng)用100～500MPa高壓可使多聚體蛋白質(zhì)解離成亞基，且不會(huì)使其失活。不過當(dāng)壓力高于600MPa以上時(shí)，蛋白質(zhì)則會(huì)產(chǎn)生不可逆失活。十、高壓親和層析生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第120頁(yè)大規(guī)模純化蛋白質(zhì)初步階段，處理量大，但分辨率要求不高，并不要求馬上就采取層析技術(shù)，可先用分步沉淀、鹽析或有機(jī)溶劑沉淀等方法。假如蛋白質(zhì)數(shù)量不多，含量較低樣品，也可用分辨率和處理量中等離子交換色譜技術(shù)，必要話，也可采取高分辨率、低容量親和層析技術(shù)和等電聚焦。十一、合理設(shè)計(jì)層析方案生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第121頁(yè)

免疫親和層析和反相層析易使蛋白質(zhì)變性，不能用于純化活性蛋白質(zhì)，離子交換色譜法是較為普遍使用分離活性蛋白質(zhì)方法。對(duì)于很敏感蛋白質(zhì)，在分離純化時(shí)，分離純化步驟盡可能少，且不要頻繁變換緩沖劑。1．保留蛋白質(zhì)生物活性需注意問題生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第122頁(yè)在設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)純化步驟時(shí)，要充分利用各種蛋白質(zhì)之間性質(zhì)差異。以下所列出是最主要一些特征：2．利用蛋白質(zhì)差異來設(shè)計(jì)分離步驟生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第123頁(yè)

(1)電荷蛋白質(zhì)中帶電氨基酸百分比各不相同，在一定pH下，凈電荷也不一樣。所以能夠利用這一性質(zhì)采取離子交換色譜法分離純化蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)帶電荷與離子交換樹脂上固定載體所帶電荷相反，蛋白質(zhì)與載體結(jié)合強(qiáng)度取決于蛋白質(zhì)上電荷數(shù)量。對(duì)于大規(guī)模(100g蛋白質(zhì))分離純化，常采取纖維素為基質(zhì)樹脂，流速較快，柱床體積也較大，但此法分辨率不高。欲得到高分辨率純化結(jié)果，可用瓊脂糖為基質(zhì)樹脂，但其處理量較小。

生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第124頁(yè)假如蛋白質(zhì)量小于10mg，則可采取快速蛋白液相層析法。有預(yù)裝柱配套，柱直徑小，分辨率很高。假如兩種蛋白質(zhì)在某一pH值帶有相同電荷，不過在另一個(gè)不一樣pH值，則帶不一樣電荷。所以在一個(gè)分離純化過程中，經(jīng)常分為若干個(gè)離子交換步驟。這又分為幾個(gè)情況，如可使用同一個(gè)樹脂，但可設(shè)定不一樣平衡時(shí)pH值，或使用兩種相反電荷樹脂，比如，第一個(gè)樹脂結(jié)合有帶負(fù)電羧甲基基團(tuán)(CM)，另一個(gè)帶有正電二乙氨乙基基團(tuán)(DEAE)。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第125頁(yè)利用蛋白質(zhì)之間等電點(diǎn)差異，可開發(fā)一些分離純化方法。如層析聚焦法，這是一個(gè)離子交換技術(shù)，蛋白質(zhì)結(jié)合到陰離子交換劑上，然后經(jīng)過連續(xù)地降低緩沖液pH值，將蛋白質(zhì)依據(jù)其等電點(diǎn)次序依次洗脫。這是一個(gè)分辨率及容量相當(dāng)高分離技術(shù)，可用于初步純化蛋白質(zhì)深入純化。另一個(gè)技術(shù)是等電點(diǎn)聚焦，此法處理容量不大，但分辨率很高，適于分離蛋白質(zhì)混合物。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第126頁(yè)(2)分子大小

