WST 798-2022 消毒劑消毒效果定性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn) 應(yīng)用稀釋法-PDF解密

ICS11.080CCSC59WS中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)Qualitativetestingstandardondisinfectioneffectofdisinfectant——usediluti中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布IWS/T798—2022前言 II 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14試驗(yàn)材料 15染菌載體的制備 26中和劑鑒定試驗(yàn) 37殺菌試驗(yàn) 58結(jié)果判定 59注意事項(xiàng) 6附錄A（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基和試劑 7WS/T798—2022本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家衛(wèi)生健康標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)消毒標(biāo)準(zhǔn)專業(yè)委員會(huì)負(fù)責(zé)技術(shù)審查和技術(shù)咨詢，由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)性和格式審查，由國(guó)家衛(wèi)生健康委綜合監(jiān)督局負(fù)責(zé)業(yè)務(wù)管理、法規(guī)司負(fù)責(zé)統(tǒng)籌管理。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：北京市疾病預(yù)防控制中心、中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所、中國(guó)人民解放軍疾病預(yù)防控制中心。1WS/T798—2022消毒劑消毒效果定性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用稀釋法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了消毒劑消毒效果定性試驗(yàn)應(yīng)用稀釋法的試驗(yàn)材料、染菌載體的制備、中和劑鑒定試驗(yàn)、殺菌試驗(yàn)、結(jié)果判定和注意事項(xiàng)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于消毒劑對(duì)光滑硬質(zhì)物體表面的實(shí)驗(yàn)室定性消毒效果評(píng)價(jià)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本標(biāo)準(zhǔn)必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。WS/T683消毒試驗(yàn)用微生物要求3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1應(yīng)用稀釋法usedilutionmethod采用定性方法評(píng)價(jià)消毒劑對(duì)不銹鋼圓筒載體上試驗(yàn)微生物殺滅效果的檢測(cè)方法。4試驗(yàn)材料4.1試驗(yàn)微生物4.1.1金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)作為細(xì)菌繁殖體中化膿性球菌的代表，試驗(yàn)菌種為ATCC6538。4.1.2銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)作為醫(yī)院感染中常見分離的細(xì)菌繁殖體的代表，試驗(yàn)菌種為ATCC15442。4.1.3腸炎沙門菌(Salmonellaenterica)，試驗(yàn)菌種為ATCC10708。4.2培養(yǎng)基4.2.1傳代培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)肉湯或合成肉湯培養(yǎng)基，用于細(xì)菌傳代培養(yǎng)，見附錄A。4.2.2中和試驗(yàn)培養(yǎng)基4.2.2.1基礎(chǔ)培養(yǎng)液：營(yíng)養(yǎng)肉湯或液體硫乙醇培養(yǎng)基，作為中和試驗(yàn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，見附錄A。2WS/T798—20224.2.2.2中和劑培養(yǎng)液：根據(jù)消毒劑有效成分選擇相應(yīng)中和劑加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基液中制備成為中和劑培養(yǎng)液，中和劑培養(yǎng)液需經(jīng)中和劑鑒定試驗(yàn)驗(yàn)證合格后方可使用。4.2.3其他培養(yǎng)基胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA），用于染菌載體的菌落計(jì)數(shù)，見附錄A.5。