鴨病毒性肝炎Ⅰ型病毒血清中和試驗(yàn)

中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)鴨病毒性肝炎I型病毒血清中和試驗(yàn)Serumneutralizationt2004-06-01發(fā)布中、華人民共、和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局鴨病毒性肝炎I型病毒血清中和試驗(yàn)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鴨病毒性肝炎I型病毒血清中和試驗(yàn)操作方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于檢測血清中的鴨病毒性肝炎I型病毒抗體。主要用于鴨病毒性肝炎的診斷及病原鑒定、免疫水平的監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查。下列縮略語適用于本標(biāo)準(zhǔn)。BME:Eagle'sBasalMedium細(xì)胞基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基。CPE:細(xì)胞病變。DEK:鴨胚腎細(xì)胞。DEL;鴨胚肝細(xì)胞。DHV-I;鴨病毒性肝炎I型病毒。FCS;胎牛血清。MEM,Eagle'sMinimalEssentialMedium組胞培養(yǎng)基。PFU?空斑形成單位。TCID:半數(shù)組胞培養(yǎng)感染量。病毒感染敏感的細(xì)胞單層后，可以在細(xì)胞單層上生長增殖，并能產(chǎn)生CPE,使感染細(xì)胞圓縮、壞死并形成空班，血清中的特異性抗體能夠抑制病毒在細(xì)胞單層上生長，血清抗體中和病毒的能力可以通過其阻止CPE產(chǎn)生的程度加以測定。本中和試驗(yàn)是應(yīng)用固定病毒量雅釋血清的方法，在DEL或DEK細(xì)胞單層上進(jìn)行中和試驗(yàn)，用于鴨血清抗體的測定或病原的鑒定。4儀器設(shè)備4.1高壓蒸氣滅菌器。4.2可調(diào)移液器。4.3二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱。4.4倒置顯微鏡。4.5除菌過濾器。5材料準(zhǔn)備5.1鴨病毒性肝炎I型病毒。5.2抗鴨病毒性肝炎I型病毒的陰，陽性血清，使用前均以56℃滅能30min后備用。5.3受檢血清按常規(guī)方法采血并分離血清，使用前均以56℃滅能30min后備用。5.4溶液的配制；見附錄A。5.5細(xì)胞培養(yǎng)板；選用無菌的孔徑為5cm平底帶蓋塑料培養(yǎng)皿，或96孔平底帶蓋塑料培養(yǎng)板。5.6其他儀器：如剪刀、鑷子、平皿、燒杯、三角瓶、刻度離心管、注射器、吸頭等以112kPa高壓滅菌30min,燃干后備用。5.7DEL細(xì)胞單層的準(zhǔn)備：參見第B,1章。5.8DEK細(xì)胸懸液的準(zhǔn)備：參見第B.2章。6血清中和空班減數(shù)試驗(yàn)6.1病毒毒價(jià)測定及配備取DHV-I用維持液將病毒液作10倍系列稀釋，每個(gè)稀釋度接種三個(gè)培養(yǎng)皿，按7.2.4和7.2.5的方法進(jìn)行試驗(yàn)。取每個(gè)稀釋度的三個(gè)培養(yǎng)皿的空斑平均數(shù)，用RcedMuench法計(jì)算病毒的PFU量，使用前配制成含200PFU/0.1mL的病毒懸液備用。6.2操作步驟6.2.1血清稀釋及中和感作；分別取陽性血清、陰性血清、受檢血清樣品，用維持液作兩倍系列稀釋，每個(gè)稀釋度加入等量病毒懸液，然后置37℃中和感作60min,每個(gè)稀釋度接種三個(gè)培養(yǎng)Ⅲ。6.2.2細(xì)胞對照：設(shè)三個(gè)培養(yǎng)皿的正常細(xì)胞對照，加入維持液。6.2.3病毒對照：設(shè)三個(gè)培養(yǎng)皿的病毒對照，將上述使用的病毒懸液稀釋為100PFU/0.1mL。6.2.4取已長滿DEL細(xì)胞單層的細(xì)胞培養(yǎng)皿，吸去培養(yǎng)液，用維持液清洗兩次，將上述稀釋及感作好的泥合液移入細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿0.1mL,加蓋后輕輕搖，使液體均勻分布于DEL細(xì)胞單層表面，然后置室溫(20℃~22℃)感作30min。6.2.5每培養(yǎng)Ⅲ加入瓊脂維持液3mL,加蓋后，置37℃,3%～5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h,取出后用偏光源(或低倍倒置顯微鏡)直接觀察空斑的形成情況，或用10%的福爾馬林固定后用1%的結(jié)晶紫染色觀察空斑，并記錄形成空案的數(shù)量。