豬囊尾蚴血清抗體膠體金斑點(diǎn)檢測(cè)方法

豬囊尾蚴血清抗體膠體金斑點(diǎn)檢測(cè)方法(資料性附錄)豬囊尾蚴病概述豬囊尾蚴病(Cysticereosiscellulosae)俗稱豬囊蟲病，是由豬帶絳蟲(Taeniasolium)幼蟲寄生在橫紋肌、心肌、腦、眼等部位引起的一種人獸共患寄生蟲病。目前，該病還廣泛存在于世界各地，在我國(guó)東北、華北、西南各地流行較為廣泛，不僅嚴(yán)重影響著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，而且威脅著人類身體健康。豬囊尼蚴大小為5mm×(6mm～10mm),形如米粒，為白色半透明的囊狀物，囊內(nèi)充滿透明液體。囊壁分兩層，外層為表皮層，表皮層有許多微毛，被覆一層碳水化合物和糖蛋白復(fù)合物；內(nèi)層為間質(zhì)層，間質(zhì)層由肌肉層和疏松結(jié)篩組織組成，結(jié)締組織疏松層內(nèi)有豐富的網(wǎng)狀小管，囊蟲有一向內(nèi)翻卷收縮的頭節(jié)，受膽汁刺激后可翻出，形態(tài)結(jié)構(gòu)與成蟲的相似。豬囊尾蚴主要寄生于人和豬.其唯一終末宿主是人。感染豬囊尾蚴的病豬一般無(wú)明顯癥狀，極嚴(yán)重感染的豬有營(yíng)養(yǎng)不良、生長(zhǎng)受阻、貧血和肌肉水腫等癥狀。由于病豬不同部位的肌肉水腫，或兩肩顯著外展，或臀部異常肥胖寬闊.或頭部呈大胖臉形或前胸，后軀及四肢異常肥大，體中部窄細(xì)，整個(gè)豬體從背面觀呈啞鈴狀或葫蘆形，前面看呈獅子頭形。病豬走路前肢僵硬，后肢不靈活，左右搖擺，不愛活動(dòng)，反應(yīng)遲鈍。某些器官嚴(yán)重感染時(shí)可出現(xiàn)相應(yīng)的癥狀，如呼吸困難，聲音嘶啞與吞咽困難，視力消失及一些神經(jīng)癥狀，有時(shí)產(chǎn)生急性腦炎而突然死亡。感染豬囊尾蚴的活豬生前診斷比較困難。只有當(dāng)舌部淺表寄生時(shí)，觸診可發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)，但陰性者不能排除感染。肉品衛(wèi)生檢驗(yàn)時(shí)，如在肌肉中，特別是在心肌、咬肌，舌肌及四肢肌肉中發(fā)現(xiàn)囊尾蚴，即可確診，尤以前臂外側(cè)肌肉群的檢出率最高。該病的檢疫方法有舌檢查法和免疫學(xué)檢查法。前者僅適用于舌上寄生的病豬，后者包括皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)、炭粒凝集試驗(yàn)、間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫電泳和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等。5B.5.1.3豬囊尾蚴的收集人工感染豬囊蟲3個(gè)月將豬屠宰，在肩胛外側(cè)肌、股部?jī)?nèi)側(cè)肌、深腰肌、心肌、咬肌、舌肌和腦等部位收集囊尾蚴。囊尾蚴橢圓形半透明的囊狀，其內(nèi)為透明的囊液，囊壁上向內(nèi)翻轉(zhuǎn)凹陷處有一個(gè)乳白色頭節(jié)，大小為4mm×5mm。B.5.1.4豬囊尾蚴全蟲抗原的分離與純化將收集的囊蟲，剪碎，磨細(xì)，于4℃以0.5mmel/L醋液浸提2d~3d.乙醚脫脂，先以0.86mmol/L氟化鈉鹽析，再以40%飽和度的硫酸銨鹽析，最后以80%飽和度的硫酸銨鹽析，沉淀物以pH為7.2的0.01mmol/L.PBS溶解，并對(duì)其透析，經(jīng)測(cè)定，置-20℃保存，備用。B.5.2膠體金的制備B.5.2.1取經(jīng)過(guò)潔凈化處理的250ml.三角燒瓶，加人79ml.雙蒸水和1ml.1%氯金酸，充分混勻后，將裝有混合液的三角燒瓶放入水溶中預(yù)熱至60℃~70℃。B.5.2.2取經(jīng)過(guò)潔凈化處理的25mL小燒杯，加入4ml.1%檸橡酸鈉.70pL.單寧酸和70μL將混合完成的檸檬酸鈉和單寧酸的燒杯置水浴鍋中預(yù)熱至60℃~70℃。將混合完成的檸檬酸鈉和單寧酸加入到加有氟金酸的250mL.三角燒瓶中，迅速混勻。先用微波爐加熱，再用電爐加熱的方法，使混合完成的膠體金溶液保持沸騰10min。在沸騰的過(guò)程中，要對(duì)液體不斷進(jìn)行攪拌，使受熱均勻，防止部分加熱過(guò)度。B.5.2.710min后，使其自然冷卻后，將其保存在密閉容器內(nèi)，置4℃保存。得到直徑為10nm的膠體金顆粒。B.5.3膠體金標(biāo)記抗原的制備B.5.3.1取兩個(gè)1.5ml試管，分別加人1ml.的膠體金。B.5.3.2加入適量25mmol/LK,CO把膠體金溶液的pH調(diào)整標(biāo)記最住pH值(約7.5)。B.5.3.3每管接比例加入標(biāo)記最佳抗原蛋白蛋白量(約為52mg/mL),混合均勻后，室溫下放置B.5.3.4分別加入10pL.2%PEG20000,室溫放置5tmin.B.5.3.56000r/min~10000r/min離心20min,使大部分探針形成松散沉淀，輕輕吸除上清液。B.5.3.6用20μl.BL.溶液重懸浮松散的