4.3其他試劑和材料4.3.1磷酸鹽緩沖液(見附錄A.6)。4.3.2標(biāo)準(zhǔn)硬水(見附錄A.7)。4.3.3有機(jī)干擾物：采用3%牛血清白蛋白；如為清潔物品采用0.3%牛血清白蛋白。4.3.4載體：304不銹鋼圓筒，表面拋光，外徑8mm±1mm，內(nèi)徑6mm±1mm，壁厚1mm±0.5mm，長(zhǎng)度10mm±1mm。4.3.5吊鉤：長(zhǎng)度為50mm～75mm，直徑為0.5mm的鎳鉻合金絲，末端3mm呈直角彎曲。4.3.6濾紙：直徑為90mm的定性濾紙。4.3.7器皿：25mm×100mm玻璃試管，直徑為90mm的平皿，10mL吸管，移液器等。4.4儀器設(shè)備Ⅱ級(jí)及以上生物安全柜、恒溫培養(yǎng)箱、振蕩培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、計(jì)時(shí)器等。5染菌載體的制備5.1載體準(zhǔn)備5.1.1外觀檢查載體經(jīng)肉眼觀察合格，方可使用。如有可見破損如鈍化、缺口、凹陷或鑿孔等應(yīng)剔除。5.1.2清洗將載體置于1mol/LNaOH溶液中浸泡約12h，用去離子水反復(fù)沖洗3次～4次，收集沖洗水加入2滴~3滴1%酚酞溶液，如酚酞變?yōu)榉奂t色，表明有NaOH殘留，需要繼續(xù)沖洗至酚酞不變色，將載體晾干后密閉保存。5.1.3篩選測(cè)試5.1.3.1測(cè)試要求未使用過或使用過但試驗(yàn)中無菌生長(zhǎng)的載體，不需進(jìn)行篩測(cè)試，經(jīng)壓力蒸汽滅菌后可使用。使用過的載體且在試驗(yàn)中有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行篩選測(cè)試，測(cè)試合格方可使用。5.1.3.2測(cè)試方法按照7.1規(guī)定，在無有機(jī)干擾物條件下，選用500mg/L苯扎氯銨消毒液對(duì)銅綠假單胞菌消毒作用10min，以Letheen肉湯作為中和劑培養(yǎng)液，對(duì)每個(gè)載體進(jìn)行殺菌試驗(yàn)。5.1.3.3測(cè)試結(jié)果判斷無菌生長(zhǎng)為載體篩選測(cè)試合格，測(cè)試管中有菌生長(zhǎng)，則該載體不合格。3WS/T798—20225.1.4滅菌載體染菌前，將清洗后的載體放入試管中，加入去離子水至載體完全浸沒，經(jīng)壓力蒸汽滅菌后，冷卻至室溫備用。5.2菌懸液的制備5.2.1參照WS/T683的規(guī)定復(fù)蘇菌種，接種于含10mL營(yíng)養(yǎng)肉湯或合成肉湯的試管中，經(jīng)36℃±1℃,200r/min±20r/min振蕩培養(yǎng)24h±2h，此為第1代培養(yǎng)物。5.2.2用移液器取第1代培養(yǎng)物10μL轉(zhuǎn)種于含10mL營(yíng)養(yǎng)肉湯或合成肉湯的試管中，經(jīng)36℃±1℃,200r/min±20r/min振蕩培養(yǎng)24h±2h，此為第2代培養(yǎng)物，可繼續(xù)傳代培養(yǎng)至第5代。5.2.3用移液器取第1～5代的24h新鮮培養(yǎng)物10μL轉(zhuǎn)種于10個(gè)含10mL營(yíng)養(yǎng)肉湯或合成肉湯的試管中，經(jīng)36℃±1℃靜置培養(yǎng)48h～56h后備用。5.2.4銅綠假單胞菌培養(yǎng)物應(yīng)去除培養(yǎng)菌液表面的菌膜，或使用10mL吸管直接從溶液中部吸取菌液，放入另一個(gè)試管中。不可使用含菌膜的菌懸液進(jìn)行試驗(yàn)。5.2.5將金黃色葡萄球菌、腸炎沙門菌和去除菌膜的銅綠假單胞菌培養(yǎng)菌液用電動(dòng)混勻器振蕩混合20s，室溫靜置10min后，用10mL吸管吸取上層四分之三的菌液轉(zhuǎn)移至新的試管中混勻，以去除細(xì)菌碎片和團(tuán)塊，菌懸液于4℃冷藏保存?zhèn)溆?，?0min內(nèi)使用。5.2.6根據(jù)消毒劑的檢測(cè)要求，按照WS/T683的規(guī)定加入有機(jī)干擾物。5.3載體染菌5.3.1每次試驗(yàn)時(shí)取80個(gè)無菌載體染菌，首先向4個(gè)無菌試管（25mm×100mm）中分別加入20mL制備好的菌懸液，依次向每管菌液中加入20個(gè)干燥無菌載體，確保載體完全浸沒于菌液中，持續(xù)15min±2min。5.3.2用滅菌后的吊鉤取出載體，輕觸管壁去除多余菌液，垂直放置于無菌的雙層濾紙上，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)干燥40min±2min后，于2h內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。5.4染菌載體菌落計(jì)數(shù)5.4.1隨機(jī)挑選2個(gè)染菌載體，分別放入2個(gè)含10mL營(yíng)養(yǎng)肉湯的50mL離心管中，用電動(dòng)混勻器劇烈振蕩混勻20s進(jìn)行洗脫，使用磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行10倍系列稀釋。