（高清版）WST 360-2024 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群指南

WSWS/T360—2024GuidelineforenumerationofperipheralbloodlymphocytesubsetsbyflowcytometryWS/T360—2024I——增加了流式細(xì)胞儀性能驗(yàn)證內(nèi)容(見5.1)；——完善了儀器質(zhì)量控制和項(xiàng)目性能驗(yàn)證內(nèi)容(見5.2、7.2.2)；——梳理和保留了檢驗(yàn)前、檢驗(yàn)中、檢驗(yàn)后過程的內(nèi)容及要求(見第6、7、8章)；——?jiǎng)h減了標(biāo)本采集和處理及臨床意義內(nèi)容（見2011年版的第4、10章——增加了淋巴細(xì)胞亞群六色分析方案(見4.1.3、附錄C)。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院、北京醫(yī)院/國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心、北京大學(xué)WS/T360—20241流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群指南本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群：T淋巴細(xì)胞（包括CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞）、B本標(biāo)準(zhǔn)適用于醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室開展流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本標(biāo)準(zhǔn)必不可少的條款。其中，注日期的引用文細(xì)胞分化抗原clusterofdifferentia注2:已被命名的抗體有指定的CD編號(hào)，被特定抗體識(shí)別的特定抗原通常具有相同的編號(hào)。例如，被“抗CD1抗體”光學(xué)檢測(cè)器在入射光的直角處所收集的細(xì)胞散射WS/T360—20242幾何平均（GeometricMean）和中位熒光強(qiáng)度（Medianfluores注1:SI通過陽(yáng)性細(xì)胞群平均熒光強(qiáng)度（MFI）與陰性細(xì)胞群MFI的差，除以陰性細(xì)胞群熒光強(qiáng)度的2倍標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算而熒光補(bǔ)償fluorescencecompen其他熒光信號(hào)中扣除已測(cè)定熒光信號(hào)的一部分從而糾正發(fā)射波長(zhǎng)重疊造成的計(jì)數(shù)錯(cuò)誤的過一種表面結(jié)合特定熒光染料或內(nèi)部包含一種或多種的線性、靈敏度和檢測(cè)水平，也可用來檢測(cè)抗體結(jié)合量或抗原密度。2）標(biāo)準(zhǔn)微球：大小一致、熒光強(qiáng)度與染色細(xì)胞相似的微球，用于檢測(cè)通道的電壓設(shè)置和熒光補(bǔ)償設(shè)置。3）絕對(duì)計(jì)數(shù)微球：已知數(shù)量或濃度的熒光微注:相對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)單位：%用于測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量的一種方法。結(jié)果來源于流式細(xì)胞儀和另一種儀器注:另一種儀器通常是血細(xì)胞分析儀。采用流式細(xì)胞儀獲取靶細(xì)胞群中目的細(xì)胞亞群的比例（如淋巴細(xì)胞中CD4+T4試劑和檢測(cè)系統(tǒng)的選擇WS/T360—202434.1熒光素標(biāo)記的單克隆抗體分化抗原CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD56。淋巴細(xì)胞亞群臨床檢測(cè)試劑應(yīng)符合國(guó)家醫(yī)療器械4.1.1單克隆抗體的細(xì)胞抗原識(shí)別CD45為白細(xì)胞共同抗原，主要表達(dá)于白細(xì)胞；CD3為T淋巴細(xì)胞共同抗原，主要表達(dá)于成熟T淋巴細(xì)），細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CD8+T細(xì)胞）和少部分NK細(xì)胞等；CD19通常表達(dá)于B淋巴細(xì)胞和少量漿細(xì)胞；CD16表達(dá)于NK細(xì)胞、粒細(xì)胞、部分單核/樹突狀細(xì)胞等；CD56表達(dá)于NK細(xì)胞和細(xì)胞毒T4.1.2淋巴細(xì)胞亞群的鑒定抗體細(xì)胞某一亞群，應(yīng)采用聯(lián)合CD45、CD3和多種抗體組合共同標(biāo)記來鑒定淋巴細(xì)胞亞群。