2.2.2動物細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修33

第2章

細(xì)胞工程第2節(jié)

動物細(xì)胞工程第2課時(shí)

動物細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體植物體細(xì)胞雜交植物細(xì)胞融合植物組織培養(yǎng)溫故知新：植物體細(xì)胞雜交技術(shù)打破生殖隔離，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙，培育出新的作物類型。實(shí)例：1970年，人—鼠細(xì)胞熒光標(biāo)記融合實(shí)驗(yàn)人細(xì)胞鼠細(xì)胞紅色熒光染料標(biāo)記的膜蛋白綠色熒光染料標(biāo)記的膜蛋白細(xì)胞融合人鼠雜交細(xì)胞37°培養(yǎng)40min細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)表明：細(xì)胞膜具有流動性有沒有技術(shù)能讓不同種動物的體細(xì)胞雜交？思考：動物細(xì)胞進(jìn)行融合，與植物有哪些不同之處？無需去除細(xì)胞壁；全能性受限制，不能培育成新的動物個(gè)體。顯微鏡下的動物細(xì)胞融合動物細(xì)胞融合概念原理誘導(dǎo)方法使兩個(gè)或多個(gè)動物細(xì)胞結(jié)合形成一個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。細(xì)胞膜具有一定的流動性物理法：電融合法化學(xué)法：聚乙二醇（PEG)生物法：滅活病毒誘導(dǎo)法一、動物細(xì)胞融合技術(shù)動物細(xì)胞融合特有的誘導(dǎo)方法思考：滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合的原理是什么呢？滅活：是指用物理或化學(xué)手段使病毒或細(xì)菌失去感染能力，但并不破壞它們的抗原結(jié)構(gòu)。原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞相互凝集，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合。動物細(xì)胞融合完成的標(biāo)志動物細(xì)胞融合結(jié)果意義運(yùn)用形成具有原來兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的遺傳信息的雜交細(xì)胞突破了有性雜交方法的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能。第一第二第三為制造單克隆抗體開辟了新途徑。研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段。至今，種間、屬間、科間，甚至動物和植物之間的細(xì)胞融合都已獲得成功。一、動物細(xì)胞融合技術(shù)植物體細(xì)胞雜交動物細(xì)胞融合原理細(xì)胞融合前的處理方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法細(xì)胞融合成功的標(biāo)志主要用途意義細(xì)胞膜具有一定的流動性、植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞膜具有一定的流動性用果膠酶和纖維素酶去除細(xì)胞壁用胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞電融合法、離心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法再生出細(xì)胞壁細(xì)胞核的融合獲得完整的雜種植株主要用于制造單克隆抗體打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種，培育植物新品種突破了有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能植物體細(xì)胞雜交和動物細(xì)胞融合比較(1)與植物原生質(zhì)體融合相比，動物細(xì)胞融合特有的誘導(dǎo)因素有聚乙二醇(PEG)、滅活的病毒(