5.4.2選擇適宜的稀釋度,吸取1mL加入無菌平皿中，將冷卻至40℃~45℃的熔化營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，傾注于平皿中，平行接種于2個(gè)平皿，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±2h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。5.4.3每個(gè)染菌載體上金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的回收菌量為1.0×106CFU/載體～1.0×107CFU/載體，腸炎沙門菌的回收菌量為1.0×105CFU/載體～1.0×106CFU/載體。6中和劑鑒定試驗(yàn)6.1試驗(yàn)原則通過中和劑鑒定試驗(yàn)結(jié)果，判斷所選中和方法對(duì)消毒劑是否有效中和。若中和Ⅰ組顯示可有效中和，則僅使用中和劑培養(yǎng)液進(jìn)行中和。若中和Ⅰ組結(jié)果顯示未完全中和，而中和Ⅱ組為有效中和，則在選用中和劑培養(yǎng)液進(jìn)行中和的基礎(chǔ)上，再使用培養(yǎng)液進(jìn)行二次中和。如仍顯示未完全中和，則繼續(xù)進(jìn)行中和Ⅱ組試驗(yàn)。試驗(yàn)重復(fù)三次。6.2菌懸液的稀釋4WS/T798—20226.2.1取1mL制備好的菌懸液加入9mL磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行10倍梯度稀釋，取4個(gè)稀釋梯度（舉例：10-4、10-5、10-6和10-7）進(jìn)行中和試驗(yàn)。6.2.2同時(shí)取4個(gè)稀釋梯度各1.0mL采用傾注法接種于TSA平板中，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±2h后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。6.3中和Ⅰ組6.3.1試驗(yàn)中所用消毒劑的濃度應(yīng)以殺菌試驗(yàn)中使用的最高濃度為準(zhǔn)。6.3.2選取4個(gè)無菌載體加入10mL消毒劑溶液中，作用至規(guī)定時(shí)間后，用滅菌后的吊鉤取出載體，輕觸管壁去除多余消毒液，分別轉(zhuǎn)移至4管含有10mL中和劑培養(yǎng)液的試管中。6.3.3向上述4管中和劑培養(yǎng)液中分別接種0.1mL4個(gè)稀釋梯度（10-4、10-5、10-6和10-7）的菌液，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±2h。6.4中和Ⅱ組6.4.1重復(fù)6.3.1和6.3.2，載體在中和劑培養(yǎng)液中室溫靜置30min后，用滅菌后的吊鉤取出載體，輕觸管壁去除多余液體，分別轉(zhuǎn)移至4管含10mL基礎(chǔ)培養(yǎng)液的試管中。6.4.2向上述4管培養(yǎng)液中分別接種0.1mL4個(gè)稀釋梯度（10-4、10-5、10-6和10-7）的菌液，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±2h。6.5陽性對(duì)照未暴露于消毒劑的中和劑培養(yǎng)液和基礎(chǔ)培養(yǎng)液各4管，分別接種0.1mL4個(gè)稀釋梯度（10-4、10-5、10-6和10-7）的菌液，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±2h，作為陽性對(duì)照。6.6陰性對(duì)照中和劑培養(yǎng)液和基礎(chǔ)培養(yǎng)液各1管加入無菌載體，不接種菌液，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±2h，作為陰性對(duì)照。6.7結(jié)果判定6.7.1菌懸液濃度菌懸液計(jì)數(shù)最后兩個(gè)稀釋梯度（如10-6和10-7至少有一個(gè)稀釋梯度的菌懸液的數(shù)量在5CFU/mL~100CFU/mL范圍內(nèi)。6.7.2陽性對(duì)照基礎(chǔ)培養(yǎng)液管有菌生長(zhǎng)表明試驗(yàn)菌、培養(yǎng)液性能良好，中和劑培養(yǎng)液管有菌生長(zhǎng)表明中和劑對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)無明顯影響。6.7.3陰性對(duì)照應(yīng)無菌生長(zhǎng)。6.7.4中和Ⅰ組接種菌量較低（5CFU/mL～100CFU/mL）的中和劑培養(yǎng)液管中有菌生長(zhǎng)，認(rèn)定為中和劑可有效中和消毒劑，且中和產(chǎn)物對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)無明顯影響。若無菌生長(zhǎng)或僅在接種高濃度菌液的試管中生長(zhǎng)表明未完全中和，或中和產(chǎn)物有抑菌作用，需進(jìn)行中和II組試驗(yàn)。5WS/T798—20226.7.5中和Ⅱ組接種菌量較低（5CFU/mL～100CFU/mL）的培養(yǎng)液中有菌生長(zhǎng)認(rèn)為中和有效。7殺菌試驗(yàn)7.1試驗(yàn)步驟7.1.1用標(biāo)準(zhǔn)硬水配制消毒劑溶液至作用濃度，以每管10mL分裝至60個(gè)無菌試管（25mm×100mm）中，置于20℃±1℃水浴中平衡10min。