GB-T《蛋白酶K酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法》

ICS07.080

B20/39

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

GB/TXXXXX—201X

蛋白酶K酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法

DetectionmethodofactivityandimpurityofproteinaseK

（征求意見稿）

201X-XX-XX發(fā)布201X-XX-XX實(shí)施

中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局

中國國家標(biāo)準(zhǔn)1化管理委員會(huì)

發(fā)布

GB/T××××—201×

GB/T××××—201×

蛋白酶K酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了蛋白酶K檢測(cè)原理、儀器設(shè)備及器具、主要試劑、分析步驟和結(jié)果分析。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于生化試劑蛋白酶K產(chǎn)品的生產(chǎn)、監(jiān)督和檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB/Txxxx核糖核酸酶活力檢測(cè)

GB/Txxxx脫氧核糖核酸酶活力檢測(cè)

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

蛋白酶K（proteinaseK）

能水解天然角蛋白（keratin）的一種絲氨酸蛋白酶。

3.2

蛋白酶K酶活力單位（proteinaseKactivityunit）

在57℃和pH8.0條件下，在1min內(nèi)水解血紅蛋白產(chǎn)生相當(dāng)于1μmol酚基氨基酸（由酪氨酸等同物表

示）的酶量，為一個(gè)酶活力單位，以U表示。

4原理

蛋白酶K具有很高的水解活性，可催化脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵斷裂。它在57℃和

pH8.0條件下，水解血紅蛋白底物產(chǎn)生含有酚基的氨基酸；在堿性條件下，可將福林（Folin）試劑還原，

生成鉬藍(lán)與鎢藍(lán)，其顏色的深淺與酚基氨基酸含量成正比。通過在680nm測(cè)定其吸光度，得到酶解產(chǎn)生的

酚基氨基酸的量，進(jìn)而計(jì)算蛋白酶活力。

5儀器設(shè)備及器具

5.1恒溫水浴鍋：精度為±0.2℃。

5.2pH計(jì)：精度為0.1pH單位。

5.3分光光度計(jì)：波長(zhǎng)范圍380~780nm，吸光度值精確至0.001。

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GB/T××××—201×

5.4比色皿：1cm。

5.5電子天平：精度為0.0001g和0.01g。

5.6高速離心機(jī)：最小離心力為8000×g，具1.5mL離心管。

6主要試劑

本方法所用試劑均為分析純，除特殊說明外，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T6882規(guī)定的二級(jí)水。

6.10.01mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液（Tris-HCl），pH8.0

稱取三羥甲基氨基甲烷（Tris）12.11g，加入適量水使其溶解，定容至100mL，用濃鹽酸調(diào)至pH8.0，

即成1mol/LTris-HCl緩沖液。再取1mL1mol/LTris-HCl緩沖液，加水定容至100mL，即成0.01mol/L

Tris-HCl緩沖液。

6.20.4mol/L三氯乙酸溶液

稱取三氯乙酸65.40g，用水溶解并定容至1000mL。

6.31mol/LHCl溶液

取8.50mL濃鹽酸加入到50mL水中稀釋，然后定容至100mL，得1mol/LHCl溶液。

6.40.1mol/LHCl溶液

取10.00mL1mol/LHCl溶液加水定容至100mL，得0.1mol/LHCl溶液。

6.51%（w/v）血紅蛋白溶液

準(zhǔn)確稱取血紅蛋白1.000g，用0.01mol/LpH8.0的Tris-HCl緩沖液溶解，并定容至100mL。此溶液在

4℃冰箱貯存，有效期為3天。

6.60.4mol/L碳酸鈉溶液

稱取無水碳酸鈉42.40g，用水溶解并定容至1000mL。

6.7福林（Folin）試劑

于2000mL磨口回流裝置加入鎢酸鈉（Na2WO4.2H2O）100.0g、鉬酸鈉（Na2MoO4.2H2O）25.0g、水

700mL、85%磷酸50mL、濃鹽酸100mL。小火沸騰回流10h。取下回流冷卻器，在通風(fēng)櫥中加入硫酸鋰

（Li2SO4）50g、水50mL和數(shù)滴濃溴水。再微沸15min，以除去多余的溴，至冷卻后無綠色。加水定容

至1000mL。混勻，過濾。試劑應(yīng)呈金黃色。貯存于棕色瓶?jī)?nèi)，避光保存。使用時(shí)，用1份福林試劑與2

份水混勻，制成稀福林試劑。也可將商品化福林試劑按照產(chǎn)品使用指南稀釋成稀福林試劑。

6.8100μg/mLL-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液

稱取預(yù)先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，用20mL1mol/LHCl溶液溶解后，再用水定容至