)(2)滅活的含義是用物理或化學(xué)手段使病毒或細(xì)菌失去感染能力，但并不破壞它們的抗原結(jié)構(gòu)(

)(3)二倍體動物細(xì)胞融合后的雜交細(xì)胞仍然是二倍體細(xì)胞(

)×√判斷下列正誤×二、單克隆抗體及其應(yīng)用病原體處理呈遞輔助性T細(xì)胞結(jié)合記憶B細(xì)胞漿細(xì)胞抗體第一信號分裂、分化

并分泌細(xì)胞因子分裂分化促進(jìn)產(chǎn)生分泌第二信號B細(xì)胞抗原呈遞細(xì)胞結(jié)合抗體與病原體結(jié)合后形成沉淀等，進(jìn)而被其他免疫細(xì)胞吞噬消化。攝取知識回顧：抗體的產(chǎn)生血清（抗體主要分布部位）傳統(tǒng)抗體制備方法:向動物體內(nèi)反復(fù)注射某種抗原，使動物產(chǎn)生抗體，然后從動物血清中分離所需抗體。缺陷：產(chǎn)量低、純度低，特異性差血清含量有限(一)傳統(tǒng)抗體制作方法及缺陷：二、單克隆抗體及其應(yīng)用抗體1抗體2抗體3抗體4…….動物體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體的種類超過百萬種抗原1抗原2抗原3抗原4B細(xì)胞1B細(xì)胞2B細(xì)胞3B細(xì)胞4…….每一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體刺激刺激刺激刺激(一)傳統(tǒng)抗體制作方法及缺陷：二、單克隆抗體及其應(yīng)用抗體1抗體2抗體3抗體4…….動物體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體的種類超過百萬種抗原1抗原2抗原3抗原4B細(xì)胞1B細(xì)胞2B細(xì)胞3B細(xì)胞4…….每一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體刺激刺激刺激刺激血清中獲取純度低特異性差需要得到若能得到大量的B細(xì)胞4就可以(一)傳統(tǒng)抗體制作方法及缺陷：問題:若我們只需要大量的抗體4有什么辦法嗎？二、單克隆抗體及其應(yīng)用（１）動物體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類多達(dá)百萬種；（２）每個(gè)B淋巴細(xì)胞（漿細(xì)胞）只分泌一種特異性的抗體?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)：遺憾：如何解決這一難題？二、單克隆抗體及其應(yīng)用如何獲得大量、單一的抗體？每一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體單一B淋巴細(xì)胞細(xì)胞群選擇克隆產(chǎn)生大量純度高特異性強(qiáng)的抗體B淋巴細(xì)胞不可能無限增殖一個(gè)極富創(chuàng)造力的方案：動物細(xì)胞融合雜交細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)單克隆抗體骨髓瘤細(xì)胞（癌細(xì)胞）能無限增殖一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體雜交瘤細(xì)胞既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生專一抗體1975年，米爾斯坦和柯勒1984年，諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)二、單克隆抗體及其應(yīng)用二、單克隆抗體及其應(yīng)用1.制備單克隆抗體的原理（1）每一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體，在體外培養(yǎng)條件下，不能無限增殖。（2）骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖，不能產(chǎn)生抗體。（3）通過動物細(xì)胞融合技術(shù)將兩種細(xì)胞融合，得到的融合細(xì)胞既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生專一抗體。骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖能產(chǎn)生抗體B淋巴細(xì)胞從患骨髓瘤的小鼠體內(nèi)取骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)多種已免疫B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)融合小鼠的脾臟中獲取注射特定的抗原,小鼠脾產(chǎn)生特定抗體的淋巴B細(xì)胞2.單克隆抗體的制備過程：B細(xì)胞1B細(xì)胞2B細(xì)胞3B細(xì)胞4B細(xì)胞2B細(xì)胞3B細(xì)胞4骨髓瘤細(xì)胞B細(xì)胞1雜交1雜交2雜交3雜交402雜交瘤細(xì)胞（多種）置于選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)第一次篩選融合的細(xì)胞B細(xì)胞自身融合未融合的B淋巴細(xì)胞B瘤骨髓瘤細(xì)胞自身融合未融合的骨髓瘤細(xì)胞2.單克隆抗體的制備過程B瘤B瘤第一次篩選：用特定的選擇培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基上，未融合的親本細(xì)胞和融合的具有同種核的細(xì)胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能生長?！镜谝淮魏Y選】獲得雜交瘤細(xì)胞①細(xì)胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基喋呤阻斷。②B淋巴細(xì)胞中有這兩種DNA的合成途徑，但不能分裂增殖。

③鼠骨髓瘤細(xì)胞中只有D途徑，沒有S途徑，但能不斷分裂增殖。篩選出雜交瘤細(xì)胞方法？培養(yǎng)基中加入氨基嘌呤（HAT選擇培養(yǎng)基）B淋巴細(xì)胞及同型融合細(xì)胞不能無限增殖，死亡骨髓瘤細(xì)胞及同型融合細(xì)胞不能無限增殖，死亡雜交瘤細(xì)胞能無限增殖，生長第二次篩選：得到能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞

克隆化培養(yǎng)2.單克隆抗體的制備過程第二次篩選：得到能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞

克隆化培養(yǎng)2.單克隆抗體的制備過程抗原4第二次篩選：得到能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞

抗體檢測2.單克隆抗體的制備過程抗體檢測呈陽性第二次篩選：得到能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞

抗體檢測2.單克隆抗體的制備過程第二次篩選獲得產(chǎn)生專一抗體的雜交瘤細(xì)胞使用96孔板培養(yǎng)和篩選雜交瘤細(xì)胞，每一個(gè)孔盡量只接種一個(gè)雜交瘤細(xì)胞，即將單個(gè)雜交瘤細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，通過克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，即可獲得大量能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞?？贵w檢測呈陽性的雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)單克隆抗體體內(nèi)或體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔2.單克隆抗體的制備過程腹內(nèi)培養(yǎng)相對于體外培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：不需要特定的培養(yǎng)基，不需要嚴(yán)格控制環(huán)境條件。單克隆抗體的制備過程單克隆抗體雜交細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞體外或體內(nèi)培養(yǎng)第一次篩選骨髓瘤細(xì)胞

