植物細胞培養(yǎng)與次生產(chǎn)物制備

關(guān)于植物細胞培養(yǎng)與次生產(chǎn)物制備第一節(jié)植物細胞的培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)從植物組織培養(yǎng)而來，植物組織培養(yǎng)主要用于形成組織和再生成植株細胞培養(yǎng)主要生成次生代謝產(chǎn)物基本技術(shù)：植物材料的準備培養(yǎng)基制備培養(yǎng)方法的選擇第2頁,共76頁，2024年2月25日，星期天一、植物細胞的培養(yǎng)特點植物培養(yǎng)細胞四個生長時期特性延遲期：細胞數(shù)恒定，高RNA含量，高蛋白質(zhì)合成能力；加速期：細胞快速生長期。干重恒定，細胞數(shù)、DNA和蛋白質(zhì)濃度增加，有絲分裂活性、RNA含量和蛋白質(zhì)合成能力減少；對數(shù)期：介于最大生長率和蛋白質(zhì)合成完全停止期之間。增加細胞鮮重、干重及RNA酶活性，蛋白質(zhì)合成能力完全減退；穩(wěn)定期：細胞數(shù)穩(wěn)定。細胞高液泡化，極度脆弱，高度分化及有機化合物的高濃度。第3頁,共76頁，2024年2月25日，星期天（1）植物細胞有獨特的培養(yǎng)時間及特征：重量的增加在對數(shù)期，次生代謝產(chǎn)物在穩(wěn)定期積累（2）植物細胞很少單一細胞生長，對數(shù)生長后期分泌量蛋白和粘多糖，以非均相集合的細胞團懸浮生長。（3）植物細胞好氣，培養(yǎng)過程中需供氣及攪拌，但細胞壁脆弱，抗剪切能力小，傳統(tǒng)的攪拌式反應(yīng)器極易損傷細胞壁第4頁,共76頁，2024年2月25日，星期天二、植物細胞培養(yǎng)基植物細胞生長代謝特點：（1）需大量無機鹽（2）需多種維生素和植物生長激素（3）無機氮源，硝酸鹽，銨鹽為主。（4）以蔗糖為碳源第5頁,共76頁，2024年2月25日，星期天常用培養(yǎng)基MS、N6、B6、LS、RM-1964、H、T、B5、DBMII、米勒、改良懷特、尼許等。MS培養(yǎng)基是目前應(yīng)用最多最普遍的培養(yǎng)基。無機鹽的濃度較高，能保證組織培養(yǎng)生長所需的礦物營養(yǎng)。并且因為離子濃度高，在配制、貯存、消毒過程中，即使有些成分略有出入，也不致影響培養(yǎng)基中的離子平衡。第6頁,共76頁，2024年2月25日，星期天B5含有較低的鹽離子，這個成分可能對很多培養(yǎng)物的生長有抑制作用。White的無機鹽含量較低，適于生根培養(yǎng)。KM-8p主要用于原生質(zhì)體培養(yǎng)，其特點是有機成分較復雜，它包括了幾乎所有的單糖和維生素、呼吸代謝中的主要有機酸。凡是花藥培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基，其成分較簡單，且KN03和(NH)2N04含高。第7頁,共76頁，2024年2月25日，星期天（一）無機鹽大量元素：氮、磷、鉀、鈣、鎂、硫等微量元素：硼、錳、鋅、鉬、銅、鈷、氯等（二）生長因素植物生長調(diào)節(jié)劑植物生長激素：生長素，細胞分裂素，赤霉素，脫落酸，乙烯。

