分子檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)

分子檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)課程講義

一、分子診斷又稱DNA診斷或基因診斷，是通過從生物體（比如疾病患者等）內(nèi)提取樣

本用基因檢測(cè)方法來判斷該生物體是否有基因異?；驍y帶有其它不應(yīng)該屬于該生物體的生

物成份。

（檢測(cè)物）病原1DNA加熱退火（降溫）是否雜交

（待檢物）病原2DNA加熱退火（降溫）

注意：用于分子檢測(cè)的器皿都需要消毒、滅菌

所用水必須是雙蒸水、去離子水

二、分子檢驗(yàn)檢測(cè)的意義

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，國(guó)際國(guó)內(nèi)貿(mào)易的日趨頻繁，有害生物的擴(kuò)散加速，動(dòng)植物檢疫

工作越來越受到重視，由于檢疫性有害生物的擴(kuò)散造成的各類問題備受關(guān)注。

實(shí)現(xiàn)對(duì)檢疫性有害生物的快速檢測(cè)是當(dāng)前社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的迫切需求。

三、分子檢驗(yàn)檢測(cè)與傳統(tǒng)檢驗(yàn)檢測(cè)方法的異同

傳統(tǒng)檢驗(yàn)檢疫方法：耗時(shí)，專業(yè)要求高等等，主要是癥狀上判斷：同癥狀，多病原，疑

難多，問題也多，耗時(shí)、耗材、耗力，對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性影響很大，且對(duì)專家的要求很高。

分子檢驗(yàn)檢測(cè)方法：快速，準(zhǔn)確等等，直接從遺傳物質(zhì)入手，根據(jù)核酸序列來檢測(cè)，既

準(zhǔn)確又快速。DNA序列的獨(dú)特性、專一性的檢測(cè)標(biāo)記進(jìn)行鑒定。

四、分子探針，特異性

其特點(diǎn)：①三個(gè)相連核甘酸組成一個(gè)密碼子，編碼一個(gè)氨基酸，共有64個(gè)密碼子。②

密碼子之間無(wú)核甘酸間隔。③一種氨基酸可有多種密碼子。④所有生物使用同一套密碼子。

分子生物學(xué)的基礎(chǔ)

一、幾個(gè)簡(jiǎn)單的問題

1.分子生物學(xué)主要研究什么？

分子生物學(xué)是從分子水平研究生命本質(zhì)的一門新興邊緣學(xué)科，它以核酸和蛋白質(zhì)等生物

大分子的結(jié)構(gòu)、組成和功能，以及它們?cè)谶z傳信息和細(xì)胞信息傳遞中的作用等為研究對(duì)象，

是當(dāng)前生命科學(xué)中發(fā)展最快并正在與其他學(xué)科廣泛交叉和滲透的前沿領(lǐng)域；它包括：

a、研究核酸結(jié)構(gòu)及其功能的核酸分子生物學(xué)；

b、研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的蛋白質(zhì)分子生物學(xué)；

c、研究細(xì)胞信息傳遞與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的細(xì)胞分子生物學(xué)等。

2.核酸包括什么？

3.核甘酸是怎么連接的？

4.什么是一級(jí)結(jié)構(gòu)？

5.二級(jí)結(jié)構(gòu)是什么？

6.三級(jí)結(jié)構(gòu)呢？

7.那么酶切是切什么？?jī)杭?jí)結(jié)構(gòu)？

8.RNA有幾種？各有什么功能和特性？

二、核酸的理化性質(zhì)

1.粘度2.紫外吸收3.沉降系數(shù)4.溶解性5.變性和復(fù)性

三、思考題

請(qǐng)簡(jiǎn)述生物體、細(xì)胞、染色體、蛋白質(zhì)、核酸、基因等相互間的關(guān)系，并闡述分子檢驗(yàn)

檢測(cè)的目標(biāo)對(duì)象。

三、分子診斷技術(shù)

概念：利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)方法，直接檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是

否正常，從而對(duì)病害作出診斷的方法。

特點(diǎn)：針對(duì)性強(qiáng)、特異性高、靈敏度高、適用性強(qiáng)、診斷范圍

四、分子診斷的常用技術(shù)方法

核酸分子雜交技術(shù)

