水稻條紋病毒、水稻矮縮病毒、水稻黑條矮縮病毒的檢測方法 普通RT-PCR方法和實時熒光RT-PCR方法

中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)水稻條紋病毒、水稻矮縮病毒、水稻黑條矮縮病毒的檢測方法Detectionofricestripevirus,rConventionalRT-PCRandr2005-09-30發(fā)布2005-09-30發(fā)布中，華人民共、和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局水稻條紋病毒、水稻矮縮病毒、水稻黑條矮縮病毒的檢測方法普通RT-PCR方法和實時熒光RT-PCR方法逆轉(zhuǎn)錄-聚合南鏈?zhǔn)椒磻?yīng)reversetranseriptionpolymerasechalnreaction,RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，簡稱RT-PCR,以提取組織或其他材料中的RNA為模板，采用Oligo(dT)或隨機引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶和適宜的反應(yīng)條件下，RNA被道轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后再以cDNA作為模實時熒光PCRreal-timefluoescencePCR,RTF-PCR實時熒光PCR方法是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，在引物對所擴增序列段中，加入一條特異性的寡核苷酸熒光探針，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5*-3'外切降活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子游離產(chǎn)生熒光信號，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。4檢測方法4.1方法原理水稻條紋病毒、水稻矮縮病毒和水稻黑條矮縮病毒都是RNA病毒。如果樣品材料中提取的總RNA中含有水稻病毒的RNA,可通過逆轉(zhuǎn)錄酶將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再通過根據(jù)病毒核酸保守序列設(shè)計的引物對cDNA進行PCR擴增。分析PCR結(jié)果即可明確材料中是否含有病毒核酸成分。采用實時熒光定量PCR,可減少檢測過程的污染風(fēng)險，同時利用熒光雜交探針對所擴增的核酸片段進行驗證。4.2試劑和溶液除特別規(guī)定外，所用試劑均為分析純，實驗用水為GB/T6682規(guī)定的一級水。4.2.1TrizolRNA提取試劑或RNA抽提試劑盒。4.2.3三氯甲烷。4.2.4異丙醇。4.2.6無水乙醇。4.2.7無RNase水；經(jīng)DEPC(焦碳酸二乙脂)處理的雙燕水或商品無Rnase水。4.2.9硫酸鎂(MgSO)25mmol/L.4.2.11逆轉(zhuǎn)錄酶：5U/pL,(反應(yīng)溫度和使用濃度按商品提供的使用要求進行)。4.2.13澳化乙錠；10mg/mL。4.2.14DNA分子量標(biāo)記；100bp~2000bp。4.2.15瓊脂糖。4.2.160.5mol/LEDTA,pH8.0;在800mL水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二鈉(Na-EDTA·2H?O),在磁力攪拌器劇烈攪拌，調(diào)節(jié)pH至8.0,然后加水定容至1000mL,分裝后高壓滅菌備用。4.2.17TE緩沖液，pH8.0?量(pH8,0),加水定容至1000mL,分裝后高壓滅菌備用。4.2.1850×TAE緩沖液：稱取242gTris,量取47.1mL冰醋酸，100mL.0.5mol/LEDTA(pH8.0),溶于蒸餾水中，定容至1000mL。分裝后高壓滅菌備用；34.2.19上樣緩沖液；含0.25%溴酚藍、0.25%二甲苯青FF,30%甘油水溶液。4.2.20RNasin(40U/pL)。4.2.21引物和探針：普通RT-PCR檢測病毒的引物見表1,實時熒光RT-PCR檢測病毒的引物見表1普通RT-PCR檢測的引物RSV1:5'-GTCTTCACTTTCCCATTGGTGARSV2:S'-TCTGGTGTTAAGATGGCTGTGGRDV1;5*-GCAACGACAGCTAGCGTTGTRDV2:5'-GAGGTTGCGTGACGAAGCCRBDVI.S'-GAGCTCTTCTAGTCATCGRBDV2:5'-GTGTCACACCACTCTTCT表2實時熒光RT-PCR檢測的引物和探針RSVI:5'-GCTGATGAAGATCCTTGCTGRSVr5'-CCTCGAAGAATTCCTTCACCAA-3’RSVBH;5'-FAM-CACTTCAAAGACAGCAACAGAAGTCAGCGG-BRDVf:5'-TGGTGCGCATACGTGTGTRDVr:S°-TCCTCCACGOCTACCCCTRDVBH;5'-FAM-CGCGGAGGCTGGGTCAACCA-BHQ-3’RBDVf?5'-GTGACATTTTGGCAACTGTGAGA-3”KBDVr:5*-TTCAGAACGGCTCTTCCATTRHDVBH:S'-FAM-AAGACTTGCCGCTTTCTGGACA-B4.3儀器和材料4.3.2實時熒光PCR儀。4.3.4凝膠分析成像系統(tǒng)。4.3.5冷凍離心機。