借生長激素調(diào)控生長分化，以及細胞培養(yǎng)時，獲得最大量的次生代謝產(chǎn)物第8頁,共76頁，2024年2月25日，星期天生長素（用來誘導細胞的分裂、愈傷組織形成和根的分化）：組織培養(yǎng)中常用的有：吲哚乙酸(IAA)：第一個被發(fā)現(xiàn)和人工合成的的激素二氯本氧乙酸(2,4-D)；萘乙酸(NAA)；吲哚-3-丁酸(IBA)；萘氧乙酸(NOA)；對氯苯氧乙酸(P-CPA)NAA、IAA、IBA易引起生根，2,4-D有利于愈傷組織的誘導和生長第9頁,共76頁，2024年2月25日，星期天細胞分裂素主要促進細胞分裂和由愈傷組織上或器官上分化不定芽。常用的有：6-芐基嘌呤(BAP)6-芐基腺嘌呤(6-BA)激動素（呋喃氨基嘌呤、Kinetin、KT）玉米素(zeatin、zt)異戊烯氨基嘌呤(2-ip)第10頁,共76頁，2024年2月25日，星期天植物培養(yǎng)物的生長取決于生長素和分裂素的比例：高濃度生長素和低濃度分裂素——刺激細胞分裂

低濃度生長素和高濃度分裂素——刺激細胞生長（三）誘導子(elicitor)：刺激植物細胞合成防御性次生代謝產(chǎn)物的物質(zhì),可以通過改變次生代謝途徑中催化酶的酶活力,引起代謝通量和反應(yīng)速率的改變,提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。

第11頁,共76頁，2024年2月25日，星期天非生物誘導子：水楊酸，茉莉酸等,稀土及重金屬鹽類生物誘導子：微生物類，如真菌孢子，菌絲體

真菌培養(yǎng)物濾液等（四）碳源細胞培養(yǎng)過程中不進行光合作用，需提供糖做碳源。（五）維生素：煙酸，B1，B6（六）有機物：甘氨酸或水解絡(luò)蛋白，酵母提取液等。第12頁,共76頁，2024年2月25日，星期天三、植物細胞的獲得和擴大培養(yǎng)（一）植物細胞的獲得1.外植體直接分離法:機械切割、組織破碎直接從植物外植體中分離2.愈傷組織分離法：從愈傷組織制備小細胞團或單細胞懸液3.原生質(zhì)體再生法：纖維素和果膠酶混合處理外植體或愈傷組織，分離原生質(zhì)體，再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)，原生質(zhì)體細胞壁再生獲得植物細胞第13頁,共76頁，2024年2月25日，星期天（二）植物細胞的培養(yǎng)一、懸浮培養(yǎng)二、單細胞培養(yǎng)三、植物細胞的規(guī)?；囵B(yǎng)及有用物質(zhì)生產(chǎn)第14頁,共76頁，2024年2月25日，星期天一、懸浮培養(yǎng)（cellsuspensionculture）懸浮培養(yǎng)是細胞培養(yǎng)的基本方法，是將單個游離細胞或小細胞團在液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。

第15頁,共76頁，2024年2月25日，星期天1、愈傷組織誘導

要求：松散性好，增殖快，再生能力強。其外觀一般是鮮艷的乳白或淡黃色，呈細小顆粒狀，松散易碎。

適于懸浮培養(yǎng)適于再生植株第16頁,共76頁，2024年2月25日，星期天如何獲得符合要求的愈傷組織？1、選擇適宜的外植體：胚、胚軸、子葉是最常用的外植體，特別是幼胚。2、選擇適宜的培養(yǎng)基：生長素濃度很重要配合一定濃度的細胞分裂素；添加附加物。3、愈傷組織要進行繼代選擇：選擇疏松性好、細胞狀態(tài)好的細胞不斷繼代培養(yǎng)。第17頁,共76頁，2024年2月25日，星期天懸浮系建立過程：影響懸浮細胞生長的因素：1、起始愈傷組織的質(zhì)量2、接種細胞密度3、培養(yǎng)條件：方式、溫度、4、繼代周期2、懸浮系的建立與繼代培養(yǎng)愈傷組織1g愈傷/10ml培養(yǎng)基150、250ml三角瓶（30、70ml培養(yǎng)基）120rpm,25℃黑暗培養(yǎng),換液1次/3d以防粘稠蔗糖梯度離心或過濾法(淘汰過大或生理狀態(tài)不好的細胞團)繼代培養(yǎng)80rpm（懸浮細胞系穩(wěn)定以后）繼代時間為1周時（原懸浮液：新培養(yǎng)基=1：4）每次繼代都要進行選擇，篩選生活力好的細胞繼代第18頁,共76頁，2024年2月25日，星期天成功的懸浮細胞培養(yǎng)體系必須滿足3個條件：1、浮懸培養(yǎng)物分散性良好，細胞團較小，一般在30～50個細胞以下，在實際培養(yǎng)中很少有完全由單細胞組成的植物細胞懸浮系。2、均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同，懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。3、細胞生長迅速，懸浮細胞的生長量一般