采用CD45作為設(shè)門抗體，兼做質(zhì)控試劑。CD45聯(lián)合SSC設(shè)門圈取淋巴細(xì)胞，盡可能排除其他細(xì)胞或顆粒干擾，門內(nèi)淋巴4.1.3組合抗體常用熒光染料藻紅蛋白-花青素5（PE-Cy5）或多甲藻葉綠素蛋白（PerCP）、藻紅蛋白-德州紅偶聯(lián)物（ECD）或別藻別藻青蛋白-花青素7（APC-Cy7）等。選擇聯(lián)合CD45的六色方案進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)時(shí)，宜使用但不限于配置有488nm和633nm/635nm/640nm激光器且有可接收六色熒光信號(hào)檢測(cè)通道4.2溶血素WS/T360—20244驗(yàn)室制定的評(píng)估要求，才可使用非配套溶血素或自配的溶血4.3絕對(duì)計(jì)數(shù)微球（2℃~8℃)避光保存，保存時(shí)間參考本標(biāo)準(zhǔn)第5.2.2.2.2條處理后標(biāo)本穩(wěn)定性的驗(yàn)證結(jié)果。5.1流式細(xì)胞儀的性能驗(yàn)證5.1.2.1靈敏度采用已知大小的校準(zhǔn)微球檢測(cè)儀器的FSC和SSC。在散射光FSC/SSC散點(diǎn)圖上，應(yīng)ofEquivalentSolubleFluorochrome，ME光源進(jìn)行檢測(cè)，其中FITC、PE及APC等通道的平均熒光強(qiáng)度（x）與其熒光分子數(shù)（y）分別進(jìn)行雙對(duì)數(shù)線性回歸，得公式y(tǒng)=a+bx，其截距a的反對(duì)數(shù)值即為流式細(xì)胞儀的熒光靈敏度。FITC的熒光靈敏度應(yīng)≤200MESF、PE的熒光靈敏度應(yīng)≤100MESF、APC5.1.2.2分辨率采用EDTA鹽或肝素抗凝全血，取適量樣品稀釋后直接上機(jī)測(cè)定，標(biāo)本在FSC/SSC散點(diǎn)圖可將紅細(xì)胞和血小板清晰地區(qū)分開；取適量樣品裂解紅細(xì)胞后上機(jī)測(cè)定，標(biāo)本在FSC/SSC散點(diǎn)圖可將淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞清晰地區(qū)分開，即認(rèn)為散射光分辨率符合要求。示意圖參見附錄采用校準(zhǔn)微球上機(jī)測(cè)定，各熒光通道的分辨率CV值應(yīng)符合制造商聲明的要WS/T360—202455.1.2.3熒光通道線性一種熒光微球的MFI，MFI與已知理論值的相關(guān)系數(shù)r應(yīng)≥0.98，此方法適用于校準(zhǔn)微球上的熒光素可被5.1.2.4儀器穩(wěn)定性連續(xù)開機(jī)條件下，采用熒光微球在開機(jī)穩(wěn)定后0h和8h各檢測(cè)一次檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的各通道MFI值作為基線值，熒光微球8h上機(jī)測(cè)定的每一通道的MFI變化范圍均應(yīng)在5.1.2.5攜帶污染率s，連續(xù)測(cè)試3次，計(jì)算該檢測(cè)通道內(nèi)設(shè)定區(qū)域的顆粒數(shù)，分別記為L(zhǎng)1、L2、L3。按照此步驟重5.2外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)系統(tǒng)的性能驗(yàn)證對(duì)檢測(cè)項(xiàng)目的精密度、穩(wěn)定性、線性范圍、可比性和正確度等參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)5.2.2.1精密度選取至少5個(gè)新鮮全血樣品，樣品的淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)覆蓋低中高水平。每個(gè)標(biāo)品從熒光染色到上機(jī)檢測(cè)重復(fù)3次，并確保所有測(cè)試都在同一臺(tái)儀器的同一批內(nèi)測(cè)定，整個(gè)操作過程由同一個(gè)操作人員完成。先計(jì)算每個(gè)樣品重復(fù)3次后檢測(cè)結(jié)果的CV,然后計(jì)算所有樣品的平均CV，所有樣品的平均CV后據(jù)此計(jì)算每個(gè)全血質(zhì)控品4天的平均CV，最后得出兩個(gè)全血質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果的平均CV。