誘導(dǎo)融合分泌特異抗體的雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞群提取已免疫的B淋巴細(xì)胞動物細(xì)胞融合技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)特異性強(qiáng)靈敏度高可大量制備注射抗原單克隆抗體的制備過程選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)第二次篩選克隆化培養(yǎng)抗體檢測既能大量繁殖又能產(chǎn)生專一抗體單克隆抗體的制備小結(jié)（1）該過程中應(yīng)用到的技術(shù)_______________________________________（2）原理_______________________________________（3）注射特定抗原的目的______________________________________________（4）誘導(dǎo)融合的方法______________________________________動物細(xì)胞特有的誘導(dǎo)融合方法為_______________________動物細(xì)胞融合、動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞膜具有一定的流動性、細(xì)胞增殖用特定的抗原對小鼠進(jìn)行免疫，并從該小鼠的脾中得到能產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法滅活病毒誘導(dǎo)法（5）第一次篩選的目的______________________

第一次如何篩選___________________________

篩選原理_________________________________________________________________________________篩選獲得雜交瘤細(xì)胞用特定的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選在選擇培養(yǎng)基上，未融合的親本細(xì)胞和融合的具有同種核的細(xì)胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能生長單克隆抗體的制備小結(jié)（6）雜交瘤細(xì)胞的特點(diǎn)__________________________________（7）第二次篩選的目的________________________________________________如何篩選___________________________________________________選擇抗體檢測呈___性的雜交瘤細(xì)胞，即_____________

_____________（8）抗體檢測原理_______________________________________獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測（進(jìn)行多次篩選）分泌的抗體能與特定的抗原結(jié)合抗原和抗體能夠特異性結(jié)合(分子水平的鑒定）既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體（9）如何獲取大量所需雜交瘤細(xì)胞__________________________________________（10）如何獲取單克隆抗體①體外培養(yǎng)___________________________②小鼠腹腔內(nèi)培養(yǎng)_________________________（11）單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)______________________________________________________________________________在體外條件下大規(guī)模培養(yǎng)（接種于培養(yǎng)液中）或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖從細(xì)胞培養(yǎng)液中獲取從小鼠腹水中獲取能準(zhǔn)確地識別抗原的細(xì)微差異，與特定抗原發(fā)生特異性結(jié)合，并且可以大量制備陽【資料1】用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的“早早孕診斷試劑盒”。在妊娠第8天就可以作出診斷，這比原來的診斷方法提前了10d左右，可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對胎兒造成不利影響。該方法檢測的準(zhǔn)確率在90%以上。具有準(zhǔn)確、高效、簡易、快速特點(diǎn)診斷優(yōu)點(diǎn)：3.單克隆抗體的應(yīng)用作為診斷試劑——最廣泛的應(yīng)用抗體藥物接頭ADC被細(xì)胞吞噬釋放藥物溶酶體裂解細(xì)胞凋亡【資料2】使用高效的細(xì)胞毒素類藥物進(jìn)行化療可以有效殺傷腫瘤細(xì)胞。但細(xì)胞毒素沒有特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)還會對健康細(xì)胞造成傷害，這限制了它在臨床上的應(yīng)用?？贵w-藥物偶聯(lián)物（antibody-drugconjugates,ADC）通過將細(xì)胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷。ADC通常由抗體、接頭和藥物(如細(xì)胞毒素)三部分組成，它的作用機(jī)制如下圖所示。3.單克隆抗體的應(yīng)用用于治療疾病和運(yùn)載藥物討論1：ADC的抗體和藥物各具有什么作用？抗體主要發(fā)揮靶向運(yùn)輸作用，即通過特異性結(jié)合靶細(xì)胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細(xì)胞；藥物發(fā)揮治療效應(yīng)，如殺傷靶細(xì)胞。二、單克隆抗體技術(shù)及其應(yīng)用3.單克隆抗體的應(yīng)用討論2：除了細(xì)胞毒素，還有哪些物質(zhì)理論上可以作為ADC偶聯(lián)的藥物？①

可以用放射性同位素標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行靶向放療；②

一些作用于細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物可以通過阻斷腫瘤細(xì)胞的信號通路來抑制其生長，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結(jié)合進(jìn)行治療。討論3：單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床應(yīng)用上各具有什么優(yōu)勢？①

單克隆抗體診斷試劑盒中的單克隆抗體只與特定的抗原反應(yīng)，因此檢測的特異性和靈敏度大大提高；生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞可以傳代培養(yǎng)、冷凍保存和復(fù)蘇利用，有利于控制產(chǎn)品的質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)診斷試劑盒；②

ADC能夠協(xié)同發(fā)揮抗體特異性識別的靶向作用和細(xì)胞毒素對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，因此它在臨床上具有靶點(diǎn)清楚、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)?？贵w藥物接頭ADC被