2～3天甚至更短時間便可增加1倍。第19頁,共76頁，2024年2月25日，星期天3、懸浮細胞生長動態(tài)：基本的懸浮培養(yǎng)體系均是將細胞分散在一定容積的培養(yǎng)液中進行，在一個培養(yǎng)周期不添加培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)體系基本是處于封閉狀態(tài)。當一種營養(yǎng)物質(zhì)耗盡時，細胞及停止生長。在這種懸浮培養(yǎng)體系中，細胞擴增生長成S形曲線。第20頁,共76頁，2024年2月25日，星期天

培養(yǎng)周期的概念

具有一定起始培養(yǎng)密度的單細胞，從開始培養(yǎng)到細胞數(shù)目和總重量增長停止這一過程，稱為一個培養(yǎng)周期。

第21頁,共76頁，2024年2月25日，星期天

接種初期的細胞密度過低會使延遲期加長，懸浮細胞的起始密度一般在（0.5~2.5）*105個范圍內(nèi)調(diào)整。一般繼代培養(yǎng)可降低密度；若在短時間內(nèi)獲得大量細胞可提高接種密度。在實際應(yīng)用中，還需要確定一些參數(shù)：最低起始密度、最大生長速率、每個培養(yǎng)周期所經(jīng)歷的天數(shù)等。第22頁,共76頁，2024年2月25日，星期天4、懸浮細胞培養(yǎng)的同步化細胞同步化：同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細胞都同時通過細胞周期的某一特定時期。植物細胞在懸浮培養(yǎng)中的游離性較差，容易團聚進入不同程度的分化狀態(tài)，因此要達到完全同步化相當困難。①分選法：通過細胞體積大小分級，直接將處于相同周期的細胞進行分選，然后將同一狀態(tài)的細胞繼代培養(yǎng)于同一培養(yǎng)體系中。②饑餓法：在一個培養(yǎng)體系中，如果細胞生長的基本成分喪失，則導致細胞因饑餓而分裂受阻，從而停留在某一分裂時期。第23頁,共76頁，2024年2月25日，星期天③抑制劑法：通過一些DNA合成抑制劑處理細胞，使細胞滯留在DNA合成前期，當解除抑制后，即可獲得處于同一細胞周期—G1期的同步化細胞。④低溫法：冷處理也可提高培養(yǎng)體系中細胞同步化程度。第24頁,共76頁，2024年2月25日，星期天二.單細胞的培養(yǎng)（1）看護培養(yǎng)法（nurseculture）：在單細胞的生長環(huán)境里加入愈傷組織同時培養(yǎng)。愈傷組織提供促細胞分裂的物質(zhì)等，傳遞生物信息，使持續(xù)分裂增值等。即愈傷組織看護單細胞第25頁,共76頁，2024年2月25日，星期天（2）微室培養(yǎng)法：單細胞接種到小室里，密封培養(yǎng)，觀測單細胞的生長發(fā)育情況（3）平板培養(yǎng)法：單細胞接種于固體培養(yǎng)基上，獲得單細胞形成的細胞系（4）條件培養(yǎng)法：接種于條件培養(yǎng)基上形成的細胞系。