結(jié)果判定同本5.2.2.2穩(wěn)定性驗(yàn)證樣品在確定的抗凝及處置條件下的穩(wěn)定解-固定并上機(jī)測(cè)定，以此結(jié)果作為基線參考水平，按照實(shí)驗(yàn)室的具體環(huán)境溫度控制條件和預(yù)期的樣品WS/T360—20246驗(yàn)證要求的制定應(yīng)考慮不同水平的淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)設(shè)定不同程度的偏差值，淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)過低者，宜以絕對(duì)偏差進(jìn)行驗(yàn)證；亦可對(duì)試劑說明書聲明的穩(wěn)定性條件進(jìn)旨在明確處理后標(biāo)本的最長(zhǎng)待檢時(shí)間。采集的時(shí)間點(diǎn)對(duì)固定后標(biāo)本進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果判定同本標(biāo)準(zhǔn)第5.2.2.2.1條。亦可對(duì)試劑說明書聲明的穩(wěn)5.2.2.3線性范圍5.2.2.4可比性5.2.2.4.1不同檢測(cè)系統(tǒng)間的可比性5.2.2.4.2抗體試劑批次變更前后的可比性驗(yàn)證差值，淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)過低者，宜以絕對(duì)偏差進(jìn)行5.2.2.4.3不同檢測(cè)人員間的可比性相對(duì)偏差或絕對(duì)偏差。驗(yàn)證結(jié)果應(yīng)符合實(shí)驗(yàn)室制定的驗(yàn)證5.2.2.5其他選擇至少20份表觀健康人樣品按照常規(guī)方法進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群參考區(qū)間驗(yàn)血液樣品中可能存在致病性病原微生物，應(yīng)按照可選擇含有乙二胺四乙酸鹽（EDTA）、肝素或枸櫞酸葡萄糖溶液（ACD）抗凝劑的抗凝管采集靜脈WS/T360—20247樣品釆集后應(yīng)即刻檢測(cè)，不能立即檢測(cè)的樣品應(yīng)保存于室溫（18℃~25℃)環(huán)境中，樣品保存時(shí)長(zhǎng)應(yīng)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)第5.2.2.2.1條樣品穩(wěn)定性檢測(cè)數(shù)據(jù)而設(shè)定，EDTA抗凝管釆集的樣品可穩(wěn)定12h～24h，肝素鈉和ACD抗凝管釆集的樣品可穩(wěn)定48h～72h。標(biāo)本在保存和運(yùn)輸中宜盡量減少震動(dòng)。使用雙平臺(tái)的四色方案或六色方案。四色方案中，CD45/CD3/CD4/CD8組合抗體用于同時(shí)檢測(cè)CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞中，CD45/CD3/CD4/CD8/CD19/CD16和CD56組合抗體用于同時(shí)檢測(cè)CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B對(duì)計(jì)數(shù)法宜采用反向加樣法），加入適量熒光標(biāo)記抗體，室根據(jù)溶血素說明書推薦的條件進(jìn)行離心洗滌操作，如300g～500g的離心力離心5min，倒棄上清時(shí)應(yīng)注意避免細(xì)胞流失。單平臺(tái)方法進(jìn)行絕對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)不能洗滌，宜在24h內(nèi)或在產(chǎn)品說明書規(guī)定時(shí)限內(nèi)或參考本標(biāo)準(zhǔn)第5.2.2.2.2條處理后標(biāo)本穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果的允許WS/T360—20248每次開機(jī)后，應(yīng)先進(jìn)行儀器光路/液路穩(wěn)定性及檢測(cè)通道電壓穩(wěn)定性的驗(yàn)證和調(diào)整；驗(yàn)證通過后，熒光補(bǔ)償?shù)尿?yàn)證和調(diào)整。所有驗(yàn)證結(jié)果、室檢測(cè)當(dāng)天宜使用校準(zhǔn)微球進(jìn)行光路/液路穩(wěn)定性驗(yàn)證。記錄每個(gè)檢測(cè)通道的分辨率的變異系數(shù)），20次，使用Levy-Jennings圖建立每個(gè)患者CD4+淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)低至200個(gè)/μL）的復(fù)查樣品（建議選取采樣后24小時(shí)內(nèi)的樣品）進(jìn)檢測(cè)當(dāng)日至少做一次質(zhì)控，并至少包括兩個(gè)濃度水平，CD4+T細(xì)胞的絕對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)包括低值濃度為新批次靶值，結(jié)合既往累計(jì)CV值推算SD。