超濾技術(shù)及分子排阻層析就是依據(jù)蛋白質(zhì)分子大小性質(zhì)而設(shè)計(jì)。分子排阻法分辨率不算高，不過假如目標(biāo)物蛋白質(zhì)與其它雜蛋白質(zhì)分子量相差很大，則此法分辨率還能夠。因?yàn)槭苤w積影響，此法分離容量也不高。凝膠電泳也是基于蛋白質(zhì)大小，小分子蛋白質(zhì)移動(dòng)速度快，該技術(shù)分辨蛋白質(zhì)能力很強(qiáng)，但蛋白質(zhì)易失活，故慣用于蛋白質(zhì)分析。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第127頁(yè)(3)專一性結(jié)合

許多蛋白質(zhì)經(jīng)過與一些成份結(jié)合而含有生物功效，如酶與基質(zhì)結(jié)合，有時(shí)與活化劑或抑制劑結(jié)合，激素與受體結(jié)合，抗體與抗原結(jié)合。許多親和層析技術(shù)就是利用上述特征。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第128頁(yè)依據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)與低分子量化合物相互反應(yīng)(如酶與基質(zhì)或基質(zhì)類似物)親和方法專一性普通不強(qiáng)，因?yàn)榕浠膳c混合物中若干種蛋白質(zhì)結(jié)合。更新奇親和分離方法是使用雙功效NAD+衍生物，更有選擇性地親和結(jié)合脫氫酶。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第129頁(yè)(4)特殊性質(zhì)

利用一些蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性，先將樣品加熱處理，耐熱性能不好雜蛋白變性沉淀，而耐熱仍留在溶液中。也可利用蛋白質(zhì)在極端pH環(huán)境下穩(wěn)定性能，對(duì)于這種情況，可將樣品調(diào)至低pH或高pH，保溫一段時(shí)間，雜蛋白就能夠沉淀下來。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第130頁(yè)

最終值得一提是，假如需要話，也可為一些蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)出一些特殊性質(zhì)，以幫助它們純化。如在蛋白質(zhì)上加入一段聚精氨酸或聚賴氨酸，以增加其電荷，使該蛋白質(zhì)在離子交換層析上得到純化。或者將一段聚合組氨酸引入到固定化金屬親和層析上。生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第131頁(yè)在純化初步階段，可經(jīng)過測(cè)定在280nm處吸光度確定其含量。在純化后期階段，可用更為準(zhǔn)確方法。3．測(cè)定和數(shù)據(jù)處理生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第132頁(yè)

層析技術(shù)在重組蛋白分離純化方面發(fā)揮了越來越大作用。但層析技術(shù)并不能處理全部分離純化問題，層析技術(shù)必須和其它技術(shù)相結(jié)合，并考究分離純化步驟合理安排，才能得到好分離純化效果。常見安排以下：4．重組蛋白質(zhì)分離純化操作次序生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第133頁(yè)鹽析→凝膠過濾→離子交換有機(jī)溶劑沉淀→親和吸附→染料配基吸附等有機(jī)溶劑沉淀→離子交換→鹽析→凝膠過濾有機(jī)溶劑沉淀→親和吸附→鹽析→凝膠過濾親和吸附→鹽析→凝膠過濾生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第134頁(yè)也可按以下方法選擇組合：生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第135頁(yè)大分子產(chǎn)物分離純化普通需要較長(zhǎng)時(shí)間。決定純化時(shí)間原因有很多，但最主要可能是大多數(shù)提取純化過程都是利用物質(zhì)擴(kuò)散性能；酶是一個(gè)熱敏性產(chǎn)品，在分離操作過程中，普通都要保持在0℃左右，低溫有利于酶活力保留，但會(huì)延長(zhǎng)分離純化時(shí)間；5．純化所需時(shí)間生物藥物的提取純化技術(shù)專家講座第136頁(yè)為了操作者安全，大多數(shù)國(guó)家對(duì)于含有外源基因重組細(xì)胞貯存和處理都有明確法律要求，只要含有外源DNA細(xì)胞是存活，這些細(xì)胞都要放置在有特殊安全辦法密封裝置內(nèi)，當(dāng)這些細(xì)胞被殺滅或適當(dāng)處理后，才能對(duì)細(xì)胞提取物深入加工。6．重組蛋白質(zhì)特殊提取精制技術(shù)