實驗五轉(zhuǎn)基因植物的檢測

關(guān)于實驗五轉(zhuǎn)基因植物的檢測1、檢測外源基因在植物細胞中的轉(zhuǎn)錄，對外源基因表達調(diào)控進行研究，掌握引物的選擇、cDNA的合成、RT-PCR檢測的原理與方法。。實驗?zāi)康牡?頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第3頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第4頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第5頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第6頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第7頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第8頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第9頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第10頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第11頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第12頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第13頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共29頁，2024年2月25日，星期天1、材料：轉(zhuǎn)基因植物的RNA或mRNA制備物。非轉(zhuǎn)化的植株材料總RNA或mRNA制備物2、設(shè)備：PCR儀、移液器、PCR管等。3、試劑：10×RT緩沖液、dNTP、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物（隨機引物，OligodT;特異引物)、10×OneStepRNAPCRBuffer、25mMMgCl2、10mMdNTP、RNaseInhibitor(40U/μl)、AMV-OptimizedTaq1μl、AMVRTaseXL(5U/μl)、上游特異Primer(20μM)*1、下游特異Primer(20μM)*2、RNaseFreeH2O。實驗材料、設(shè)備及試劑第16頁,共29頁，2024年2月25日，星期天實驗操作步驟：1）RNA提?。?/p>

關(guān)鍵防止RNA降解RNA提取的成功與否是RT-PCR檢測中最重要的步驟。第17頁,共29頁，2024年2月25日，星期天2、cDNA第一鏈的合成：取1個0.2ml的PCR管，依次加入下列試劑：10×PCRBuffer1μlRNaseFreedH2O5.75μldNTP1μlRNaseInhibitor0.25μlAMVRTaseTranscriptase0.5μloligodT-Adaptorprimer0.5μlRNA1μlTotal10μl實驗步驟第18頁,共29頁，2024年2月25日，星期天反應(yīng)條件：

42℃30min99℃5min5℃5min第19頁,共29頁，2024年2月25日，星期天3、PCR反應(yīng)取一個0.2ml的PCR管，依次加入下列試劑：

10×PCRBuffer

4μl

滅菌蒸餾水9μl

10mMdNTP２.5μl

Taq酶0.1μl

上游特異Primer(20μM)*1

0.2μl

下游特異Primer(20μM)*2

0.2μl

Total16μl

將（1）的反應(yīng)結(jié)果稀釋20倍，取10μl加入到（2）管中，輕輕搖勻。第20頁,共29頁，2024年2月25日，星期天反應(yīng)條件：94℃2min94℃30s55℃30s72℃1min72℃7min30Cycles第21頁,共29頁，2024年2月25日，星期天目前研究轉(zhuǎn)基因植物外源基因轉(zhuǎn)錄表達的常用方法1、RT-PCR(RNA)

2、Northernblot(RNA)

3、real-timePCR(RNA

）

第22頁,共29頁，2024年2月25日，星期天結(jié)果與分析利用凝膠成像分析儀對電泳結(jié)果進行拍照和結(jié)果記錄；觀察膠上是否有預(yù)擴增的主要產(chǎn)物帶。對比目的基因產(chǎn)物的電泳譜帶分子量和譜帶的特異性，確定和描述譜帶特征。

RT-PCR擴增得到的810bp的目的基因產(chǎn)物的電泳結(jié)果第23頁,共29頁，2024年2月25日，星期天1、將實驗結(jié)果粘到實驗報告上。2、如何選擇RT-PCR的反轉(zhuǎn)錄引物。3、結(jié)合實驗結(jié)果，試論應(yīng)用RT-PCR研究外源基因轉(zhuǎn)錄表達的優(yōu)缺點。實驗報告第24頁,共29頁，2024年2月25日，星期天實驗一、質(zhì)粒三種提取方法的比較為什么要用對數(shù)期的菌液提取質(zhì)粒？因為對數(shù)期菌的生長狀況和數(shù)量最佳,有利于提取質(zhì)粒

溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的作用？溶液Ⅰ50mM葡萄糖/10mMEDTA/25mMTris-HCl，pH=8.0葡萄糖增稠，使懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部；EDTA抑制DNase的活性。這一步溶液中還可以加入RNase，不受EDTA影響，并且可以在后續(xù)步驟中被除去溶液Ⅱ0.2MNaOH/1%SDS破細胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。溶液Ⅲ3M醋酸鉀/2M醋酸這一步的K置換了SDS（十二烷基磺酸鈉）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸鉀）沉淀；SDS易與蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個氨基酸上結(jié)合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)也沉淀了，同時基因組DNA也被PDS共沉淀第25頁,共29頁，2024年2月25日，星期天溶菌酶的作用作用?沸水加熱的作用?利用溶菌酶和TritonX-100破壞細胞壁,加熱可使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性.將實驗電泳結(jié)果粘到實驗報告上，并對結(jié)果分析。比較三種提取方法的區(qū)別？第26頁,共29頁，2024年2月25日，星期天實驗二、醋酸鋰法轉(zhuǎn)化酵母細胞觀察并描述培養(yǎng)狀況，統(tǒng)計單菌落個數(shù)。比較酵母細胞轉(zhuǎn)化與大腸桿菌細胞轉(zhuǎn)化的區(qū)別。酵母菌屬于真核生物,大腸桿菌是細菌屬于原核生物.酵母轉(zhuǎn)化在室溫，大腸桿菌轉(zhuǎn)化在冰上酵母轉(zhuǎn)化用醋酸鋰，大腸桿菌轉(zhuǎn)化用氯化鈣酵母轉(zhuǎn)化用穿梭質(zhì)粒，大腸桿菌轉(zhuǎn)化用普通質(zhì)粒穿梭質(zhì)粒是指一類人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點和選擇標記，因而可以在兩種不同類群宿主中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。比如說通常能夠在哺乳動物，酵母或者其他細菌復(fù)制表達的質(zhì)粒，同時可以在大腸桿菌內(nèi)復(fù)制。這樣利于對質(zhì)粒的分子生物學操作和大量制備。第27頁,共29頁，2024年2月25日，星期天實驗三、侵染菌種對除菌抗生素的敏感性頭孢酶素100200300400500600頭孢唑啉鈉------頭孢哌酮鈉------頭孢曲松鈉-++++++++++++++++頭孢噻肟鈉--+++++++++++++-：表示無抑制作用；