4.3.6-20℃低溫冰箱和—80℃起低溫冰箱。4.3.7高壓滅菌鍋。4.3.8微波爐。4.3.9水浴箱。4.3.10制冰機。4.3.11磁力攪拌器。4.3.14PCR反應(yīng)管：200pL.,5004.3.15無RNaseEppendorf離心管4.4樣品處理所取的樣品應(yīng)及時進行檢測或放在低溫冰箱中保存。取1g有代表性的植物組織，放入潔凈的研缽中，加入液氮后迅速研磨成細粉狀。昆蟲樣品取0.1g～0,5g有代表性的樣品用液氮迅速研磨成細4粉狀。研磨樣品應(yīng)隨即進行RNA提取，否則放入超低溫冰箱保存。樣品處理和檢測操作需在符合SN/T1193要求的實驗室內(nèi)進行。4.5RNA的提取和純化4.5.1取4,4的研磨物0.1g至1,5mL.Eppendorf離心管中，加入1ml.Trizol,震蕩混合，室溫放置4.5.2加入0.2mL三氯甲烷，震蕩混勻15min(禁用漩渦振蕩),室溫放置15min。4.5.31.2×10*g,2℃~8℃離心15min。4.5.4將上清液移至另一1.5mL.Eppendorf離心管中，加入等體積(約0.5mL)預(yù)冷的異丙醇，室濕放置10min。1.2×10*g,2℃~8℃離心10min。4.5.5小心弈去上清液，加入1mL預(yù)冷75%乙醇，來回顛倒洗滌沉淀，8×102g,2℃~8℃離心4.5.6小心棄去上清液，沉淀室溫放置5min～10min自然晾干，重懸于30pL無RNase的水中，輕彈管壁使之溶解。在2h內(nèi)進行RT-PCR反應(yīng)。4.6逆轉(zhuǎn)錄在25pl.反應(yīng)體系中，添加以下反應(yīng)成分至相應(yīng)濃度：1×RT緩沖液；200μmol/LdNTPs;氯化鎂(MgCl?)1.5mmol/L;逆轉(zhuǎn)錄引物采用表1所列的相應(yīng)下游擴增引物，加至1.5pmol/L。加4pL樣品RNA,98℃變性2min后迅速移至冰上驟冷3min,再加入200UM-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和0.5pLRNasin(40U/pL);補水至25pL。37℃(不同的逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)品接所規(guī)定的溫度條件進行操作),1h,95℃,5min,完成道轉(zhuǎn)錄過程。也可采用一步法，在一個反應(yīng)體系完成逆轉(zhuǎn)錄和PCR。檢測水稻條紋病毒，水稻矮縮病毒，水稻黑條矮縮病毒的普通RT-PCR反應(yīng)體系見表3。每個反應(yīng)體系設(shè)置兩個平行反應(yīng)。反應(yīng)體系中各試劑的量可根據(jù)具體情況或不同的反應(yīng)總體積進行適當(dāng)調(diào)整。也可采用商業(yè)RT-PCR一步法或兩步法試劑盒。檢測時以含病毒材料或含有病毒目標(biāo)片段的質(zhì)粒作為陽性對照，以未含病毒的植物組織RNA作為陰性對照，以水代替模板作為空白對照。RT-PCR緩沖液(含MgCl,3mmol/L)21一一1 4水取4pL.樣品提取的總RNA,加上游引物和下游引物(20pmol/L)各0.5pL,加去離子水45pL。95℃變性10min,迅速移至冰上驟冷5min。加人RT-PCRbeads,使其溶解，也可照表3反應(yīng)體系進行42℃,30min反轉(zhuǎn)錄，95℃,10min滅活反轉(zhuǎn)錄降。95℃、1min;53℃,1min;72℃,!min;35個循環(huán)，72℃延伸10min,進行PCR擴增。4.8PCR產(chǎn)物的瓊脂精凝膠電沫檢測制備2%的瓊脂糖凝膠，按比例混勻電泳上樣緩沖液(LoadingBuffer)和PCR擴增產(chǎn)物，然后將混有上樣緩沖液的PCR擴增產(chǎn)物加入樣品孔中，并用100bpLadderDNAMarker作分子量標(biāo)記，進行電5泳分析。電泳結(jié)束后，在凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴增出預(yù)期的特異性DNA電泳帶，拍攝并記錄。4.9實時熒光RT-PCR檢測實時熒光RT-PCR反應(yīng)體系見表4。每個反應(yīng)體系設(shè)置兩個平行反應(yīng)。反應(yīng)體系中各試劑的量可根據(jù)具體情況或不同的反應(yīng)總體積進行適當(dāng)調(diào)整，也可采用商業(yè)RT-PCR一步法或兩步法試劑盒。以病毒材料或含有病毒目標(biāo)片段的質(zhì)粒作為陽性對照，以未含病毒的植物材料作為陰性對照，以水代替模板作為空白對照。按表4設(shè)定樣品和對照，設(shè)置實時熒光RT-PCR反應(yīng)參數(shù)，反應(yīng)條件為：95℃,2min;94℃,10s;52℃,20s;72℃、30s;5個循環(huán)；94℃,5s;55℃,31s(收集熒光信號),40個循環(huán)。反應(yīng)完成后，分析反應(yīng)結(jié)果。525mmol/1.522215本一 一一5結(jié)果判定及表述5.1結(jié)果判定對待測樣品進行RT-PCR檢測，如果陰性對照和空白對照正確，待測樣品出現(xiàn)與陽性對照一致的所測病毒的擴增條帶，判定結(jié)果為陽性。對陽性樣品的PCR產(chǎn)物應(yīng)進行實時熒光RT-PCR檢測或進行序列分析，其結(jié)果證實與所檢測的水稻病毒一致，則可判定樣品中含有所檢測的水稻病毒。陽性對照，陰性對照和空白對照正確，且樣品無擴增條帶，判定結(jié)果為陰性，5.1.2實時熒光RT-PCR待測