條件培養(yǎng)基指培養(yǎng)過細胞的培養(yǎng)基上清，有植物生長激素等殘留，用于制備成固體培養(yǎng)基。第26頁,共76頁，2024年2月25日，星期天二.單倍體細胞的培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)）：指將植物單倍體細胞培養(yǎng)成單倍體植株或純和二倍體植株一般采取花藥作為單倍體細胞的培養(yǎng)對象用花粉在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)第27頁,共76頁，2024年2月25日，星期天三.愈傷組織培養(yǎng)愈傷組織既是組織又是細胞，為脫分化細胞，具再分化的能力，可用于次生代謝物的生產(chǎn)，也可再生為植株。第28頁,共76頁，2024年2月25日，星期天四.毛狀根誘導和培養(yǎng)一些次生代謝產(chǎn)物只有在根里生長發(fā)根農(nóng)桿菌感染雙子夜植物，RI質(zhì)粒誘導產(chǎn)生毛狀根。形態(tài)方面：Ri質(zhì)粒誘導快速生長的、非定向性、高分支的毛狀根的形成代謝方面：Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根能合成與原植物相同或相似的次生代謝物，并且發(fā)根合成次生代謝物具有遺傳穩(wěn)定性。第29頁,共76頁，2024年2月25日，星期天毛狀根生長快速和次級代謝產(chǎn)物含量高，特別適用于從木本植物和難于培養(yǎng)的植物中得到較高含量的次級代謝產(chǎn)物。毛狀根具有如下特點：激素自養(yǎng)，不必加外源激素；次級代謝產(chǎn)物含量高且穩(wěn)定；增殖速度快。第30頁,共76頁，2024年2月25日，星期天用發(fā)根農(nóng)桿菌經(jīng)直接注射法，外植體接種感染，原生質(zhì)體共培養(yǎng)法誘導毛狀根發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后，經(jīng)篩選鑒定低鹽濃度下生長，培養(yǎng)第31頁,共76頁，2024年2月25日，星期天植物細胞培養(yǎng)工業(yè)化存在的問題生長緩慢,通常完成一次生產(chǎn)周期需4-5周次級代謝物含量低培養(yǎng)細胞不穩(wěn)定等多數(shù)產(chǎn)物積累于胞內(nèi)不耐受剪切力一般的說，只有當次級代謝產(chǎn)物的價格高于1000美元/kg時，才考慮采用植物細胞培養(yǎng)方法。第32頁,共76頁，2024年2月25日，星期天植物細胞易聚集化，比較脆弱，代謝途徑和代謝產(chǎn)物累積與細胞生長關(guān)系的復雜性，選擇合適的培養(yǎng)方法和反應(yīng)器影像產(chǎn)物產(chǎn)量細胞培養(yǎng)周期長，次生代謝產(chǎn)物含量相對較低，提取困難，生物反應(yīng)器技術(shù)還有待深入三、植物細胞培養(yǎng)的大規(guī)模培養(yǎng)-

