天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制

第八章

天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制重點：天冬氨酸族氨基酸生物合成路徑及代謝調(diào)整機制；天冬氨酸族氨基酸生物合成代謝調(diào)整機制；酵母和霉菌賴氨酸生物合成路徑和調(diào)整機制；賴氨酸生產(chǎn)菌育種路徑；

難點：天冬氨酸族氨基酸生物合成代謝調(diào)整機制；天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第1頁氨基酸本身合成在不一樣生物體中，有較大差異，然而許多氨基酸合成路徑在不一樣生物體中也有共同之處。

按照起始物可將氨基酸合成份成幾個家族：㈠谷氨酸族（α-酮戊二酸族）包含：谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、賴氨酸和脯氨酸；㈡丙酮酸族包含：丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸；

天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第2頁㈢天冬氨酸族（草酰乙酸族）包含：天冬氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸和異亮氨酸；㈣磷酸甘油酸族包含：甘氨酸、絲氨酸和半胱氨酸；㈤芳香族包含：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；另外，組氨酸合成為單獨一條路徑。天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第3頁第一節(jié)生物合成路徑（天冬氨酸族）及代謝調(diào)控機制一、生物合成路徑

天冬氨酸族氨基酸合成能夠以草酰乙酸或天冬氨酸為原料，合成蘇氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸和賴氨酸。天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第4頁葡萄糖丙酮酸草酰乙酸天冬氨酸天冬氨酸β-半醛

賴氨酸高絲氨酸蛋氨酸

蘇氨酸異亮氨酸EMPCO2固定、氧化氨基化反應(yīng)天冬氨酸激酶天冬氨酸β-半醛脫氫酶二氫吡啶二羧酸（DDP）合成酶高絲氨酸脫氫酶琥珀酰高絲氨酸合成酶高絲氨酸激酶蘇氨酸脫氨酶天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第5頁天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第6頁二、天冬氨酸族生物合成代謝調(diào)整機制在細菌中，即使天冬氨酸族氨基酸生物合成路徑是相同，不過其代謝調(diào)整機制是各種多樣。1.大腸桿菌K12①天冬氨酸激酶（AK）

AKⅠ:受蘇氨酸、異亮氨酸多價抑制和阻遏天冬氨酸激酶AKⅡ：受蛋氨酸專一性抑制和阻遏AKⅢ：受賴氨酸專一性抑制和阻遏天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第7頁②天冬氨酸-β-半醛脫氫酶專一性受賴氨酸不完全抑制③二氫吡啶二羧酸（DDP）合成酶（賴氨酸分支第一個酶）DDP合成酶受賴氨酸反饋抑制。二氨基庚二酸（DAP）脫羧酶受賴氨酸阻遏天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第8頁④高絲氨酸脫氫酶（HD）（通向蘇氨酸、蛋氨酸分支第一個酶）

HDHDⅠ：受蘇氨酸反饋抑制HDⅡ：受蛋氨酸阻遏⑤蘇氨酸脫氨酶（異亮氨酸合成路徑酶）受異亮氨酸反饋抑制和阻遏天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第9頁天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第10頁2.黃色短桿菌

其賴氨酸生物合成調(diào)整機制比大腸桿菌簡單，其天冬氨酸激酶只有一個，該酶含有兩個變構(gòu)部位，能夠與終產(chǎn)物結(jié)合，當只有一個終產(chǎn)物（賴氨酸或蘇氨酸）與酶結(jié)合，酶活性不受影響。當兩種終產(chǎn)物（賴氨酸和蘇氨酸）同時過量時，與酶兩個變構(gòu)部位結(jié)合，該酶活性受到抑制，這種終產(chǎn)物反饋抑制稱為協(xié)同反饋抑制。P74圖6-3天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第11頁天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第12頁3.乳糖發(fā)酵短桿菌賴氨酸合成調(diào)整P75，圖6-51）存在代謝優(yōu)先向蘇氨酸和蛋氨酸方向進行。2）與黃色短桿菌區(qū)分：AK受賴氨酸+蘇氨酸反饋抑制存在代謝互鎖，DDP合成酶合成受亮氨酸阻遏。DDP還原酶受半胱氨酸和丙氨酸抑制。天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第13頁天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第14頁三、酵母和霉菌賴氨酸生物合成路徑和調(diào)整機制所謂同型TCA循環(huán)路徑進行，但生物合成酶與TCA循環(huán)酶完全兩樣。天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第15頁天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第16頁第二節(jié)賴氨酸生產(chǎn)菌育種路徑出發(fā)菌株選擇：要求代謝比較簡單細菌（如黃色短桿菌、谷氨酸棒桿菌、乳酸發(fā)酵短桿菌等）

