常見問題分析及解決策略

關于常見問題分析及解決策略PCR技術簡介PCR常見問題、原因分析及其解決方案提高PCR反應特異性的策略臨床PCR檢測的常見問題定量PCR常見問題第2頁,共27頁，2024年2月25日，星期天PCR標準反應體系DNA模板引物反應緩沖液Mg2＋濃度

dNTPsdH2O

耐熱聚合酶第3頁,共27頁，2024年2月25日，星期天反應體系對PCR擴增的影響DNA模板純度蛋白、多糖、酚類等雜質會抑制PCR反應完整性

模板降解會導致PCR擴增無產(chǎn)物濃度加量過多導致非特異性擴增增加引物特異性長度適當、避免二級結構和二聚體完整性避免反復凍融濃度應適當,過高導致非特異性增加,

過低則擴增產(chǎn)物太少第4頁,共27頁，2024年2月25日，星期天反應體系對PCR擴增的影響過高非特異性嚴重過低無擴增產(chǎn)物濃度適當避免反復凍融pH值適當避免污染pH值,鹽離子濃度穩(wěn)定劑,增強劑反應緩沖液dNTPsdH2OMg2＋濃度第5頁,共27頁，2024年2月25日，星期天如何選擇最合適的DNA聚合酶PCR用耐熱DNA聚合酶Taq酶pfu酶HotstartTaq酶混合酶Taq

plusLongTaqTaqplatinum第6頁,共27頁，2024年2月25日，星期天特異性-----基因組擴增、RT-PCR保真性-----基因篩選、測序、克隆長片段擴增-----構建基因圖譜、測序等擴增效率-----復雜模板擴增（GC含量高、二級結構）PCR試劑盒-----復雜模板擴增、大規(guī)模基因檢測如何選擇最合適的DNA聚合酶-----根據(jù)PCR實驗需求第7頁,共27頁，2024年2月25日，星期天PCR常見問題之一-----無擴增產(chǎn)物現(xiàn)象：正對照有條帶，而樣品則無

M12正對照原因模板含有抑制物，含量低Buffer對樣品不合適引物設計不當或者發(fā)生降解反應條件：退火溫度太高，延伸時間太短純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量更換Buffer或調整濃度重新設計引物（避免鏈間二聚體和鏈內二級結構）或者換一管新引物降低退火溫度、延長延伸時間對策第8頁,共27頁，2024年2月25日，星期天PCR常見問題之二-----非特異性擴增現(xiàn)象：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。原因對策引物特異性差模板或引物濃度過高酶量過多Mg2+濃度偏高退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過多重新設計引物或者使用巢式PCR適當降低模板或引物濃度適當減少酶量降低鎂離子濃度適當提高退火溫度或使用二階段溫度法減少循環(huán)次數(shù)第9頁,共27頁，2024年2月25日，星期天PCR常見問題之三-----拖尾現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)M12原因對策模板不純Buffer不合適退火溫度偏低酶量過多dNTP、Mg2+濃度偏高循環(huán)次數(shù)過多純化模板更換Buffer適當提高退火溫度適量用酶適當降低dNTP和鎂離子的濃度減少循環(huán)次數(shù)第10頁,共27頁，2024年2月25日，星期天PCR常見問題之四-----假陽性現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物原因靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染對策操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外；除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應一次性使用。各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存。第11頁,共27頁，2024年2月25日，星期天提高PCR反應特異性策略巢式PCR（Nest-PCR）

遞減PCR（TouchDownPCR）

熱啟動PCR（HotStartPCR）

使用PCR增強劑第12頁,共27頁，2024年2月25日，星期天策略之一巢式PCRPF1PR1PF2PR2

巢式PCR的使用降低了擴增多個靶位點的可能性，因為同多套引物都互補的靶序列很少。

巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的靈敏度，并且提高了困難PCR（如5'RACE）的特異性。

