植物病毒檢測規(guī)范

植物病毒檢測規(guī)范本標準規(guī)定了取樣、運輸和接收、檢測人員、儀器設(shè)備、藥品試劑，檢測方法、樣品、毒源的制備與保存等方面的要求和規(guī)范。本標準適用于進出境植物及其產(chǎn)品中病毒的檢疫鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注目期的引用文件，僅注目期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單》適用于本文件。GB/T27402實驗室質(zhì)量控制規(guī)范植物檢疫SN/T1193基因檢驗實驗室技術(shù)要求SN/T1840植物病毒免疫電鏡檢測方法SN/T2122進出境植物及植物產(chǎn)品檢疫抽樣3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。植物病毒plantvirus一類由核酸和蛋白質(zhì)外殼組成的具有侵染活性的細胞內(nèi)寄生病原物。植物受病原物或不良環(huán)境因素的侵擾后，內(nèi)部的生理活動、外觀和生長發(fā)育所顯示的某種異常狀態(tài)。用來鑒別病毒或病毒林系的植物，所產(chǎn)生的特征性癥狀可用來區(qū)分植物上常見的病毒。用一定的方法從大批物料中取出少量有代表性物料的過程。是國家植物檢疫機關(guān)按照有關(guān)檢疫規(guī)定，在指定的場所對進出境植物種子、苗術(shù)及其他繁殖材料，實施隔離試種、觀察、檢疫和處理的過程。空白對照blank不給予任何處理的對照。8目標條帶序列長度一致，則判定檢測結(jié)果呈陽性：如該樣品無特異性擴增條帶，則判定檢測結(jié)果呈陰性。9.4.7.2實時熒光PCR檢測結(jié)果判定在陰性對照、陽性對照，空白對照均正常的情況下；結(jié)果判定根據(jù)樣品Ct值進行判定，如Ct值是否在標準曲線Ct值范圍內(nèi)，判定為陽性或陰性。檢測樣品信噪比值介于陰性對照信噪比值和陽性質(zhì)控信噪比值之間為可疑陽性，需要采用其他檢測方法加以驗證。9.4.7.3基因芯片檢測結(jié)果判定檢測樣品信噪比值大于或等于陽性質(zhì)控信噪比值檢測結(jié)果判定為陽性；檢測樣品信噪比值小于陰性對照信噪比值檢測結(jié)果判定為陰性。檢測樣品信噪比值介于陰性對照信噪比值和陽性質(zhì)控信噪比值之間為可疑陽性，需要采用其他檢測方法加以驗證。9.4.7.4測序檢測結(jié)果判定將測序得到的核苷酸序列與已知的該物種特異性標準序列進行比對，如果同源性符合種內(nèi)判別標準，則判定檢測結(jié)果呈陽性，如果不符合種內(nèi)同源性判別標準，則判定檢測結(jié)果呈陰性。9.5結(jié)果綜合判定同時符合血清學檢測和分子生物學檢測結(jié)果為陽性，血清學檢測和整別寄主鑒定結(jié)果為陽性，血清學檢測方法中EI.ISA檢測和免疫電鏡兩項檢測結(jié)果為陽性的，可判定待檢測樣品帶有目標病毒。10檢測過程中的防擴散措施和防污染措施10.1防擴散措施在病毒檢測全過程中均要防止病毒的擴散。在取樣時應用密閉裝，防止所取樣樣品在傳遞過程中散失遺漏：檢測后的余樣，如發(fā)現(xiàn)有檢疫性病毒的應要燒毀，或高壓消毒，以防止病毒隨余樣進行擴散：對檢測后的洗滌液、玻璃器皿等要進行高壓滅菌處理。10.2防污染措施對病毒檢測全過程均要建立防污染措施。要定期對實驗室中的微生物進行監(jiān)控，定期用紫外光進行處理，防止空氣中的病毒核酸氣溶膠對檢測結(jié)果的污染。10.3隔離檢疫溫室防污染措施定期對隔離檢疫溫室噴灑殺蟲劑或開啟紫外線燈照射消毒。進入隔離檢疫溫室前應銑手，在緩沖室內(nèi)更換工作服、帽、鞋，并且只能在隔離檢疫溫室內(nèi)使用10.4試驗用品消毒對檢測過程所需的器皿及器械雷經(jīng)高溫濕熱滅菌或高溫干熱滅菌或高溫濕熱滅菌，在使用過程中避免交叉污染。所需的水以及試劑能滅菌處理的需經(jīng)滅菌處理。開封啟用過的無菌物品應滅菌后使用；無菌物品應分類故置，并定期檢查。11.1隔離檢疫記錄檢測人員在檢疫過程中詳細填寫檢疫記錄，每項檢測完成出具隔離檢疫實驗室檢驗結(jié)果報告。(資料性附錄)A.1當陽性樣品孔有顏色反應，陰性對照孔無顏色反應，且陰性對照孔OD值小于0.15,如果小于0.05按0.05計算，且重復檢測樣品OD值平行允許率(A)小于20%時則判定檢測結(jié)果有效。計算待測樣品OD值和剛性對照OD值之比值(P/N)。若P/N大于2,血清學檢測結(jié)果判定值接近2.需重復檢測可疑樣品(如果