青椒中轉(zhuǎn)基因成分定性PCR檢測方法

本標(biāo)準(zhǔn)由國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督委員會提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位；中華人民共和國山東出入境檢驗檢疫局。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人；高宏偉、梁成珠，劉心同、王巖、于立欣、曹患雷。本標(biāo)準(zhǔn)系首次發(fā)布的出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。青椒中轉(zhuǎn)基因成分定性PCR檢測方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了轉(zhuǎn)基因青椒中外源基因CaMV35S、NPTⅡ、NOS,CMV定性PCR檢測方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于對青椒樣品的轉(zhuǎn)基因篩選檢測，適用于抗黃瓜花葉病毒轉(zhuǎn)基因青椒的鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。SN/T1193基因檢驗實驗室技術(shù)要求SN/T1204植物及其加工品中轉(zhuǎn)基因成分實時熒光PCR檢測方法3術(shù)語，定義和縮略語下列術(shù)語、定義和縮略語適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1術(shù)語和定義轉(zhuǎn)基因transgene將本物種不具有的，來源于其他物種的功能DNA序列，通過各種導(dǎo)入手段，使其在該物種中進(jìn)行表達(dá)，以便使該物種獲得新的品種特征。聚合酶鏈反應(yīng)polymerasechainreaction,PCR模板基因序列先經(jīng)過高溫變性成為單鏈，在DNA聚合酶作用和適宜的反應(yīng)條件下，根據(jù)模板序列設(shè)計的兩條引物分別于模板DNA兩條鏈上的一段互補(bǔ)序列發(fā)生退火而相互結(jié)合，接著在DNA聚合酶的催化下以四種脫氧核糖核苷酸(dNTP)為底物，使引物得以延伸，然后不斷重復(fù)變性，退火和廷伸這一循環(huán)，使欲擴(kuò)增的基因片段呈幾何倍數(shù)擴(kuò)增。rheL.ribulosebisphosphatecarboxylase/osygenaseLargesu核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基基因，由植物葉綠體基因組編碼?；ㄒ嘶ㄈ~病毒35S啟動子。NPTImeomycinphosphotra新霉素-3*-磷酸轉(zhuǎn)移酶。NOSnopalinesynthaseterminator胭脂堿合成醇3’轉(zhuǎn)錄終止子。2CMVcucumbermosaievir黃瓜花葉病毒。樣品經(jīng)過提取DNA后，針對轉(zhuǎn)基因植物所插人的外源基因的基因序列設(shè)計引物，通過PCR技術(shù)，特異性擴(kuò)增外源基因的DNA片段，根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果，判斷該樣品中是否含有該轉(zhuǎn)基因成分。檢測先對提取的DNA進(jìn)行內(nèi)對照的擴(kuò)增，擴(kuò)出相應(yīng)的內(nèi)對照條帶后可以進(jìn)行篩選基因的檢測，如果篩選基因為陽性，再進(jìn)行鑒定基因的檢測。如果篩選基因為陰性則直接報告結(jié)果。檢測過程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193中的規(guī)定執(zhí)行。按照表1中提供的引物序列合成引物，加入無離子水配成100pmol/pL.貯存，配成直接用于PCR反應(yīng)的10pmol/pL.的工作液。表1轉(zhuǎn)基因青椒PCR檢測用的引物序列及PCR產(chǎn)物的大小TagDNA聚合酶，瓊脂糖(電泳純)溴化乙錠，三氯甲烷，異丙醇，70%乙醇，分子量標(biāo)準(zhǔn)(100bp~TE緩沖液：10mmol/LTrisHCl(pH8.0),10×PCR緩沖液：100mmol/1.氯化鉀，160mmol/L(Mg5O?),200mL.加蒸餾水至1000mL;使用時10倍稀釋。溴化乙錠貯存液；用雙燕水配制成10mg/mL.。CTAB提取緩沖液：1%CTAB,0.05mol/LTris-HCl(pH8.0)0.01mol/L.EDTA(pH8.0)。固體粉碎機(jī)或研體，高速冷凍離心機(jī)，臺式小型離心機(jī)，Mini個人離心機(jī)，天平(感量0.001g)旋渦4XdNTP(2.5mmol/L,含dUTP)物1(10pmol/pL}TugDNA聚合酶(5U/pL)UNG酶(1U/eL)氧化鎂(MgCl?)(25mmol/L)使反應(yīng)體積達(dá)到25μl.稱取2.0g瓊脂糖，于100mL電泳緩沖液(0.5×TBE)中，用微波爐加熱溶解瓊脂糖，冷卻至55℃~60℃左右加入溴化乙錠(EB)至終濃度為0.5pg/mL,制膠。在電泳槽中加入電泳緩沖液(0,5×TBE),使液而剛剛沒過凝膠。將8μL～10pL.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和2pL.加樣緩沖液混合，點樣。每行膠孔中選一個膠孔，在其中加入DNA分子量標(biāo)記以判斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小。電壓大小一般控制在3V/cm~5V/em,電泳時間約35mim,或者根據(jù)溴酚藍(lán)的移動位置來確定，電泳結(jié)果用凝膠成像儀記錄并保存。8結(jié)果判定8.1判斷提取的DNA質(zhì)量使用內(nèi)參照引物rbel.擴(kuò)增樣品的DNA,如果陰性對照、樣品和陽性對照的PCR產(chǎn)物都出現(xiàn)433bp的條帶，則表明提取的樣品DNA符合PCR反應(yīng)的要求，可以用于外源基因檢測；否則不能用于檢測外源基因，應(yīng)該重新提取樣品DNA。8.2篩選基因的判定使用篩選基因的引物CaMV35S,NOS,NPTⅡ?qū)悠稤NA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果陰性對照和空白對照未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，陽性對照和待測樣品均出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，則可以初步判斷該樣品含有外源基因，應(yīng)該進(jìn)一步進(jìn)行確證實驗，依照確證實驗的結(jié)果最終報告。如果陰性對照和樣品都未出現(xiàn)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，而陽性樣品出現(xiàn)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，則可以判斷待測樣品中不含有該外源基因。8.3鑒定基因判定對于青椒中轉(zhuǎn)基因成分的檢測，先檢測CaMV35S,NOS,NPTⅡ基因。如果檢測結(jié)果陰性則報告結(jié)果。如果檢測結(jié)果陽性，則進(jìn)行鑒定檢測CMV基因，以確定轉(zhuǎn)基因青椒