生物反應(yīng)器第33頁,共76頁，2024年2月25日，星期天根據(jù)通氣和攪拌系統(tǒng)的類型可將生物反應(yīng)器分類：搖瓶：氣體和營養(yǎng)成分的均勻分布可將通過機械的簡單振搖而實現(xiàn)攪拌目的。攪拌型生物反應(yīng)器優(yōu)點：主要體現(xiàn)在不同攪拌器的靈活應(yīng)用，有利于培養(yǎng)物的高度混合。缺點：高耗能以及由于細胞對剪切力的高度敏感所致的種種缺陷環(huán)流生物反應(yīng)器＆鼓泡生物反應(yīng)器外部循環(huán)水或壓縮空氣作為能量輸入第34頁,共76頁，2024年2月25日，星期天大規(guī)模培養(yǎng)要綜合考慮以下因素：供氧能力及氣泡分散程度剪切力大小及對細胞的影響高密度培養(yǎng)對培養(yǎng)液的混和程度溫度，pH及營養(yǎng)物濃度的控制能力細胞團大小的控制能力易于放大第35頁,共76頁，2024年2月25日，星期天植物細胞培養(yǎng)反應(yīng)器

植物細胞培養(yǎng)用的反應(yīng)器主要有機械式攪拌生物反應(yīng)器、鼓泡塔與氣升式生物反應(yīng)器、填充床式生物反應(yīng)器、流化床生物反應(yīng)器和膜式生物反應(yīng)器等。1、機械式攪拌生物反應(yīng)器2、鼓泡塔與氣升式生物反應(yīng)器3、填充床生物反應(yīng)器考慮到機械攪拌式反應(yīng)器的剪切作用難以避免，同時攪拌器轉(zhuǎn)動的中軸往往是容易使培養(yǎng)物污染的部位，因此，發(fā)展出空氣提升式生物反應(yīng)器，但其缺點是攪拌不均勻。第36頁,共76頁，2024年2月25日，星期天在填充床生物反應(yīng)器中，細胞可以位于支撐物表面，也可以包埋于支撐物之中，培養(yǎng)液可以流經(jīng)支撐物顆粒，不斷被細胞所利用。填充床生物反應(yīng)器已被用于植物細胞的培養(yǎng)。（a）（b）出口出口進口進口填充床生物反應(yīng)器流化床生物反應(yīng)器

填充床生物反應(yīng)器的優(yōu)點在于單位體積固定細胞量大，但是填充床反應(yīng)器還存在許多缺點，它的混合效果低，對必要的氧傳遞、PH、溫度控制和氣體產(chǎn)物的排除造成了困難，影響了細胞的培養(yǎng)，同時大顆粒的低效率傳質(zhì)、填充體成分供應(yīng)和排除的困難，限制了填充床反應(yīng)器應(yīng)用于不要求細胞活性的生物轉(zhuǎn)化。第37頁,共76頁，2024年2月25日，星期天2、流化床生物反應(yīng)器

典型的流化床生物反應(yīng)器是利用流體的能量來懸浮顆粒的。由于使顆粒呈流化狀態(tài)所需的能量與顆粒大小成正比，因此，通常采用小固定化顆粒，這些小顆粒良好的傳質(zhì)特性是流化床反應(yīng)器的主要優(yōu)點。流化床生物反應(yīng)器的最大缺點是剪切和顆粒碰撞會損壞固定化細胞。（a）（b）出口出口進口進口填充床生物反應(yīng)器流化床生物反應(yīng)器第38頁,共76頁，2024年2月25日，星期天3、膜生物反應(yīng)器

在植物細胞培養(yǎng)過程中，主要采用的是中空纖維和螺線式卷繞反應(yīng)器。如下圖所示。膜反應(yīng)器的優(yōu)點是可以重復使用，因此，盡管投資較大，仍較經(jīng)濟。另外，由于植物細胞代謝不像微生物那樣旺盛，因而可以采用更厚的細胞層。細胞細胞營養(yǎng)物入口營養(yǎng)物入口營養(yǎng)物出口營養(yǎng)物出口營養(yǎng)物質(zhì)圖12-5固定化細胞膜反應(yīng)器a-中空纖維反應(yīng)器b-螺線式卷繞反應(yīng)器第39頁,共76頁，2024年2月25日，星期天第40頁,共76頁，2024年2月25日，星期天各種生物反應(yīng)器性能比較不同類型的生物反應(yīng)器各有其優(yōu)缺點，而改進的攪拌式生物反應(yīng)器和氣升式反應(yīng)器可能更適合植物細胞的培養(yǎng)。一般來說，懸浮培養(yǎng)的細胞在干重不大于20g/L時，以氣升式反應(yīng)器為宜，而當干重超過20g/L時，則改進的攪拌式生物反應(yīng)器優(yōu)于其它類型的反應(yīng)器第41頁,共76頁，2024年2月25日，星期天我國發(fā)明的“氣升內(nèi)錯流”式植物細胞培養(yǎng)反應(yīng)器，能夠適應(yīng)植物細胞培養(yǎng)周期長，培養(yǎng)液隨培養(yǎng)進程而蒸發(fā)減少的生物反應(yīng)過程；可抑制氣泡的聚合，減弱氣泡在液面破裂時產(chǎn)生的沖擊力對細胞的損傷；可提高降液區(qū)氣含率，消除降液區(qū)缺氧現(xiàn)象，并強化混合與氧傳遞，大大降低反應(yīng)器高度。使用這種反應(yīng)器培養(yǎng)新疆紫草細胞，培養(yǎng)結(jié)束時細胞量達到12gdw／L，紫草寧含量達到了細胞干重的10％，是天然植株含量的2～8倍第42頁,共76頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)影響植物次級代謝產(chǎn)物累積的因素