1.限制性內(nèi)切酶酶譜分析法

2.DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)分析

3.等位基因特異寡核甘酸探針(allelespecificoligonucleotide,ASO)雜交法

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)

基因測(cè)序

基因芯片

動(dòng)植物檢疫的理想目標(biāo)是：防止所有的檢疫性有害生物(物質(zhì))，人為跨境(國(guó)家或地

區(qū))傳播，并及時(shí)地發(fā)現(xiàn)、限制或鏟除外來的檢疫性有害生物。

動(dòng)植物病原物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)是動(dòng)植物檢疫工作的重要組成部分，在動(dòng)植物、動(dòng)植物產(chǎn)品

及其他檢疫物的裝教容器、包裝物，以及來自動(dòng)植物疫區(qū)的運(yùn)輸工具中是否有有害生物，或

有害生物的種類與數(shù)量有多少，只有通過檢測(cè)才能知道。動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫的目的就是要發(fā)現(xiàn)、

檢查和鑒定有害生物，以作為出證放行或作進(jìn)一步檢疫處理的依據(jù)。

檢測(cè)檢驗(yàn)是判斷一個(gè)樣品內(nèi)是否存在特定目標(biāo)病原物，而病害診斷是病害發(fā)生原因和性

質(zhì)的鑒定。

檢測(cè)檢驗(yàn)技術(shù)要求快速、準(zhǔn)確、靈敏、安全、高通量、簡(jiǎn)便、易于標(biāo)準(zhǔn)化和推廣應(yīng)用。

有害生物的傳統(tǒng)檢測(cè)鑒定，主要是從癥狀、形態(tài)鑒定、接種鑒別寄主、病原物培養(yǎng)性狀

等方面來觀察有害生物所表現(xiàn)的表型和性狀來判斷，受環(huán)境因素，人為因素等多種因素的影

響，往往影響對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確判斷。

此外，對(duì)于病害，許多傳統(tǒng)的診斷程序一般都涉及到兩個(gè)過程：第一，先要對(duì)病原物質(zhì)

進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后再分析它的生理生化特性；第二，確定它到底是哪一類的病原物，是病毒、

細(xì)菌還是其他的物質(zhì)。這種診斷方法成本高、速度慢、效率低。如果病原體生長(zhǎng)特別慢或者

根本無(wú)法通過人工培養(yǎng)的方法獲得，例如有些衣原體、植原體就不能培養(yǎng)或很難人工培養(yǎng)，

那么這種傳統(tǒng)的診斷程序就很難有結(jié)果。

分子生物學(xué)研究表明，所有生命類型和不同物種差異的根源都是由遺傳物質(zhì)(DNA或

RNA)決定的，而遺傳信息又是核酸上的核甘酸序列所決定的。因此最準(zhǔn)確的檢測(cè)鑒定方

法，就是測(cè)定一些基于核酸序列的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。

分子檢測(cè)技術(shù)主要是指應(yīng)用分子生物學(xué)的方法來對(duì)有害生物進(jìn)行診斷檢測(cè)鑒定。從理論

上講，任何一個(gè)決定特定生物學(xué)特性的DNA序列都應(yīng)該是獨(dú)特的，都可以用作專一性的檢

測(cè)標(biāo)記，這就是分子診斷檢測(cè)鑒定的理論基礎(chǔ)。

不論是傳統(tǒng)的常規(guī)檢測(cè)，還是現(xiàn)代的分子技術(shù)，一種有效的檢測(cè)方法都應(yīng)該具備以下3

個(gè)條件：①專一性(specificity)強(qiáng)，這指的是檢測(cè)只對(duì)目標(biāo)分子或只對(duì)某一種有害生物分

子產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)；②靈敏度(sensitivity)高，是指即使只有微量的目標(biāo)分子，或是在有很

多干擾存在的情況下，也能夠很靈敏地檢測(cè)出所尋找的那種有害生物的分子；③操作簡(jiǎn)單

(simplicity),主要是指在做大規(guī)模檢測(cè)時(shí)，要求能夠操作方便、簡(jiǎn)單、高效、廉價(jià)。

分類、鑒定、命名、診斷

分類(classification)分類的任務(wù)是解決從個(gè)別到一般或從具體到抽象的問題，亦即通

過收集大量有關(guān)個(gè)體描述的資料，經(jīng)過科學(xué)的歸納，整理成一個(gè)科學(xué)的分類系統(tǒng)。理想的分

類系統(tǒng)應(yīng)該是反映生物進(jìn)化規(guī)律的自然分類系統(tǒng)。

鑒定(identification)鑒定的任務(wù)與分類恰恰相反，它是從一般到特殊或從抽象到具

體的過程，亦即通過詳細(xì)的觀察和描述一個(gè)未知名稱純種生物的各種性狀特征，然后查找現(xiàn)

