核酸的生物合成與降解

1.轉錄的反應n1ATPn2CTPn3GTPn4UTPRNA聚合酶DNA模板RNA+（n1+n2+n3+n4)PPi定義：從DNA區(qū)段(基因)中的一條鏈為模板，在RNA聚合酶的催化下，以四種核苷酸為原料，按照A-U，G-C配對原則合成RNA一.概論第2頁,共64頁，2024年2月25日，星期天特點：不對稱轉錄--我們將用作RNA合成的模板的鏈叫做反義鏈；另一條不做模板的鏈叫有義鏈。RNA為全保留轉錄轉錄開始不需要引物，鏈的延長方向也是5′→3′RNA聚合酶對利福平敏感2.轉錄的方式一.概論第3頁,共64頁，2024年2月25日，星期天2.轉錄的方式一.概論第4頁,共64頁，2024年2月25日，星期天2.轉錄的方式對于整個DNA雙鏈，每條鏈上有的區(qū)段用作有義鏈，有的區(qū)段用作反義鏈。所以，具有相對意義。一.概論第5頁,共64頁，2024年2月25日，星期天1.轉錄的酶亞基組成：a2bb'ws=a2bb'w+s

全酶核心酶

——RNA聚合酶

a亞基——解開前方的DNA雙螺旋、恢復后面的DNA雙螺旋b亞基——催化磷酸二酯鍵的形成b'亞基——與DNA的非模板鏈結合

二.原核生物轉錄第6頁,共64頁，2024年2月25日，星期天亞基組成：a2bb'ws=a2bb'w+s

全酶核心酶

核心酶：解開前方的DNA雙螺旋、RNA鏈的延伸、恢復后面的DNA雙螺旋s亞基：識別DNA上轉錄的起始部位，從而引導全酶結合上去此外，每個RNA聚合酶還含有2個Zn離子。1.轉錄的酶二.原核生物轉錄第7頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

DNA上存在著轉錄的起始信號，它是特殊的核苷酸序列，稱為啟動子（promoter）。轉錄是由RNA聚合酶全酶結合于啟動子而被啟動的。

2.轉錄過程-轉錄啟動二.原核生物轉錄第8頁,共64頁，2024年2月25日，星期天ThenucleotidesequencesofrepresentativeE.colipromoters

2.轉錄過程-轉錄啟動二.原核生物轉錄第9頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

聚合酶全酶上的s因子能識別啟動子，并識別有義鏈，從而使全酶定位到啟動子部位。二.原核生物轉錄2.轉錄過程-轉錄啟動第10頁,共64頁，2024年2月25日，星期天第11頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

如何確定啟動子部位？DNAFoot-printing第12頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

由全酶在啟動子附近將DNA局部解鏈，約解開17個堿基對。（酶與啟動子結合的部位是AT富集區(qū)，有利于解鏈）

第一個核苷三磷酸(常常是GTP或ATP)結合到全酶上，形成“啟動子-全酶-核苷三磷酸”三元起始復合物。

第二個核苷酸參入，連結到第一個核苷酸的3'羥基上，形成了第一個磷酸二酯鍵。s因子從全酶上掉下，又去結合其它的核心酶。

二.原核生物轉錄2.轉錄過程-轉錄啟動第13頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

當s因子從核心酶上脫落后，核心酶與DNA鏈的結合變得疏松(依靠其蛋白質的堿性與酸性核酸之間的非特異性的靜電引力)，可以在模板鏈上滑動，方向為DNA模板鏈的3′→5′，同時將核苷酸逐個加到RNA鏈的3'-OH端，使RNA鏈以5′→3′方向延伸。二.原核生物轉錄2.轉錄過程-鏈的延伸第14頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

DNA上的解螺旋區(qū)：在RNA鏈延伸的同時，RNA聚合酶繼續(xù)解開它前方的DNA雙螺旋，暴露出新的模板鏈，而后面被解開的兩條DNA單鏈又重新形成雙螺旋，DNA上的解螺旋區(qū)保持約17個堿基對的長度。二.原核生物轉錄2.轉錄過程-鏈的延伸第15頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

RNA-DNA雜交區(qū)：剛合成出來的RNA鏈與解開的DNA模板鏈之間可形成一小段RNA-DNA雜交區(qū)。隨著核心酶的移動，RNA鏈不斷地延伸，雜交區(qū)也往前延伸，但后面的雜交區(qū)隨著DNA雙螺旋的回復，RNA鏈逐漸被置換出來，因此，雜交區(qū)也保持著固定一小段。二.原核生物轉錄2.轉錄過程-鏈的延伸第16頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