因素主要有：1、生物條件：外植體、季節(jié)、休眠、分化等；2、物理條件：溫度、光（光照時間、光強、光質(zhì)）、通氣（氧氣）、酸度和滲透壓；3、化學條件：無機鹽、碳源、物質(zhì)生長調(diào)節(jié)劑、維生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物質(zhì)和前體等；4、工業(yè)培養(yǎng)條件：培養(yǎng)罐類型、通氣、攪拌和培養(yǎng)方式。第43頁,共76頁，2024年2月25日，星期天一、外植體的選擇在生長曲線的不同時期，累積不同的產(chǎn)物。第44頁,共76頁，2024年2月25日，星期天二、培養(yǎng)條件的影響

營養(yǎng)成分、生物及非生物元素、酸度、通氣以混合程度、與接種有關(guān)的因素以及剪切力、攪拌頻率、溫度和光。

第45頁,共76頁，2024年2月25日，星期天1、內(nèi)在因素（1）、接種和誘導

外植體的大小直接影響所誘導的組織和細胞的生長，而且也關(guān)系到其次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力。外植體的前處理也可嚴重影響次級代謝產(chǎn)物的累積方式。（2）、培養(yǎng)基的組成，基本培養(yǎng)基的各種成分是愈傷組織和懸浮細胞培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

第46頁,共76頁，2024年2月25日，星期天磷，低磷會導致次級代謝產(chǎn)物的累積，缺乏磷會導致生物量的大幅度降低。氮，硝酸鹽和銨鹽；還有某些需要特殊的有機氮源。如天冬氨酸、尿素、酪蛋白水解物或蛋白胨。銅，作為鄰及對-二酚可抗壞血酸氧化酶活性基團的作用，是次級代謝產(chǎn)物累計的必要元素，還可作為非生物誘導子。碳源，自養(yǎng)培養(yǎng)的二氧化碳和異養(yǎng)培養(yǎng)的糖類，性質(zhì)和數(shù)量往往對培養(yǎng)細胞的生物量有很大的影響。第47頁,共76頁，2024年2月25日，星期天糖類對次級代謝產(chǎn)物的影響主要取決于所使用的糖類的種類和濃度及細胞次級代謝產(chǎn)物的生物合成過程，還可增強生物堿起始合成酶的活性和增加相關(guān)mRNA的濃度。糖的作用有：延長穩(wěn)定期；通過蔗糖分解后的產(chǎn)物（葡萄糖）所產(chǎn)生的對內(nèi)源性生長素合成的抑制作用；增強戊糖磷酸化途徑有關(guān)酶的活性。

第48頁,共76頁，2024年2月25日，星期天（3）、植物生長調(diào)節(jié)劑

非常重要的作用，這種作用有時可能是關(guān)鍵性的。不同的植物激素及其不同的組成形式均可顯著影響代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。由于材料生理狀態(tài)的差異，其作用也有很大的不同。

第49頁,共76頁，2024年2月25日，星期天（4）、氧氣和酸度

氧氣，懸浮細胞和固定化細胞供氧方式有所不同，前者可采用通氣和攪拌，轉(zhuǎn)速過快會導致細胞破裂，后者只能采用通氣方式。酸度，有利于細胞培養(yǎng)的酸度在5-6之間，培養(yǎng)基在細胞生長過程中會變酸或變堿。第50頁,共76頁，2024年2月25日，星期天（5）、滲出物

在細胞懸浮培養(yǎng)的后期，培養(yǎng)液中含有多種細胞代謝的初級和次級產(chǎn)物。第51頁,共76頁，2024年2月25日，星期天2、兩步培養(yǎng)法

第一步使用適合細胞生長的培養(yǎng)基，營養(yǎng)豐富；第二步使用適于次級代謝產(chǎn)物合成的培養(yǎng)基，較低含量的硝酸鹽和磷酸鹽，并含有較低的糖分或少量的碳源。第52頁,共76頁，2024年2月25日，星期天3、誘導子