成的分類系統(tǒng)，以達(dá)到初類舞名的目的。將病原物的種類和病害種類同已知種類比較異同，

確定其科學(xué)名稱或分類上的地位。

命名(nomenclatuiv)命名的任務(wù)是為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的生物種確定一個(gè)新學(xué)名。亦即當(dāng)你

詳細(xì)觀察和描述一個(gè)未知菌種后，經(jīng)過認(rèn)真查找現(xiàn)有的權(quán)威性分類手冊(cè)，發(fā)現(xiàn)這是一個(gè)以往

還未記載過的新種，這時(shí)就得按微生物的國(guó)際命名法規(guī)給以一個(gè)新的學(xué)名。

診斷(diagnosis)從癥狀等表型特征來判斷其病因，確定病害種類。

DNA提取與測(cè)定及PCR

分子生物學(xué)基礎(chǔ)

1、核酸的組成、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

核酸(nucleicacid)是體內(nèi)重要的生物大分子，由于最初從細(xì)胞核分離出來，又具有酸性,

故稱為核酸。

核酸的基本組成單位是核一

甘酸。L核音,一

DNA的基本組成單位是脫氧核

糖核甘酸。

RNA的基本組成單位是核糖核

甘酸。

r腺噤吟(A)]

噂吟T

I鳥喋吟(G)fDNA、RNA均有

堿基胞啕流(C),

｛胸腺啕癥(T)-DNA有

尿嗑咤(U)-RNA有

1堿基

喋吟（purine）

腺喋吟鳥喋吟

（6-氨基喋吟）（6-氨基-2-氧喋吟）

喏咤(pyrimidine)

戊糖

構(gòu)成RNA構(gòu)成DNA

核昔：核昔=堿基+戌糖

連接方式：糖昔鍵噂吟環(huán)上的N-9或喀咤環(huán)上的N-1與糖的cr以糖昔鍵相連。

胞嗜咤脫氧核甘腺噂吟核昔

核甘酸

假若破

藉菩鍵

脫氧核甘酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP

RNA和DNA中常見的核昔酸

堿基RNADNA

腺嗯吟腺嗯吟核甘酸（腺甘酸，AMP）腺嗓吟脫氧核甘酸（脫氧腺甘酸，dAMP）

鳥噂吟鳥噪吟核甘酸（鳥昔酸，GMP）鳥喋吟脫氧核甘酸（脫氧鳥甘酸，dGMP）

胞喀唬胞喀唬核昔酸（胞甘酸，CMP）胞嗑碇脫氧核甘酸（脫氧胞甘酸，dCMP）

尿啕定尿喳咤核昔酸（尿甘酸，UMP）

胸腺嗑咤胸腺啥咤脫氧核甘酸（脫氧胸昔酸，dTMP）

游離核甘酸及其衍生物

一磷酸腺昔（AMP）j

二磷酸腺昔（ADP））

Y

三磷酸腺昔（ATP）

多磷酸核甘酸

OHOH

3；5'-環(huán)化腺昔酸(cAMP)315。環(huán)化鳥甘酸（cGMP）

環(huán)化核甘酸:cAMP,cGMP

2.核酸的分類及生物功能

核糖核酸(RNA)：遺傳信息的載體

核糖體RNA(rRNA):約占細(xì)胞中RNA總量的80%,是細(xì)胞質(zhì)中核糖體的組成成分。

蛋白質(zhì)合成場(chǎng)所，指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成。

轉(zhuǎn)運(yùn)RNACtRNA):約占全部RNA的15%,轉(zhuǎn)運(yùn)RNA是細(xì)胞中相對(duì)分子量最小的一

種RNA分子，以游離態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸。

信使RNA(mRNA):占細(xì)胞中RNA總量的5%左右。它是以DNA為模板，經(jīng)轉(zhuǎn)錄

合成。轉(zhuǎn)錄遺傳信息。

3.核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)

