蘋果和梨果實(shí)球殼孢腐爛病菌檢疫鑒定方法

蘋果和梨果實(shí)球殼孢腐爛病菌檢疫鑒定方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了植物檢疫中蘋果和梨果實(shí)球殼孢腐爛病菌的檢疫整定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于來自蘋果和梨果實(shí)球殼孢腐爛病菌發(fā)生國家或地區(qū)相關(guān)寄主新鮮果實(shí)中的蘋果和梨果實(shí)球殼孢腐爛病菌的檢疫鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。SN/T2077進(jìn)出境蘋果檢疫規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。無論是無性繁殖或有性繁殖，結(jié)構(gòu)簡單的或復(fù)雜的真菌產(chǎn)孢機(jī)構(gòu)，統(tǒng)稱為子實(shí)體。分生孢子器sporudochidium半知菌球殼孢目真菌形成的一種子實(shí)體，球形或瓶形，產(chǎn)生分生孢子。半知菌的分生孢子著生在散生，束生的分生孢子?；蚍稚葑幼希蛑诜稚咦颖P或分生孢子器內(nèi)。分生孢子的形態(tài)變化很大，大致可分為7種類型。4方法原理4.1分類地位學(xué)名：SphaerupsispyriputrescensXiao蘋果和梨果實(shí)球殼孢腐爛病菌屬真菌界(Fungi),半知菌亞門(Deuteromyeotina),腔菌綱(Coelo4.2檢疲鑒定依據(jù)以病菌在寄主上的癥狀特點(diǎn)，病菌形態(tài)學(xué)特征及其培養(yǎng)特性、病菌種的特征以及基因組序列作為蘋果和梨果實(shí)球殼孢腐爛病菌的檢疫鑒定依據(jù)，必要時(shí)輔助進(jìn)行致病性測(cè)定(見附錄A.附錄B.附錄C、5設(shè)備及用具5.1儀器設(shè)備體視顯微鏡、生物顯微鏡、電子天平(感量0.01g)、高壓滅菌器、超凈工作臺(tái)、生物培養(yǎng)箱(帶熒光燈)、高速離心機(jī)、PCR僅、實(shí)時(shí)熒光PCR儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)。5.2實(shí)驗(yàn)用具杯(500mL)、量筒(500ml.)、三角瓶(250mL)、載玻片、蓋玻片、微量移液器(可調(diào)式范圍：2.5gL~1000pL)、移液器槍頭(10pL、100pl.,1000pL)。6試劑和培養(yǎng)基1%NaClO溶液，無水乙醇，70%乙醇，無菌雙蒸水，2%CTABDNA提取緩沖液、10%SDS溶液、3mol/L.醋酸的溶液、PCR試劑《包括Tag聚合酶、dNTP、緩沖液》、實(shí)時(shí)熒光PCR混合液、苯酚、三氯甲烷、異戊醇、Tris-HCl、EDTA、ITS引物，實(shí)時(shí)熒光PCR引物和探針、瓊脂糖，DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000Marker),0.5×TBE電泳緩沖液。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)(見附錄A)。7標(biāo)準(zhǔn)菌株SphaeropsispyripntrescensXiao&.J.D.Reg口岸查驗(yàn)進(jìn)境水果時(shí)，按SN/T2077對(duì)來自疫區(qū)的蘋果和梨果實(shí)球殼孢腐爛病菌寄主的新鮮果實(shí)進(jìn)行抽樣與取樣。9檢驗(yàn)方法9.1現(xiàn)場檢驗(yàn)將有明顯病癥病果置于體視顯微鏡下檢查，或直接挑取病部病原體制成玻片，置于生物顯微鏡下檢查，觀察記錄有無病菌的分生孢子座、分生孢子器以及分生孢子的形態(tài)特征和著生方式，并測(cè)量其大小。9.2實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)9.2.1顯微鏡檢將有明顯病癥病果置于體視顯微鏡下檢查，或直接挑取病部病原體制成玻片，置于生物顯微鏡下檢查，觀察記錄有無病菌的分生孢子座，分生孢子器以及分生孢子的形態(tài)特征和著生方式，并測(cè)量其大小。