基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座

教學(xué)目標(biāo)

知識(shí)與能力1.簡述DNA重組技術(shù)所需三種基本工具作用。2.認(rèn)同基因工程誕生和發(fā)展離不開理論研究和技術(shù)創(chuàng)新。二、教學(xué)重點(diǎn)和難點(diǎn)1.教學(xué)重點(diǎn)：DNA重組技術(shù)所需三種基本工具作用。2.教學(xué)難點(diǎn):基因工程載體需要具備條件?；蚬こ痰幕驹砗图夹g(shù)專家講座第1頁基因工程基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第2頁每100kg豬或牛胰腺中僅可提取4~5g。1979年，美國將人胰島素基因重組到大腸桿菌內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌生產(chǎn)胰島素，大大降低了生產(chǎn)成本。治療糖尿病特效藥——據(jù)調(diào)查：年全世界約有糖尿病患者1.8億人，我國約6000萬。胰島素基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第3頁抗蟲害玉米轉(zhuǎn)魚抗寒基因番茄轉(zhuǎn)基因

鮭魚基因工程產(chǎn)品基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第4頁基因工程產(chǎn)物基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第5頁轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因甜椒乳汁中含有些人生長激素轉(zhuǎn)基因牛(阿根廷)基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第6頁什么叫基因工程？基因工程又叫DNA重組技術(shù)。該技術(shù)是在生物體外，經(jīng)過對DNA分子進(jìn)行人工“剪切”和“拼接”，對生物基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無性繁殖，使重組基因在受體細(xì)胞內(nèi)表示，產(chǎn)生出人類所需要基因產(chǎn)物。（一）基因工程概念基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第7頁基因工程概念基因工程別名操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程結(jié)果（目標(biāo)）DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平剪切→拼接→導(dǎo)入→表示按照預(yù)先設(shè)計(jì)藍(lán)圖，定向改變生物遺傳特征，創(chuàng)造出新型生物基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第8頁基因工程研究理論基礎(chǔ)科技探索之路早期基礎(chǔ)理論達(dá)爾文提出生物進(jìn)化論基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第9頁科技探索之路早期基礎(chǔ)理論孟德爾提出基因分離定律和自由組合定律基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第10頁科技探索之路早期基礎(chǔ)理論

摩爾根證實(shí)基因在染色體上，并提出基因連鎖交換定律?；蚬こ痰幕驹砗图夹g(shù)專家講座第11頁科技探索之路后期基礎(chǔ)理論

艾弗里證實(shí)DNA是遺傳物質(zhì)，DNA可從一個(gè)生物個(gè)體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)生物個(gè)體?；蚬こ痰幕驹砗图夹g(shù)專家講座第12頁科技探索之路后期基礎(chǔ)理論

沃森、克里克提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型?；蚬こ痰幕驹砗图夹g(shù)專家講座第13頁基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論梅塞爾松、斯塔爾證實(shí)DNA半保留復(fù)制基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第14頁科技探索之路后期基礎(chǔ)理論克里克等提出中心法則DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第15頁科技探索之路后期基礎(chǔ)理論

1963年尼倫伯格和馬太破譯編碼氨基酸遺傳密碼，1966年霍拉納用試驗(yàn)加以證實(shí)?；蚬こ痰幕驹砗图夹g(shù)專家講座第16頁基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程

DNA是遺傳物質(zhì)證實(shí)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和中心法則確實(shí)立遺傳密碼破譯（遺傳密碼通用性）基因運(yùn)載體發(fā)覺工具酶創(chuàng)造DNA合成和測序技術(shù)創(chuàng)造DNA體外重組實(shí)現(xiàn)重組DNA表示試驗(yàn)成功第一例轉(zhuǎn)基因動(dòng)物問世PCR技術(shù)創(chuàng)造基礎(chǔ)理論技術(shù)創(chuàng)造基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第17頁問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一個(gè)能夠合成毒蛋白基因。讓細(xì)菌毒蛋白基因在棉花細(xì)胞中表示，培育出抵抗棉鈴蟲害抗蟲棉。

想一想需要做哪些關(guān)鍵工作？蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲棉基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第18頁基因工程培育抗蟲棉關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因進(jìn)入棉花細(xì)胞基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第19頁處理培育抗蟲棉關(guān)鍵步驟需要哪些工具？“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因進(jìn)入棉花細(xì)胞“分子縫紉針”——DNA連接酶“分子運(yùn)輸車”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞載體基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第20頁DNA重組技術(shù)基本工具

限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”

DNA連接酶——“分子縫紉針”

基因進(jìn)入受體細(xì)胞載體——“分子運(yùn)輸車”

基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第21頁一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”1、主要起源：2、特點(diǎn)：3、作用：

識(shí)別雙鏈DNA分子某種特定核苷酸序列（不一樣限制酶能識(shí)別不一樣特點(diǎn)核苷酸序列），而且以不一樣方式在兩個(gè)特殊堿基之間切斷DNA雙鏈。主要從微生物中分離純化使每條鏈中特定部位兩個(gè)核苷酸之間磷酸二酯鍵斷開基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第22頁磷酸二酯鍵T12345A12345HHHHHOT12345A12345HHHHOH2O+基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第23頁O基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第24頁4、限制酶識(shí)別序列Goon大多數(shù)限制酶識(shí)別序列由6個(gè)核苷酸組成少數(shù)識(shí)別序列由4、5或8個(gè)核苷酸組成基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第25頁限制酶識(shí)別序列：Goback基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第26頁