核酸中核甘酸的排列順序。由于核甘酸間的差異主要是堿基不同，所以也稱為堿基序列。

核甘酸之間以35一磷酸二酯鍵連接形成多核甘酸鏈，即核酸。

4.核酸的空間結(jié)構(gòu)

a.DNA的雙螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)

DNA雙螺旋模型的基本要點(diǎn)

1.兩條鏈反向平行，圍繞同一中心軸構(gòu)成右手雙螺旋。螺旋直徑2nm,表面有大溝和

小溝。

2.磷酸-脫氧核糖骨架位于螺旋外側(cè)，堿基垂直于螺旋軸而伸入內(nèi)側(cè)。每圈螺旋含10個(gè)

堿基對(duì)，螺距為3.4nm。

3.兩條鏈通過堿基間的氫鍵相連，A對(duì)T有兩個(gè)氫鍵，C對(duì)G有三個(gè)氫鍵，嚴(yán)格按照堿

基配對(duì)原則。

4.維持雙螺旋穩(wěn)定的因素：橫向?yàn)闅滏I，縱向?yàn)閴A基間的堆積力。

b.DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)

DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)指在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，DNA雙螺旋進(jìn)一步卷曲所形成的閉合環(huán)狀、

線狀等超螺旋結(jié)構(gòu)。

C.RNA的空間結(jié)構(gòu)

單鏈RNA自行盤繞形成局部雙螺旋區(qū)，在螺旋區(qū)，A與U配對(duì)，G與C配對(duì)。在3種

RNA中，目前，研究最清楚的是IRNA的空間結(jié)構(gòu)，它的二級(jí)結(jié)構(gòu)均為三葉草形，三級(jí)結(jié)

構(gòu)呈倒L形。

核酸與核甘酸的主要性質(zhì)及其應(yīng)用

1.一般理化性質(zhì)

核酸為多元酸，具有較強(qiáng)的酸性；DNA是線性高分子，粘度極大；

2.紫外吸收性質(zhì)

在260nm波長(zhǎng)有最大吸收峰，是由堿基的共舸雙鍵決定。這一特性常用作核酸的定性、

定量分析。

3.核酸的變性、復(fù)性與雜交

■核酸的變性：在某些理化因素作用下(溫度、酸堿、有機(jī)溶劑、尿素等)，核酸分子

互補(bǔ)雙鏈之間氫鍵斷裂，使雙螺旋結(jié)構(gòu)松散變成單鏈的過程。變性產(chǎn)生增色效應(yīng)。

變性表征：

生物活性部分喪失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加(增色效應(yīng))

變性因素：

pH(>11.3或<5.0)變性劑(胭、甲酰胺、甲醛)低離子強(qiáng)度、加熱

■核酸的復(fù)性：變性核酸在一定條件下如溫度逐步恢復(fù)到生理范圍內(nèi)，兩條互補(bǔ)鏈重

新恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象。

將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時(shí)，DNA不可能復(fù)性。變性的DNA緩慢冷卻時(shí)可復(fù)

性即“退火”。退火溫度=?11—25℃

復(fù)性影響因素：

片段濃度/片段大小/片段復(fù)雜性(重復(fù)序列數(shù)目)/溶液離子強(qiáng)度

復(fù)性特點(diǎn)：紫外吸收減少

減色效應(yīng)：DNA復(fù)性過程中，紫外吸收減少的現(xiàn)象

常用的復(fù)性方法：退火

■雜交：不同來源的核酸經(jīng)變性和復(fù)性的過程，其中一些不同的核甘酸單鏈由于存在

包括：DNA—DNA雜交DNA—RNA雜交RNA—RNA雜交

原因：不同核酸的堿基之間可以形成堿基配對(duì)

用途：是分子生物學(xué)研究與基因工程操作的常用技術(shù)

核酸分子檢測(cè)技術(shù)