9.2.2保濕培養(yǎng)如病果上只有可疑病狀面無明顯病癥，則將病果置于樣品袋中，于20℃~25℃下保濕培養(yǎng).定期觀察癥狀的變化，并進(jìn)行顯微鏡檢或分離培養(yǎng)。9.2.3分離培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)觀察取可疑病果用70%的乙醇表面消毒，超凈工作臺(tái)上自然干燥，取病健交界的組織數(shù)塊(大小約5mm×5mm>.置于PDA平板上，于20℃~25℃黑暗下近紫外燈下培養(yǎng).待菌落出現(xiàn)后觀察菌落的形態(tài)、顏色，大小及子實(shí)體等培養(yǎng)性狀，顯微鏡檢分生孢子的形態(tài)特征。9.2.4病原菌致病性測(cè)定(必要時(shí)做)將Sphaeropxispyriputrescens在PDA培養(yǎng)基上交替培養(yǎng)(12h光照/12h黑暗)3周，誘導(dǎo)產(chǎn)生分生泡子，用無菌水配制孢子懸浮液，濃度為1×101個(gè)孢子/ml。取采收前2周～4周沒有接觸過殺菌劑的富士蘋果進(jìn)行致病性測(cè)定。果實(shí)用0.5%NaClO溶液表面消毒5min.無菌水漂洗3次，無菌條件下干燥后，用直徑為4mm的針頭，扎入果實(shí)內(nèi)形成深4mm的傷口，注入20μL孢子懸浮液進(jìn)行接種，以接種無菌水作為對(duì)照。接種果實(shí)用網(wǎng)套包裹放于紙箱中，用纖維板隔開，0℃下保存，一般6周~8周可以觀察到接種Sphaeropsispyripatrescens的果實(shí)呈現(xiàn)腐爛癥狀。梨果實(shí)蒂部和萼端致病性測(cè)定，用無菌解剖刀在果實(shí)的蒂部平切造成1cm傷口，用無菌紗布(2cm×2cm)蘸下孢子懸浮液，覆蓋傷口接種，以范有無菌水的紗布包裹的傷口作為對(duì)照。接種水果放在鋁盤上，再將盤子置于有水的密閉容器中(20℃~22℃)過夜。然后去掉接種紗布，將果實(shí)放于紙箱上，用纖維板隔開，0℃下保存，一般2個(gè)~3個(gè)月后接種病菌果實(shí)呈現(xiàn)腐爛癥狀。每個(gè)菌株接種不少于5個(gè)。定期觀察接種果實(shí)的發(fā)病情況，發(fā)病后按照前述9.2.3方法分離病菌，對(duì)柯赫法則驗(yàn)證的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。9.2.5分子生物學(xué)鑒定CTAB法：參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)》;或參照公司真菌DNA提取試劑盒，見附錄B。對(duì)提取的DNA,用設(shè)計(jì)的通用引物擴(kuò)增ITS區(qū)域，PCR產(chǎn)物純化后調(diào)序，BLAST比對(duì)分析，見附錄C。9.2.5.3實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)對(duì)提取的DNA,用設(shè)計(jì)的特異性引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系和條件見附錄D,10.1癥狀特征果實(shí)蒂部和萼部腐爛是蘋果和梨果實(shí)球殼孢腐爛病主要癥狀。發(fā)病組織表面褐色，隨著病情的發(fā)展，病庭表面形成黑色的分生孢子器，分生孢子器分布于果皮的表面或者半埋生于組織內(nèi)。發(fā)病組織表皮褐色或深褐色，果肉褐色，隨時(shí)間延長病部顏色加深。切開病果散發(fā)類似“繃帶”一樣的氣味。10.2病菌培養(yǎng)特征分離物菌落在20℃黑暗下培養(yǎng)初期為液密，無色，7d~14d后，菌絲逐漸變?yōu)辄S色，菌落中有黃色素沉積是識(shí)別該菌的主要特征。轉(zhuǎn)入12h光照/12h黑暗的交替培養(yǎng)，3周后可于菌落上形成黑色的子座。10.3分生孢子形態(tài)特征分生孢子褐色，單孢，一端膨大，末端扁平，分生孢子大小(14μm～17μm)×(8ym~10gm)。