7.1.2用滅菌后的吊鉤以20s±5s間隔依次向每管消毒液中加入一個(gè)染菌載體，加入過程中勿觸碰管壁，輕柔振蕩2～3下后放入于20℃±1℃水浴中。7.1.3消毒作用至規(guī)定時(shí)間后，用滅菌后的吊鉤依次鉤取染菌載體，輕觸管壁去除多余消毒液，轉(zhuǎn)移至10mL中和劑培養(yǎng)液管中，加入時(shí)勿觸碰管壁。7.1.4振蕩混勻，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48h±2h。7.1.5若中和劑鑒定試驗(yàn)結(jié)果顯示中和I組未完全中和，在中和劑培養(yǎng)液中靜置30min后用滅菌后的吊鉤將染菌載體取出后，轉(zhuǎn)移至基礎(chǔ)培養(yǎng)液管中，振蕩混勻后進(jìn)行培養(yǎng)。7.2陽性對(duì)照將未經(jīng)消毒處理的染菌載體2個(gè)，分別放入10mL中和劑培養(yǎng)液和10mL基礎(chǔ)培養(yǎng)液管中振蕩混勻，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48h±2h。7.3陰性對(duì)照將無菌載體2個(gè)分別放入10mL中和劑培養(yǎng)液和10mL基礎(chǔ)培養(yǎng)液中振蕩混勻，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48h±2h。7.4試驗(yàn)次數(shù)試驗(yàn)重復(fù)三次。8結(jié)果判定陽性對(duì)照管應(yīng)有菌生長(zhǎng)，陰性對(duì)照管應(yīng)無菌生長(zhǎng)。消毒劑標(biāo)注的消毒對(duì)象為光滑硬質(zhì)物體表面時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的三次重復(fù)殺滅效果均應(yīng)達(dá)到表1的要求，即金黃色葡萄球菌的殺滅試驗(yàn)，陽性管數(shù)為0～3個(gè)，且陽性對(duì)照菌量對(duì)數(shù)值為6～7時(shí)，判定為合格，銅綠假單胞菌的殺滅試驗(yàn)，陽性管數(shù)為0～6個(gè)，且陽性對(duì)照菌量對(duì)數(shù)值為6～7時(shí)，判定為合格。表1消毒劑應(yīng)用稀釋法對(duì)微生物殺滅效果的判定6WS/T798—2022滅試驗(yàn)，也應(yīng)符合陽性管數(shù)為0～1個(gè)，且陽性對(duì)照菌量9注意事項(xiàng)9.1金黃色葡萄球菌在試驗(yàn)中可使用營(yíng)養(yǎng)肉湯或液體硫乙醇培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，Letheen肉湯對(duì)金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用。9.2同一消毒劑擬對(duì)多種微生物進(jìn)行殺滅試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)按微生物種類分別進(jìn)行中和劑鑒定試驗(yàn)。9.3染菌載體轉(zhuǎn)移至消毒劑管時(shí)應(yīng)避免觸碰管壁，嚴(yán)格無菌操作，操作中產(chǎn)生的微生物氣溶膠可能導(dǎo)致測(cè)試管假陽性。9.4在結(jié)果判定時(shí)，如培養(yǎng)液未出現(xiàn)混濁，但發(fā)生顏色變化或出現(xiàn)膜狀物，應(yīng)與陽性對(duì)照對(duì)比來判定結(jié)果，并進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定。9.5殺菌試驗(yàn)中試驗(yàn)組有菌生長(zhǎng)時(shí)，可隨機(jī)挑選陽性管進(jìn)行鑒定，以排除污染。7WS/T798—2022（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基和試劑A.1營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基蛋白胨牛肉膏氯化鈉蒸餾水加至5.0g5.0g1000mL以上各成分蒸餾水溶解，調(diào)pH至7.2～7.4，于121℃壓力蒸汽滅菌20min備用。A.2合成肉湯培養(yǎng)基L-胱氨酸0.05gDL-蛋氨酸0.37gL-精氨酸0.40gDL-組氨酸0.30gL-賴氨酸0.85gL-酪氨酸0.21gDL-蘇氨酸0.50gDL-纈氨酸L-亮氨酸0.80gDL-異亮氨酸0.44g氨基乙酸0.06gDL-絲氨酸0.61gDL-丙氨酸0.43gL-谷氨酸L-天冬氨酸0.45gDL-苯丙氨酸0.26gDL-色氨酸0.05g8WS/T798—2022L-脯氨酸0.05g氯化鈉3.00g氯化鉀0.20g硫酸鎂0.05g磷酸二氫鉀1.50g磷酸氫二鈉4.00g鹽酸硫胺素0.01g煙酰胺0.01g蒸餾水加至1000mL以上各成分蒸餾水溶解，調(diào)pH至6.9～7.3，于121℃壓力蒸汽滅菌20min，冷卻至室溫后，加入0.1mL無菌10%葡萄糖溶液備用。A.3液體硫乙醇培養(yǎng)基酪蛋白胨15.0g酵母粉5.0g葡萄糖5.0g硫乙醇酸鈉0.5gL-胱氨酸