1.優(yōu)先合成轉(zhuǎn)換：滲漏缺點型選育。降低高絲氨酸脫氫酶活性，使代謝流轉(zhuǎn)向優(yōu)先合成賴氨酸。

高絲氨酸脫氫酶滲漏缺點型。

天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第17頁2.切斷支路代謝：營養(yǎng)缺點型選育。黃色短桿菌、谷氨酸棒桿菌，對天冬氨酸激酶反饋抑制是賴氨酸+蘇氨酸協(xié)同作用，經(jīng)過誘變使高絲氨酸脫氫酶缺失，切斷通向蘇氨酸、蛋氨酸代謝流，控制高絲氨酸（或蘇氨酸+蛋氨酸）量，降低蘇氨酸濃度，解除協(xié)同反饋作用，過量積累賴氨酸。天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第18頁3.抗結(jié)構(gòu)類似物突變株選育（代謝調(diào)整突變）。優(yōu)點：突變株遺傳性地解除了終產(chǎn)物對本身合成路徑酶調(diào)整控制，不受培養(yǎng)基中所要求物質(zhì)濃度影響，生產(chǎn)較穩(wěn)定。經(jīng)過誘變使天冬氨酸激酶編碼結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變，對賴氨酸及結(jié)構(gòu)類似物不敏感，即使有過量蘇氨酸存在，該酶也不與賴氨酸或結(jié)構(gòu)類似物結(jié)合，但酶活性中心不變。天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第19頁4.解除代謝互鎖①選育亮氨酸缺點型菌株，或者以抗AEC賴氨酸生產(chǎn)菌為出發(fā)菌株，經(jīng)誘變得到抗AEC兼抗亮氨酸缺點型菌株。②選育抗亮氨酸結(jié)構(gòu)類似物突變株，從遺傳上解除亮氨酸對DDP合成酶阻遏。③選育對苯醌或喹啉衍生物敏感菌株，這是一個尋找亮氨酸滲漏缺點型菌株有效方法。天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第20頁5.增加前體物生物合成和阻塞產(chǎn)物生成：

方法：①選育丙氨酸缺點型；②選育抗天冬氨酸結(jié)構(gòu)類似物突變株；③選育適宜CO2固定酶/TCA循環(huán)酶活性比突變株；1.經(jīng)過TCA循環(huán)

葡萄糖→丙酮酸→草酰乙酸→天冬氨酸賴氨酸2.經(jīng)過磷酸烯醇式丙酮酸羧化反應(yīng)

葡萄糖→磷酸烯醇式丙酮酸→草酰乙酸→天冬氨酸丙酮酸賴氨酸天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第21頁6.改變細胞膜透過性7.選育溫度敏感突變株天冬氨酸系分枝代謝路徑中，末端產(chǎn)物種類多，調(diào)整機制復(fù)雜，為高效率生產(chǎn)賴氨酸，能夠采取順次解除各種調(diào)整機制誘變育種，取得多重標識突變株。天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第22頁8.應(yīng)用細胞工程和遺傳工程育種9.預(yù)防高產(chǎn)菌株回復(fù)突變選育遺傳性穩(wěn)定菌株定向賦加生產(chǎn)菌多個遺傳標識菌種培養(yǎng)和保藏時，培養(yǎng)基要豐富，尤其有足夠要求營養(yǎng)物培養(yǎng)時添加抗生素，抑制恢復(fù)突變株生長，到達分純目標。天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第23頁第三節(jié)蘇氨酸、蛋氨酸、高絲氨酸和天冬氨酸育種路徑一、蘇氨酸育種路徑天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第24頁天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第25頁蘇氨酸高產(chǎn)菌株應(yīng)具備生化特征DDP合成酶活力極弱或欠缺琥珀酰高絲氨酸合成酶酶活力極弱或欠缺蘇氨酸脫氨酶酶活力極弱或欠缺CO2固定能力強天冬氨酸合成能力強天冬氨酸激酶活力強，對蘇氨酸和賴氨酸協(xié)同反饋抑制不敏感高絲氨酸脫氫酶活力強，不受蘇氨酸反饋調(diào)整。天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第26頁二、高絲氨酸菌種選育路徑天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第27頁DDP合成酶活力極弱或欠缺琥珀酰高絲氨酸合成酶酶活力極弱或欠缺高絲氨酸激酶欠缺CO2固定能力強天冬氨酸合成能力強天冬氨酸激酶活力強，對蘇氨酸和賴氨酸協(xié)同反饋抑制不敏感高絲氨酸脫氫酶活力強，不受蘇氨酸和蛋氨酸反饋調(diào)整。高產(chǎn)高絲氨酸菌株應(yīng)具備生化特征天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第28頁三、蛋氨酸育種路徑天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵機制第29頁高產(chǎn)蛋氨酸應(yīng)具備生化特征DDP合成酶活力極弱或欠缺S-腺苷蛋氨酸酶活力極弱或欠缺高絲氨酸激酶欠缺CO2固定能力強天冬氨酸合成能力強天冬氨酸激酶活力強，對蘇