DNA分子上有終止轉錄的特殊信號，也是特定的核苷酸序列，稱為終止子。核心酶能識別終止子，停止轉錄。

這一過程有時需要一種蛋白質——

因子的幫助（當終止信號較弱時）；有時不需要（當終止信號較強時）。

核心酶釋放出RNA，自己也離開DNA。

DNA上的解鏈區(qū)重新形成雙螺旋。二.原核生物轉錄2.轉錄過程-終止第17頁,共64頁，2024年2月25日，星期天真核細胞的轉錄比較復雜。真核基因的順式作用元件（cis-actingelement），即DNA上對基因表達有調節(jié)活性的特定序列，按其功能可分為啟動子、增強子（enhancer）和沉默子（silencer）等。真核生物的轉錄，是由RNA聚合酶與這些元件相互作用，在蛋白質輔助因子ρ的協同下完成的。三.真核生物轉錄1.真核細胞的聚合酶第18頁,共64頁，2024年2月25日，星期天三.真核生物轉錄1.真核細胞的聚合酶第19頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

真核細胞啟動子是指通用(基礎)轉錄因子和RNA聚合酶II通過相互作用，組裝轉錄起始復合體的位點。三.真核生物轉錄2.真核細胞的啟動子

第20頁,共64頁，2024年2月25日，星期天三.真核生物轉錄2.真核細胞的啟動子

第21頁,共64頁，2024年2月25日，星期天第22頁,共64頁，2024年2月25日，星期天真核生物啟動子的多元性

啟動子包括

TATA序列(TATAbox)：-25-35TATAbox的作用：使轉錄精確地起始；啟動子是指確保轉錄精確而有效地起始的DNA序列；TATA序列也叫核心啟動元件(corepromoterelement)第23頁,共64頁，2024年2月25日，星期天(GCbox)GCCACACCC或GGGCGGG序：-80-110;GC區(qū)主要控制轉錄起始頻率。CCAAT序列(CAATbox)：-70-80CAAT區(qū)主要控制轉錄起始頻率。第24頁,共64頁，2024年2月25日，星期天第25頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

增強子、及其對轉錄的影響

a增強子是指能使和它連鎖的基因轉錄頻率明顯增加的DNA序列；

b增強效應十分明顯，一般能使基因轉錄頻率增加10-200倍；

c增強效應與其位子和取向無關；三.真核生物轉錄3.真核細胞的增強子

第26頁,共64頁，2024年2月25日，星期天d大多為重復序列，一般長度為50bp，其內部常含有一個核心序列(G)TGGA/TA/TA/T(G)；e增強效應有嚴密的組織和細胞特異性；f沒有基因專一性；g許多增強子還受外部信號的調控。第27頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

Enhancer的結構與功能

雙方向性，組織特異性，位點非專一性

----Enhancer由兩個以上的增強子成分(EnhancerElement)組成

----EnhancerElement必需由兩個緊密相連,具有間距效應的

增強子元(Enhanson）組成

----各個Enhanson(cis-factor)與激活蛋白(trans-factor)結合

增強特異性轉錄

第28頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

En.Elem.En.ElemEn.Elem.-250-180

coreCTCIITCIsphIIsphI

Ap3Ap2Ap1e.g.SV40Enhancer(-179~-250)

遠距離控制，無方向性

mRNA

+1GCCAATTATA

促進轉錄復合體基本轉錄復合體第29頁,共64頁，2024年2月25日，星期天RNAinterference(RNAi)representsamechanisminventedbynaturetoprotectthegenome.Inthepastfewyearsthefieldhasemergedatasurprisinglyhighpace.

ThewholestorystartedwhenFireetal.(1998)identifieddoublestrandedRNA(dsRNA)asthemediatorofgenesilencinginC.elegansandreferredtothetermRNAi.三.真核生物轉錄4.基因沉默-iRNA

WhatisRNAinterference(RNAi)第30頁,共64頁，2024年2月25日，星期天TheunderlyingmolecularmechanismofgenesilencingprovidesuswithshortinterferingRNAs(siRNAs)whichallowstotargetanygenewithhighspecificityandefficiency.WhatisRNAinterference(RNAi)第31頁,共64頁，2024年2月25日，星期天Whatistheoutcome,indeed?Introductionintocellsofadouble-strandedRNAcorrespondingtoanexpressedgeneleadstodown-regulationofthatgenethroughdegradationofitsmRNA第32頁,共64頁，2024年2月25日，星期天HowdoesthesiRNAwork?Introductionofsyntheticsmalldouble-strandoligonucleotide(21-23ntlength)correspondingtospecificgeneintocellwillspecificallyknockdowncorrespondingmRNAinthecell第33頁,共64頁，2024年2月25日，星期天Anenzymecomplex(Dicer),wasdiscoveredinDrosophila(Bernsteinetal.,2001)aspartofaconservedDicerfamilyexpressedinorganismsundergoingRNAi.DicercontainsdomainsfordsRNAbinding,RNAunwinding,andribonucleaseactivity,andisassociatedwithadditionalproteinstodrivethecleavageofdsRNAinanATPdependentmanner.TheresultingsiRNAaspartofamultiproteinRNA-inducingsilencingcomplex(RISC)istargetedtothecomplementaryRNAspecieswhichisthencleaved.第34頁,共64頁，2024年2月25日，星期天siRNA:SmallinterferingRNA第35頁,共64頁，2024年2月25日，星期天第36頁,共64頁，2024年2月25日，星期天真核基因轉錄的蛋白因子為蛋白質編碼的基因的準確轉錄受多種轉錄因子的調控。RNA聚合酶必須在特定的轉錄因子的參與下才能起始轉錄。至今有20種以上蛋白因子參與轉錄起始，可分為三類：通用(基礎)轉錄因子(basaltranscriptionalactivity)：