100mL，即為1mg/mLL-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，在4℃冰箱貯存。臨用前，吸取1mg/mLL-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)

備溶液10.00mL，用0.1mol/L鹽酸溶液定容至100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。

7分析步驟

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7.1核糖核酸酶（RNase）

按GB/Txxxx-201x進(jìn)行檢測(cè)。

7.2脫氧核糖核酸酶（DNase）

按GB/Txxxx-201x進(jìn)行檢測(cè)。

7.3酶活力

7.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按表1，在10mL容量瓶中配制L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

表1L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制

管號(hào)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液100μg/mL酪氨酸標(biāo)水（mL）

的濃度（μg/mL）準(zhǔn)溶液（mL）

00.00.0010.00

110.01.009.00

220.02.008.00

330.03.007.00

440.04.006.00

550.05.005.00

660.06.004.00

分別吸取L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1.0mL于具塞試管中（每個(gè)濃度作2個(gè)平行），然后加入5.0mL碳

酸鈉溶液和1.0mL稀福林試劑，混勻。將標(biāo)準(zhǔn)管同時(shí)置于40℃水浴，反應(yīng)20min，取出，用冷水迅速冷

卻至室溫，用分光光度計(jì)，在680nm波長(zhǎng)下，以不含酪氨酸的0號(hào)管為空白，用1cm比色皿，測(cè)定吸光

度（A）。

以吸光度A為縱坐標(biāo)，以L-酪氨酸的濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（此線應(yīng)通過零點(diǎn)）。得出線

性回歸方程和回歸系數(shù)（R2）。回歸系數(shù)在0.9990及以上時(shí)，方可使用，否則應(yīng)重做。

新配制的福林試劑應(yīng)制作新的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

7.3.2固體待測(cè)樣品制備

稱取0.0050g固體酶，精確至0.0001g，用0.01mol/LpH8.0的Tris-HCl緩沖液溶解，并稀釋至酶濃

度曲線中呈線性關(guān)系的酶濃度范圍內(nèi)。

7.3.3液體待測(cè)樣品制備

吸取100μL液體酶，用0.01mol/LpH8.0的Tris-HCl緩沖液稀釋至酶濃度曲線中呈線性關(guān)系的酶濃度

范圍內(nèi)。

7.3.4測(cè)定

取3支10mL具塞試管，樣品空白管1支，樣品管2支。分別向3支試管中準(zhǔn)確加入稀釋好的待測(cè)酶

液1.0mL，在57℃下水浴預(yù)熱5min。向2支樣品管中加入1.0mL經(jīng)同樣預(yù)熱的1%血紅蛋白溶液，準(zhǔn)確

計(jì)時(shí)反應(yīng)10min；迅速、準(zhǔn)確地向3支試管中加入2.0mL0.4mol/L三氯乙酸溶液；于樣品空白管中加入

1.0mL1%血紅蛋白溶液，混勻。3支試管繼續(xù)在57℃下水浴10min，取出，迅速冷卻至室溫，11000×g

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GB/T××××—201×

離心5min。

另取3支10ml具塞試管，樣品空白管1支，樣品管2支，分別吸取上述相應(yīng)上清液1.0mL于3支試

管，然后均加入5.0mL碳酸鈉溶液、1.0mL稀福林試劑，混勻，40℃水浴20min顯色。迅速冷卻至室溫。

與此同時(shí)，另取1支試管，用水代替上清液做試劑空白，均加入5.0mL碳酸鈉溶液、1.0mL稀福林試劑，

混勻，40℃水浴20min顯色，迅速冷卻至室溫。

以試劑空白管調(diào)儀器零點(diǎn)，用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)680nm下，用1cm比色皿，分別測(cè)定樣品空白管（A0）

和樣品管中樣液的吸光度（A）。將樣品管與樣品空白管吸光度之差取平均值，經(jīng)線性回歸方程求解生成

的酪氨酸濃度（C-C0）。

8結(jié)果分析

8.1酶活力計(jì)算

按照式（1）計(jì)算：

C-C4N

0....................