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第27頁

EcoRⅠ黏性末端黏性末端重復(fù)演示Goback基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第28頁什么叫黏性末端？被限制酶切開DNA兩條單鏈切口，帶有幾個(gè)伸出核苷酸，它們之間恰好互補(bǔ)配對，這么切口叫黏性末端。基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第29頁SmaⅠ平末端平末端基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第30頁限制酶DNA解旋酶區(qū)分限制性內(nèi)切酶與DNA解旋酶區(qū)分切割特定核苷酸序列磷酸二酯鍵將DNA兩條鏈氫鍵打開形成兩條單鏈限制酶DNA水解酶區(qū)分限制性內(nèi)切酶與DNA水解酶區(qū)分切割特定核苷酸序列磷酸二酯鍵，形成片段DNA.切割磷酸二酯鍵，形成單個(gè)脫氧核苷酸。Goback基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第31頁要想取得某個(gè)特定性狀基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性(平)末端？要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性(平)末端。假如把兩種起源不一樣DNA用同一個(gè)限制酶來切割，會(huì)怎樣呢？會(huì)產(chǎn)生相同黏性(平)末端，然后讓二者黏性(平)末端黏合起來，就似乎能夠合成重組DNA分子了。思索?基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第32頁……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不一樣起源DNA片段混合將不一樣種起源DNA片段連接起來生物A基因片段生物B基因片段……GAATTC…………CTTAAG……酶切……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……同一個(gè)基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第33頁可把黏性末端之間縫隙“縫合”起來，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復(fù)被限制酶切開兩個(gè)核苷酸之間磷酸二酯鍵基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第34頁二、“分子縫合針”——DNA連接酶①作用:恢復(fù)被限制酶切開兩個(gè)核苷酸之間磷酸二酯鍵②作用原理：催化磷酸二酯鍵形成基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第35頁DNA連接酶——“分子縫紉針”連接酶有兩種：一個(gè)是從大腸桿菌中分離得到，稱之為E·coli連接酶。另一個(gè)是從T4噬菌體中分離得到，稱為T4連接酶。這兩種連接酶催化反應(yīng)基本相同，都是連接雙鏈DNA缺口，而不能連接單鏈DNA。E·coli連接酶只能連接黏性末端；T4連接酶既可“縫合”黏性末端，又可“縫合”平末端?；蚬こ痰幕驹砗图夹g(shù)專家講座第36頁

T4DNA連接酶還可把平末端之間縫隙“縫合”起來，但效率較低T4DNA連接酶基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第37頁③類型：類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶起源功效大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點(diǎn)差異基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第38頁DNA聚合酶DNA連接酶區(qū)分1區(qū)分2相同點(diǎn)尋根問底DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為何?1)只能將單個(gè)核苷酸連接到已經(jīng)有核酸片段上，形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵1)在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵2)以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸經(jīng)過磷酸二酯鍵連接成一條互補(bǔ)DNA鏈2)將DNA雙鏈上兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來，不需要模板基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第39頁外源基因(如抗蟲基因)怎樣才能導(dǎo)入受體細(xì)胞(如棉花細(xì)胞)？導(dǎo)入過程需要運(yùn)輸工具——運(yùn)載體?；蚬こ痰幕驹砗图夹g(shù)專家講座第40頁三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞運(yùn)載體——”分子運(yùn)輸車”運(yùn)載體作用有哪些？作用一：作為運(yùn)載工具，將外源基因(抗蟲基因)轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞(棉花細(xì)胞)中去。作用二：利用運(yùn)載體在受體細(xì)胞(棉花細(xì)胞)內(nèi)，對外源基因(抗蟲基因)進(jìn)行大量復(fù)制?；蚬こ痰幕驹砗图夹g(shù)專家講座第41頁三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞載體——“分子運(yùn)輸車”假如載體對受體細(xì)胞有害將怎樣？假如目標(biāo)基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制將怎樣？作為載體沒有切割位點(diǎn)將怎樣？目標(biāo)基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞，你怎樣覺察？基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第42頁作為運(yùn)載體必須具備哪些條件？1）能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保留。2）載體DNA必須有一個(gè)或多個(gè)限制酶切點(diǎn)，方便目標(biāo)基因插入到載體上去。3）含有一些標(biāo)識(shí)基因，便于進(jìn)行篩選。如抗菌素抗性基因、產(chǎn)物含有顏色反應(yīng)基因等。載體DNA必須是安全,不會(huì)對受體細(xì)胞有害,或不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外其它生物細(xì)胞中去;5)載體DNA分子大小應(yīng)適合,方便提取和在體外進(jìn)行操作,太大就不便操作.基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第43頁慣用運(yùn)載體主要有兩類：1）細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)質(zhì)粒2）噬菌體或一些動(dòng)植物病毒基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第44頁慣用載體：質(zhì)粒能復(fù)制并帶著插入目標(biāo)基因一起復(fù)制有切割位點(diǎn)有標(biāo)識(shí)基因存在，可用含氨芐青霉素培養(yǎng)基判別基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第45頁1.在基因工程中，切割運(yùn)載體和含有目標(biāo)基因DNA片段，需使用（）同種限制酶B.兩種限制酶同種連接酶D.兩種連接酶A課堂練習(xí)基因工程的基本原理和技術(shù)專家講座第46頁2.不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體理由是A、能復(fù)制