微生物的實驗室培養(yǎng)詳解

關(guān)于微生物的實驗室培養(yǎng)詳解微生物包括：細(xì)菌、藍藻、放線菌、支原體、衣原體原核生物界真菌

原生生物病毒沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物真核生物有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物第2頁,共63頁，2024年2月25日，星期天菌落：不同的細(xì)菌的菌落特征不同菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。一個細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體。第3頁,共63頁，2024年2月25日，星期天第4頁,共63頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)皿第5頁,共63頁，2024年2月25日，星期天按成分分按功能分按物理狀態(tài)分培養(yǎng)基類型合成培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基分類：

（一）培養(yǎng)基：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。第6頁,共63頁，2024年2月25日，星期天選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基:

分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:

分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基:

分離固氮菌不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基:

分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基:

分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞第7頁,共63頁，2024年2月25日，星期天根據(jù)微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品配制而成，用以鑒別不同種類的微生物。例如，在培養(yǎng)基中加入伊紅和美藍，可以用來鑒別飲用水和乳制品中是否存在大腸桿菌等細(xì)菌：如果有大腸桿菌，其代謝產(chǎn)物就與伊紅和美藍結(jié)合，使菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤。鑒別培養(yǎng)基第8頁,共63頁，2024年2月25日，星期天不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、和氮源、無機鹽等營養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì),例如:生長因子(即細(xì)菌生長必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)第9頁,共63頁，2024年2月25日，星期天1、獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是什么？2、避免雜菌污染的方法主要包括哪四個方面3、什么是消毒、滅菌，常用方法有哪些？（二）無菌技術(shù)第10頁,共63頁，2024年2月25日，星期天消毒與滅菌消毒：指使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。滅菌：指使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有微生物，包括芽孢和孢子。滅菌與消毒技術(shù)是微生物有關(guān)工作中最普通也是最重要的技術(shù)。第11頁,共63頁，2024年2月25日，星期天消毒的方法：1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化學(xué)藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進行皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線或化學(xué)藥物消毒第12頁,共63頁，2024年2月25日，星期天滅菌的方法：1、灼燒滅菌2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸汽滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.第13頁,共63頁，2024年2月25日，星期天1.無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。旁欄思考第14頁,共63頁，2024年2月25日，星期天2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實驗操作者的雙手答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。旁欄思考第15頁,共63頁，2024年2月25日，星期天實驗操作

本實驗用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基進行大腸桿菌的純化培養(yǎng)，可分為制備培養(yǎng)基和純化大腸桿菌兩個階段進行。第16頁,共63頁，2024年2月25日，星期天2.1微生物的實驗室培養(yǎng).flv第17頁,共63頁，2024年2月25日，星期天第18頁,共63頁，2024年2月25日，星期天1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？問題討論

答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？

答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。第19頁,共63頁，2024年2月25日，星期天3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，將平板倒置，既可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染，又可避免培養(yǎng)基中的水分過快地?fù)]發(fā)。

答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。第20頁,共63頁，2024年2月25日，星期天純化大腸桿菌接種方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法第21頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

平板劃線法:通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作,將聚集的菌鐘逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面.

在數(shù)次劃線后,可以分離到由一個細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體,這就是菌落.第22頁,共63頁，2024年2月25日，星期天第23頁,共63頁，2024年2月25日，星期天微生物的恒溫培養(yǎng)第24頁,共63頁，2024年2月25日，星期天問題討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。第25頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。

3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落。第26頁,共63頁，2024年2月25日，星期天第27頁,共63頁，2024年2月25日，星期天第28頁,共63頁，2024年2月25日，星期天問題討論

涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進行無菌操作？

應(yīng)從操作的各個細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。第29頁,共63頁，2024年2月25日，星期天固體培養(yǎng)基：菌落第30頁,共63頁，2024年2月25日，星期天菌種的保存1、臨時保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。

2、長期保存：甘油冷凍管藏法第31頁,共63頁，2024年2月25日，星期天第32頁,共63頁，2024年2月25日，星期天課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)第33頁,共63頁，2024年2月25日，星期天一、課題背景1、尿素的利用

尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細(xì)菌利用尿素的原因土壤中的細(xì)菌分解尿素是因為它們能合成脲酶CO(NH2)脲酶+CO2NH3+H2O第34頁,共63頁，2024年2月25日，星期天4、課題目的①從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌②統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌第35頁,共63頁，2024年2月25日，星期天一.研究思路㈠.篩選菌株㈡.統(tǒng)計菌落數(shù)目㈢.設(shè)置對照第36頁,共63頁，2024年2月25日，星期天1、實例：啟示：尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。原因：因為熱泉溫度70～800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細(xì)菌被篩選出來。DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)，此項技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。㈠.篩選菌株第37頁,共63頁，2024年2月25日，星期天2、實驗室中微生物的篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。什么是選擇性培養(yǎng)基？第38頁,共63頁，2024年2月25日，星期天15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：①從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？固體培養(yǎng)基第39頁,共63頁，2024年2月25日，星期天②在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。5、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理第40頁,共63頁，2024年2月25日，星期天6、怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

是分離尿素細(xì)菌判斷該培養(yǎng)基有無選擇性實驗組對照組培養(yǎng)基類型是否接種

目的

結(jié)果只生長尿素細(xì)菌生長多種微生物是第41頁,共63頁，2024年2月25日，星期天6、怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

是分離尿素細(xì)菌判斷該培養(yǎng)基有無選擇性實驗組對照組培養(yǎng)基類型是否接種

目的

結(jié)果只生長尿素細(xì)菌生長多種微生物是第42頁,共63頁，2024年2月25日，星期天1、顯微鏡直接計數(shù)：利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。㈡.統(tǒng)計菌落數(shù)目：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運動細(xì)菌的計數(shù)；需要相對高的細(xì)菌濃度；個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；缺點第43頁,共63頁，2024年2月25日，星期天2.間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法）⑴原理：在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細(xì)胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個單細(xì)胞。⑵常用方法：稀釋涂布平板法。每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。第44頁,共63頁，2024年2月25日，星期天注意事項①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進行計數(shù)。②為使結(jié)果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。③統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。第45頁,共63頁，2024年2月25日，星期天設(shè)置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。㈢.設(shè)置對照：第46頁,共63頁，2024年2月25日，星期天實例：在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計菌落數(shù)目的實驗時，A同學(xué)從對應(yīng)的106

倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個菌落。分析其原因。原因：⑴土樣不同，⑵培養(yǎng)基污染或操作失誤

(或者是混入了其他的含氮物質(zhì))第47頁,共63頁，2024年2月25日，星期天小結(jié)：通過這個事例可以看出，實驗結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進行實驗方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。第48頁,共63頁，2024年2月25日，星期天二.實驗的具體操作

㈠.土壤取樣

從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。◆取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。㈡.制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。第49頁,共63頁，2024年2月25日，星期天◆應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g。◆在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進行[三]樣品的稀釋第50頁,共63頁，2024年2月25日，星期天㈣.取樣涂布◆實驗時要對培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。第51頁,共63頁，2024年2月25日，星期天㈣.取樣涂布◆分離不同的微生物采用不同的稀釋度稀釋倍數(shù)目的細(xì)菌104、105、106保證獲得菌落數(shù)在30～300之間、適于計數(shù)的平板放線菌103、104、105真菌102、103、104原因：不同微生物在土壤中含量不同第52頁,共63頁，2024年2月25日，星期天㈤.微生物的培養(yǎng)與觀察思考：要將哪些培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)？第53頁,共63頁，2024年2月25日，星期天㈤.微生物的培養(yǎng)與觀察在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。

培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細(xì)菌：30～37℃培養(yǎng)1～2d放線菌：25～28℃培養(yǎng)5～7d霉菌：25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。第54頁,共63頁，2024年2月25日，星期天◆如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30——300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗不精確，需要重新實驗。第55頁,共63頁，2024年2月25日，星期天微生物的培養(yǎng)與觀察第56頁,共63頁，2024年2月25日，星期天三.結(jié)果分析與評價1.通過對