第13頁,共27頁，2024年2月25日，星期天策略之二遞減PCR

遞減PCR通過在PCR的前幾個循環(huán)使用嚴謹?shù)耐嘶饤l件提高特異性。循環(huán)設在比估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開始，然后每個循環(huán)降低1-2℃,直到退火溫度低于Tm5℃。特異性最高的目的模板會被優(yōu)先擴增，這些產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴增占據(jù)優(yōu)勢。遞減PCR對于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更為有用，如AFLP、DNA指紋分析等。第14頁,共27頁，2024年2月25日，星期天策略之三熱啟動PCR

熱啟動主要是通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達到變性溫度；現(xiàn)在有很多公司都有HotStartTaq酶出售，該酶具有熱啟動的性能，使用簡單方便，適合于高通量應用；熱啟動PCR是除了好的引物設計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。第15頁,共27頁，2024年2月25日，星期天策略之四使用PCR增強劑

甲酰胺、DMSO、甘油、甜菜堿等都可充當PCR的增強劑。其可能的機理是降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助DNA聚合酶延伸通過二級結構區(qū)。增強劑濃度要適當。第16頁,共27頁，2024年2月25日，星期天熒光定量PCR常見問題熒光定量PCR擴增效率確認：相關系數(shù)（R2）：大于0.98標準曲線斜率：-3~-3.5PCR擴增效率（E）：0.9~1.2重復性好：STD＜0.2特異性好第17頁,共27頁，2024年2月25日，星期天熒光定量PCR常見問題無Ct值（信號）出現(xiàn)或出現(xiàn)過晚：陰性對照出現(xiàn)明顯的擴增：熒光PCRmix或水污染；出現(xiàn)引物二聚體：設計特異性引物。反應循環(huán)數(shù)不夠；檢測熒光信號步驟有誤；引物、探針設計不佳或降解；模板量少或降解。反應條件或體系不佳：優(yōu)化；擴增片段過長：100~200bp。第18頁,共27頁，2024年2月25日，星期天熒光定量PCR常見問題溶解曲線不止一個主峰：引物設計不佳：設計特異性引物；引物濃度不適：降低引物濃度；退火溫度低：調整退火溫度；鎂離子濃度過高：降低鎂離子濃度；模板中有基因組污染：注意提取過程；耗材儀器不匹配；反應體系污染等：設置陽性陰性對照。第19頁,共27頁，2024年2月25日，星期天熒光定量PCR常見問題擴增效率低：重復性不好：反應體系中部分成分尤其是熒光染料降解；反應條件不佳：延長退火、延伸時間，改為三步法，降低退火溫度，提高引物濃度，重新設計引物；反應體系中有抑制物：一般為模板引入。加樣不準確；儀器溫度均一性不好；模板濃度低。第20頁,共27頁，2024年2月25日，星期天熒光定量PCR常見問題擴增曲線不正常：基線等設置不當：減小基線終點；模板量過多：將模板稀釋。第21頁,共27頁，2024年2月25日，星期天臨床PCR檢測的常見問題假陽性問題假陰性問題定量問題方法學問題：靶基因序列特異性、引物錯配、非特異性擴增污染問題：樣本污染、產(chǎn)物污染試劑因素操作因素儀器因素標本因素外標定量與內標定量第22頁,共27頁，2024年2月25日，星期天臨床PCR檢測常見問題解決辦法嚴格區(qū)分及實驗人員培訓；使用UNG技術。假陽性解決辦法：假陰性解決辦法：設置陽性對照監(jiān)測試劑問題；降低操作難度，提高操作人員素質；陽性對照、標準曲線或使用內對照監(jiān)控儀器故障；使用抗干擾能力強的試劑提取樣本DNA。第23頁,共27頁，2024年2月25日，星期天臨床PCR檢測常見問題解決辦法外標定量與內標定量：第24頁,共27頁，2024年2月25日，星期天RT常見問題

第25頁,共27頁，2024年2月25日，星期天RNA降解或起始量少RNA含抑制成分