植物抗毒素是在植物防御系統(tǒng)內(nèi)能對抗微生物進攻的某些次級代謝產(chǎn)物，有些時候連續(xù)合成，有些時候在被次級下才會產(chǎn)生抗毒素，或僅在被誘導下其產(chǎn)量才能增加。觸發(fā)形成植物抗毒素信號的物質(zhì)稱為誘導子，能夠誘導植物細胞中的一個反應(yīng)，并能形成特征性自身防御反應(yīng)的分子。兩種分類，一種是根據(jù)在細胞內(nèi)或細胞外形成而將其分為內(nèi)源性誘導子和外源性誘導子；另一種是根據(jù)其來源分為生物誘導子和非生物誘導子。生物誘導子是指植物體在防御過程中為對抗微生物感染而產(chǎn)生的物質(zhì)，包括分生孢子、降解細胞壁的酶類、細胞壁碎片、有機體產(chǎn)生的代謝物。非生物誘導子所有不是植物細胞中天然成分但又能觸發(fā)植物細胞形成抗毒素信號的物質(zhì)。第53頁,共76頁，2024年2月25日，星期天4、培養(yǎng)環(huán)境的外部因素（1）、溫度，次級代謝產(chǎn)物的最佳產(chǎn)生溫度是20-28度，低溫時細胞不再生長，產(chǎn)物不合成。溫度的變化可引起產(chǎn)物類型在質(zhì)和量上的改變。（2）、攪拌頻率，具體表現(xiàn)在發(fā)酵液中的溶氧濃度和機械攪拌對細胞所產(chǎn)生的剪切力上。（3）、培養(yǎng)容器的影響，因為容器的大小和攪拌裝置的不同會產(chǎn)生不同的次級代謝產(chǎn)物。

第54頁,共76頁，2024年2月25日，星期天（4）、光的影響，光照時間的長短、光質(zhì)、光強對次級代謝產(chǎn)物的累積有一定的作用。光對植物培養(yǎng)細胞的影響主要表現(xiàn)在：特殊波長的短波脈沖僅僅啟動細胞的形態(tài)分化和生化過程，而連續(xù)光照則可以保持光的反應(yīng)潛能或反應(yīng)狀態(tài)。植物光照和激素具有協(xié)同作用或?qū)棺饔?。?5頁,共76頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)培養(yǎng)方法的進展與展望20世紀90年代以來，對于植物細胞及其代謝產(chǎn)物的研究進入了新的發(fā)展時期，并出現(xiàn)了很多新技術(shù)和新方法，比如誘導子、前體飼養(yǎng)、兩相培養(yǎng)法、質(zhì)體轉(zhuǎn)化、毛狀根和冠癭瘤組織培養(yǎng)等，顯示了植物細胞培養(yǎng)工程制藥的廣闊發(fā)展前景。

第56頁,共76頁，2024年2月25日，星期天一、誘導子

在植物細胞培養(yǎng)中加入誘導子可以提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，并可促進產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中。誘導子的作用隨誘導子的種類的不同而異，研究顯示，誘導子的最佳加入時間為細胞對數(shù)的生長期。第57頁,共76頁，2024年2月25日，星期天二、前體飼喂

是增加次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)率的重要方法，次級代謝產(chǎn)物的合成依賴于3中主要原材料的供應(yīng)，莽草酸是芳香氨基酸、肉桂酸和某些多酚化合物的前體；氨基酸，形成生物堿及肽類抗生素；乙酸，是聚乙炔類、前列腺素類、大環(huán)抗生素，多酚類，類異戊二烯等的前體。