應(yīng)至少選擇13S和22S作為失控判斷標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)有相應(yīng)的失控糾CD45/SSC散點(diǎn)圖設(shè)門前，通過FSC/SSC散點(diǎn)圖做第一步％）7.2.5.3根據(jù)CD45強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞群設(shè)門或圈定區(qū)域（參見附錄B/C）淋巴細(xì)胞群呈現(xiàn)為CD45強(qiáng)陽(yáng)性和低度SSC，設(shè)門時(shí)盡可能包括所有淋巴細(xì)胞，門內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)不應(yīng)弱表達(dá)和中度SSC；嗜堿性粒細(xì)胞群呈現(xiàn)為CD45弱表達(dá)和低WS/T360—20249在CD3/SSC散點(diǎn)圖中，CD3+細(xì)胞群占淋巴細(xì)胞群的百分比為CD3+T細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)?？赏ㄟ^單平在CD4/CD8熒光散點(diǎn)圖中，CD3+CD4-CD8+細(xì)胞群占淋巴細(xì)胞群百分比為CD8+T細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)?？赏ㄟ^單平臺(tái)或雙平臺(tái)方法得出CD8+T細(xì)胞的群占淋巴細(xì)胞群的百分比為CD19+B細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。可通過單平臺(tái)或雙平臺(tái)方法得出CD19+B在CD3/SSC散點(diǎn)圖中對(duì)CD3-細(xì)胞群設(shè)門，在CD16&56/CD19或CD56/CD19熒光散點(diǎn)圖中，CD3-CD16&56+或CD3-CD56+細(xì)胞群占淋巴細(xì)胞群的百分比為CD16&56+或CD56+NK細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。可通過單平臺(tái)或分別在CD3/CD56（或CD3/CD16&56），CD3/CD19，CD3/CD4和CD3/CD8散點(diǎn)圖上形門等，以便明確區(qū)分這些散點(diǎn)圖中的陰性和陽(yáng)B細(xì)胞的CD45表達(dá)較T細(xì)胞稍弱，NK細(xì)胞的CD45表達(dá)強(qiáng)度與T細(xì)胞相似，但SSC信號(hào)較T細(xì)胞強(qiáng)。7.2.6.2T、B和NK細(xì)胞相對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)的一致性T、B和NK細(xì)胞相對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)的總和應(yīng)占淋巴細(xì)胞總數(shù)的100%±5％范圍內(nèi)。某些血液病可能T、BCD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞相對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)的總和宜在CD3+T細(xì)胞相對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)±5％之間，最大變異范圍不超過±10％。如樣品中含有數(shù)量較多的不常見T細(xì)胞亞群（如TCR-γδ+T細(xì)胞，CD3+CD4-CD8-，CD3+CD4+CD8dimT細(xì)胞或CD3+CD4+CD8+T細(xì)胞）時(shí)，樣計(jì)數(shù)差值＞5％時(shí)，應(yīng)重做該樣品，包括重新染色、裂解紅細(xì)胞WS/T360—20247.3室間質(zhì)評(píng)（externalqualityassessm留的分析數(shù)據(jù)和文件以流式細(xì)胞數(shù)據(jù)格式存儲(chǔ)至安全的服務(wù)器或永久存儲(chǔ)介質(zhì)，儲(chǔ)存期限至少2年。數(shù)WS/T360—2024胞（灰色）和血小板（橙色）清晰地區(qū)分開；B采用稀釋后（R3，紫色）、非白細(xì)胞群（R4，藍(lán)色）清晰WS/T360—2024流式細(xì)胞術(shù)四色抗體組合方案檢測(cè)淋巴細(xì)胞Beads:絕對(duì)計(jì)數(shù)微球。圖B.1A在CD45CD4/SSC散點(diǎn)圖中，圈取絕對(duì)計(jì)數(shù)微球數(shù)目。圖B.1C）：在CD）：WS/T360—2024四色抗體組合方案第二管熒光單抗組合CD45/CD3/CD16&圖B.2A）：在CD45/SSC散點(diǎn)圖中，對(duì)CD45+淋巴細(xì)胞群設(shè)門。圖B.2B）：在CDWS/T360—2024流式細(xì)胞術(shù)六色抗體組合方案檢測(cè)淋巴細(xì)胞細(xì)胞設(shè)門。圖C.1B）：在CD19/SSC散點(diǎn)圖中