包括TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、TFIIH、TFIIJ等。這些蛋白因子對于準確轉錄起始是必需的。三.真核生物轉錄5.轉錄因子

第37頁,共64頁，2024年2月25日，星期天2.啟動子特異性轉錄激活蛋白(promoter-specifictranscriptionalactivators)它們通過與啟動了附近或遠離啟動子的DNA分子上調控區(qū)(增強子)相結合，作用于轉錄起始復合體組裝過程，具有DNA結合域和激活轉錄所需要的激活結構域。第38頁,共64頁，2024年2月25日，星期天一般情況，細胞中通用轉錄因子的種類同基因轉錄的調控蛋白因子(包括轉錄激活蛋白、輔助激活蛋白、負調控蛋白因子等)相比，數量較少，但在細胞中的含量是豐富的；這些通用轉錄因子在啟動子區(qū)同RNA聚合酶一起組裝成轉錄起始復合物;第39頁,共64頁，2024年2月25日，星期天特異性調控蛋白因子種類繁多，但含量即非常之少，它們通過其DNA結合域識別特定的DNA序列，這種特性決定了特異性開或關。第40頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

SpecificTrans-factorcharacteristics

l

多為變構蛋白，具有兩個功能結構域（domain）DNA-bindingdomainactivationdomainDNA-bindingdomainDimerizationdomain(insomedimerfactor)activationdomain第41頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

Transcriptionactivationdomainhaveaveryhighproportionofacidicaminoacid(alsocalledacidicdomainoracidblobsornegativenoodles)

Trans-factor的活性調節(jié)受到嚴格的信號因子的調控signal一般狀態(tài)（無活性）bindingDNA

變構活化狀態(tài)激活轉錄第42頁,共64頁，2024年2月25日，星期天幾種常見的DNA結合蛋白的結構第43頁,共64頁，2024年2月25日，星期天Helix-turn-helixmotif第44頁,共64頁，2024年2月25日，星期天Helix-turn-helixdomainandbindingwithDNA第45頁,共64頁，2024年2月25日，星期天亮氨酸“拉鏈”式二聚體亮氨酸“拉鏈”(leucinezipper)指調控蛋白中發(fā)現的一段富含亮氨酸序列，這個區(qū)域易于形成兩性-螺旋或卷曲螺旋構象，這些蛋白能形成穩(wěn)定的二聚體。轉錄因子在模板DNA上形成同源(或異源)二聚體的能力決定了基因表達。第46頁,共64頁，2024年2月25日，星期天亮氨酸“拉鏈”式二聚體在“拉鏈”式蛋白中，“拉鏈”區(qū)以外的氨基酸在都呈堿性，具有結合DNA的本領，“拉鏈”的吻合有利于形成平行的二重DNA結合區(qū)。第47頁,共64頁，2024年2月25日，星期天Monomeric&dimericstructureofLuczipperLuczipperdimerization第48頁,共64頁，2024年2月25日，星期天Zincfingerregion一對組氨酸殘基TFIIIA蛋白具有9個相似的重復單位每個單位大約由30個氨基酸殘基組成一對半胱氨酸zinc

Zincfingerregion第49頁,共64頁，2024年2月25日，星期天Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His單個鋅指的保守區(qū)序列第50頁,共64頁，2024年2月25日，星期天典型真核基因轉錄調控示意圖通用轉錄因與RNA聚合酶II在啟動處組裝成轉錄起始復合體;不同的基因調控蛋白結合到各自的基因調控序列上;轉錄起始速率是由調控蛋白與通用轉錄起始復合體相互作用而得以調整.第51頁,共64頁，2024年2月25日，星期天基因調控序列—啟動子—調控蛋白的spatial關系A.結合于增強子處的調控蛋白NtrC與細菌RNA聚合酶的相互作用B.為A的電鏡圖譜第52頁,共64頁，2024年2月25日，星期天真核基因轉錄的綜合調控第53頁,共64頁，2024年2月25日，星期天四.轉錄后加工1.mRNA加工-帽子結構

第54頁,共64頁，2024年2月25日，星期天第55頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

有利于核糖體對mRNA的識別，Cap0是必需的，而Cap1和Cap2并非需要的；增加mRNA的穩(wěn)定性，避免核酸