10.4致病性結(jié)果(必要時(shí)采用致病性測(cè)定)接種果實(shí)應(yīng)呈現(xiàn)典型的蘋果和梨果實(shí)球殼孢腐爛病的典型癥狀，經(jīng)病原菌再分離獲得的純菌株應(yīng)具有與原菌株保持一致的病原特征，對(duì)照不出現(xiàn)蘋果和梨果實(shí)球殼孢腐爛病癥狀。10.5病菌ITS序列分析經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的片斷大小大約600bp。測(cè)序后進(jìn)行BLAST比對(duì)，序列與GenBank中已知的蘋果和梨果實(shí)球殼孢腐爛病菌同源性為100%。10.6實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)后，看有無Ct值。在常規(guī)的生物學(xué)方法檢測(cè)中.若發(fā)現(xiàn)癥狀，病原特征及致病性測(cè)定(必要時(shí)采用)與第10章描述特征相吻合，則判定檢出果實(shí)和梨球殼孢腐爛病菌。在分子生物學(xué)方法檢測(cè)中，如果待測(cè)樣品的序列與GenBank中已知的蘋果和梨果實(shí)球殼孢腐爛病菌同源性為100%或待測(cè)樣品的Ct值小于或等于35時(shí)，如果癥狀或者病原菌培養(yǎng)性狀與第10章鑒定特征吻合的，則判定檢出蘋果和梨果實(shí)球殼孢腐爛病菌。12樣品和資料的保存12.1菌種和DNA樣品的保藏蘋果和梨果實(shí)球殼孢腐爛病菌純分離物要標(biāo)注菌株來源、寄主、分離時(shí)間、鑒定人；南株在含20%甘油的凍存管中于一80℃保存，或?qū)⒕贽D(zhuǎn)接在PDA斜面上培養(yǎng)，待菌絲體張滿斜面后，置于4℃下保存，并定期(180d)轉(zhuǎn)管。病菌基因組DNA樣品于-20℃下保存。保存期滿后，需經(jīng)滅菌處理12.2檢驗(yàn)資料的保存妥善保存檢驗(yàn)資料，以備復(fù)驗(yàn)、談判和仲裁。檢驗(yàn)報(bào)告應(yīng)注明檢驗(yàn)日期、方法、結(jié)果等，并有檢驗(yàn)人2%CTAB,2%PVP,1,4mol/I.NaCl,100mmol/L.TrisHCl(pH8,0),25mmol/I.EDTA(規(guī)范性附錄)真菌DNA提取方法真菌DNA的提取采用CTAB方法，具體步驟如下：a)稱取0.2g菌絲，在液氮中研磨成粉末：b)轉(zhuǎn)入1mL.65℃預(yù)熱的抽提緩沖液(CTAB)中，顏例混勻，65℃溫育5min,中間混勻兩次：c)加入等體積三氯甲烷/苯酚(1/1)混勻，12000r/min離心15min,取上清液，等體積三氯甲烷/苯酚再抽提一次；d)上清液加入1/10體積3mol/L.醋酸鈉溶液輕輕混勻，再加入2倍體積冷凍無水乙醇于-20℃沉淀30mim,12000r/min離心10min;e)沉淀用70%乙醇洗兩遍，置于37℃溫箱干燥后，用TE溶解，1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)，-20℃保存。10×PCR緩沖液(含MgCl?)5dNTP(每2.5mmol/L.)422195*-CCCACCCTCTGTCTACAGTAa'-GAACCAAGAGATOCGTTGTTGA5-FAM-ACTCAGAOGACACTGATGATATGGGTTT-T111[1]XisoCL,RogersJD.2004.Apostharvestfruitrotind"Anjoupearscausecenssanov.PlantDis88:114-118.[2]RogersJD.BoalRI.2004.FirstreportofanewpostharvestfruitrSphaeropsispyriputrescens.PlantDis88;223.[3]SwartWJ,WingfieldMJ,PalmerMA,BlanchetteisolatesofSphaeropsissapinea.Phytopathology81:489-493.[4]MeheriukM.1993.CAstorageconditiensfortheSixthInternationalControlledAtmosphe