第58頁,共76頁，2024年2月25日，星期天三、兩相培養(yǎng)法

出發(fā)點是在細胞外創(chuàng)造一個次級代謝產(chǎn)物的儲存單元。可加入固相或疏水液相，形成兩相培養(yǎng)體系，從而達到收集分泌產(chǎn)物的目的?？蓽p輕產(chǎn)物本身對細胞代謝的抑制作用，并可保護產(chǎn)物免受培養(yǎng)基中催化酶或酸對產(chǎn)物的影響?？珊喕掠翁幚磉^程，降低生產(chǎn)成本。第59頁,共76頁，2024年2月25日，星期天兩相培養(yǎng)系統(tǒng)需滿足下列條件：添加的固相或液相對細胞無毒害作用，不影響細胞生長和產(chǎn)物合成；產(chǎn)物易被固相吸附或被有機相溶解；兩相易分離；如為固相不吸附培養(yǎng)基中的添加成分，植物生長調(diào)節(jié)劑或有機成分。第60頁,共76頁，2024年2月25日，星期天四、毛狀根和冠癭瘤培養(yǎng)第61頁,共76頁，2024年2月25日，星期天雙子葉植物病原菌根瘤農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌的原生質(zhì)體中分別含有Ti和Ri質(zhì)粒，大小約200kb.植物遭感染后，農(nóng)桿菌能將質(zhì)粒中的一段轉(zhuǎn)移DNA（T－DNA）片段整合到植物基因組上，表型上出現(xiàn)冠瘤或毛狀根。將冠癭瘤或毛狀根作為培養(yǎng)系統(tǒng)，可進行有用化合物的生產(chǎn)。第62頁,共76頁，2024年2月25日，星期天1、毛狀根培養(yǎng)

利用發(fā)根農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用進行次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，極具發(fā)展前途，其生長快速和次級代謝產(chǎn)物含量高，特別適用于從木本植物和難于培養(yǎng)的植物中得到較高含量的次級代謝產(chǎn)物。

毛狀根具有如下特點：激素自養(yǎng)，不必加外源激素；次級代謝產(chǎn)物含量高且穩(wěn)定；增殖速度快。第63頁,共76頁，2024年2月25日，星期天2、冠癭組織培養(yǎng)

有些藥用植物的活性成分僅在葉片和莖軸中合成，利用冠癭組織培養(yǎng)易于得到這些物質(zhì)，冠癭組織的獲得，是由根瘤農(nóng)桿菌感染植物組織，Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后獲得冠癭瘤，經(jīng)過除菌后，從冠癭瘤培養(yǎng)獲得的。該組織也具有激素自養(yǎng)、增殖速度快等特點，也可以進行液體培養(yǎng)。第64頁,共76頁，2024年2月25日，星期天3、轉(zhuǎn)基因植物和活性成分生產(chǎn)由于分子生物學領(lǐng)域的進展，如今已有可能人工設(shè)計新的植物性狀用于改良作物的品質(zhì)＆抗性。該技術(shù)的關(guān)鍵在于用什么方法將外源基因?qū)胫参锏幕蚪M并高效表達。

用農(nóng)桿菌做載體將外源基因?qū)胫参锘蚪M的方法比較成熟。

第65頁,共76頁，2024年2月25日，星期天第五節(jié)植物細胞培養(yǎng)在制藥工業(yè)上的應(yīng)用一、生產(chǎn)天然藥物(1)人參細胞培養(yǎng)MS培養(yǎng)基生長初期低糖，生長后期補糖控制磷酸鹽濃度和PH添加生長素和激動素離心葉輪式反應(yīng)器進行高密度培養(yǎng)細胞干重最多達30g/L

人參皂苷達2g/L第66頁,共76頁，2024年2月25日，星期天(2)紅豆杉細胞培養(yǎng)紫杉醇(Paclitaxel):二萜類化合物,抗癌藥，是有絲分裂抑制劑，可阻止微管正常生理聚集，抑制癌細胞的有絲分裂和紡錘體的形成，從而使癌細胞的復制受到阻斷而凋亡。1967年美國化學家Wall和Wani首先從太平洋紫杉（短葉紅豆杉）樹皮中提取出來。該藥1992年底獲美國FDA批準上市。

第67頁,共76頁，2024年2月25日，星期天紫杉醇存在于紅豆杉屬植物的樹皮、葉及莖中，其中樹皮中的含量最高。12000株成年紫杉樹中才能提取1KG的紫杉醇，而且紫杉的生長周期很長，在世界分布很少。紫杉醇的國際市場價格為450美元/g第68頁,共76頁，2024年2月25日，星期天B5培養(yǎng)基，補糖，暗培養(yǎng)低濃度的生長激素誘導子培養(yǎng)基中加甲基戊酸，苯丙氨酸等前體加甲瓦龍酸等中間產(chǎn)物加單萜合成抑制劑篩選細胞株最高產(chǎn)量達0.15g/