6.3結(jié)果判定6.3.1當(dāng)細(xì)胞對照正常，陽性血清效價(jià)與原滴定的效價(jià)相差1個(gè)滴度以內(nèi)，病毒對照的三個(gè)培養(yǎng)皿的平均空班數(shù)誤差在10PFU以內(nèi)時(shí)整個(gè)試驗(yàn)有效。6.3.2出現(xiàn)50%空斑減數(shù)的血清最高稻釋倍數(shù)為該血清的抗體滴度。7微量血清中和試驗(yàn)7,1病毒毒價(jià)(TCID)測定及配備取DHV-I細(xì)胞適應(yīng)毒用稀釋液將病毒液進(jìn)行10倍系列稻釋，加人96孔墻養(yǎng)板內(nèi)，每孔50pL,每個(gè)稀釋度接種八個(gè)培養(yǎng)孔，然后每孔加入100μL的DEK細(xì)胞懸液，然后每孔補(bǔ)如稀釋液50μL。加蓋后，置37℃、3%～5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)96h,取出觀察并記錄CPE,按Reed-Muenrh方法計(jì)算出病毒的TCID,使用前配制成含200TCIDg/50pL,的病毒懸液備用。7.2操作步驟7.2.1血清稀釋及中和感作；分別取陽性血清、陰性血清、受檢血清樣品，用稀釋液作兩倍系列稀釋，從稀釋度114開始每個(gè)稀釋度加入等量病毒懸液，稀釋度112的加人等量的稀釋液用作血清對照，然后置37℃中和感作60min。7,2.2將感作好的血清混合液加入96孔板內(nèi)(第1～11孔),每孔100μl,每個(gè)稀釋度需做4個(gè)孔，第12孔加入100μL的稀釋液用作正常細(xì)胞對照然后每孔再加入100μL的DEK細(xì)胞懸液。7.2.3病毒對照設(shè)立：將病毒稀釋為1000TCIDo/50pl.,100TCID/50pL,10TCID/50pL1TCID/50pL.每個(gè)船釋度做4孔，每孔加入50pL,再加入100pL的DEK細(xì)胞懸液，每孔補(bǔ)加稀釋液50pL。7.2.4置37℃,3%～5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)96h,取出后在低倍倒置顯微鏡觀察并記錄CPE,或用10%福爾馬林固定和1%的結(jié)晶紫染色后觀察。7.3結(jié)果判定7.3.1當(dāng)細(xì)胞對照和血清對照正常，陰性血清各孔出現(xiàn)CPE,陽性血清效價(jià)與原滴定的效價(jià)相差1個(gè)滴度以內(nèi)，病毒對照的回歸滴度與原測定滴度相差不超過104%5時(shí)，整個(gè)試驗(yàn)有效。7.3.2能夠完全抑制病毒產(chǎn)生CPE的血清最高稀釋倍數(shù)為該血清的抗體中和效價(jià)。7,3.3血清抗體效價(jià)在1:16以上(含1:16)判為陽性。5(資料性附錄)原代細(xì)胞制備B.1DEL細(xì)胞單層準(zhǔn)備選用來自健康種鴨群的14d～17d的鴨胚，用碘酒和酒精消毒蛋殼表面，打開氣室，以滅菌鑷子取出鴨胚，放在滅菌平Ⅲ內(nèi)，剖腹取出肝臟(去除膽囊),放于燒杯內(nèi)用Hank's平衡鹽溶液沖洗三次，用滅菌剪刀剪碎，再用Hank*s平衡鹽溶液沖決三次(加入溶液后讓組織塊自然下沉，再將溶液倒出),盡可能去除血液；然后加入5倍～10信于組織碎塊的量的胰酶消化液，置37℃水浴消化20min,吸去胰酶消化液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌兩次，然后加入細(xì)胞培養(yǎng)液，輕輕吹打，使其完全分散(使肉眼不能看到組織碎塊為止)。移入刻度離心管，以500r/min離心1min,取細(xì)胞泥，按每毫升含1.5×10°個(gè)細(xì)胞的比例用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋，然后加入培養(yǎng)Ⅲ,每個(gè)培養(yǎng)皿5mL,加蓋后置含5%二氧化碳的37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48h～72h長成細(xì)胞單層備用。B.2DEK細(xì)胞暴液的配備選用來自健康種鴨群的22d~25d的鴨胚，用碘酒和酒精消毒蛋殼表面，打開氣室，以滅菌攝子取出鴨胚，放在滅菌平皿內(nèi)，剖腹取出腎臟，放于燒杯內(nèi)用Hank’s平衡鹽溶液沖洗三次，用滅菌剪刀剪碎，再用Hank's平衡鹽溶液沖洗三次(加入溶液后讓組織塊自然下沉，再將溶液倒出),盡可能去除血液；然后加