核酸分子生物學(xué)自1953年Waston和Crick提出DNA雙螺旋模型，標(biāo)志著(核酸)分

子生物學(xué)的創(chuàng)立。隨后，雙螺旋結(jié)構(gòu)創(chuàng)始人之一-的Crick于1958年提出分子遺傳中心法則

(centraldogma),從而揭示了核酸與蛋白質(zhì)的內(nèi)在關(guān)系，以及RNA作為遺傳信息傳遞者的

生物學(xué)功能以來發(fā)展迅速。進(jìn)入20世紀(jì)70年代，隨著限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和DNA雜交技

術(shù)的建立，核酸分子生物學(xué)進(jìn)入技術(shù)化時(shí)代。之后，各種核酸分子生物學(xué)技術(shù)不斷出現(xiàn)，概

括起來，主要包括核酸分子雜交(molecularhybridizationofnucleicacids)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

(polymerasechainreaction,PCR)和DNA重組(recombinantDNA)技術(shù)等。

核酸的發(fā)現(xiàn)與早期研究

,1944年Avery等人證實(shí)DNA是遺傳物質(zhì)

?1953年Watson和Crick發(fā)現(xiàn)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)

?1985年Mullis發(fā)明PCR技術(shù)

?2001年美、英等國(guó)完成人類基因組計(jì)劃基本框架

1978年Kan和Dozy首先應(yīng)用羊水細(xì)胞DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction

fragmentlengthpolymorphism,RFLP)作鑲刀狀細(xì)胞貧血病的產(chǎn)前診斷，從而開創(chuàng)了DNA

診斷的新技術(shù)。二十多年來，DNA診斷技術(shù)取得了飛速的發(fā)展，建立了多種多樣的檢

測(cè)方法，這些檢測(cè)方法已經(jīng)廣泛用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)、動(dòng)植物檢疫等各領(lǐng)域。

一、核酸的提取

核酸的分離與提純是核酸研究中最基本的技術(shù)，分離獲得的核酸質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到

實(shí)驗(yàn)的成敗，但是不同的研究目的對(duì)核酸的純度和量的要求不盡相同。

（-）分離提取核酸的方法

目前分離提取核酸的方法多種多樣，概括起來，可以分為三大類：①通用方法，此方法

的適用范圍較廣，對(duì)一般的實(shí)驗(yàn)材料都適用。②針對(duì)某些特殊材料的方法，例如含多糖和多

酚類物質(zhì)較多的植物材料，以及一些動(dòng)植物蠟制標(biāo)本材料和毛發(fā)與角質(zhì)等材料，通常在提取

核酸的過程中，要采用一些適當(dāng)?shù)拇胧嗵?、多酚和角蛋白等的影響。③針?duì)某個(gè)物

種或某一器官（或組織、細(xì)胞器）的方法，如針對(duì)某一物種例如棉花、甘薯等的特性，或某

?器官和組織例如動(dòng)物的肝臟或腎臟等的特性，或某些細(xì)胞器例如葉綠體和核糖體的特性，

有一些專門的核酸提取方法。

（二）分離提純核酸的基本要求

但是無(wú)論采用哪一種方法，一般而言，一個(gè)好的核酸的分離提純方法都應(yīng)該符合三個(gè)基

本要求：①所獲得的核酸純度應(yīng)該能夠滿足下游操作的要求，例如用于核酸組成和結(jié)構(gòu)分析

的材料，對(duì)純度的要求很高，否則將可能影響分析結(jié)果，而時(shí)于用于PCR的核酸，通常純

度要求不高，但是不得含有干擾PCR反應(yīng)的污染物：②所得到的核酸應(yīng)當(dāng)完整，電泳檢查

時(shí)可以給出精確性高、重復(fù)性好的遷移帶型：③所得到的核酸應(yīng)有足夠的量。所以，根據(jù)實(shí)

驗(yàn)的要求和目的，常常有核酸大量提取方法和微量提取方法之分。

（三）核酸提取的基本過程

1.材料的準(zhǔn)備與細(xì)胞的破碎

（1）材料的準(zhǔn)備

由于實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，?duì)于核酸提取材料的要求也不相同，①通常都要求材料新鮮無(wú)污染，

這里所說的新鮮是指對(duì)采集得到的樣品應(yīng)立即進(jìn)行處理，對(duì)于暫時(shí)來不及處理的樣品應(yīng)該在

適當(dāng)處理后冷藏保存。②應(yīng)盡可能選擇富含目的核酸的實(shí)驗(yàn)材料，如果對(duì)目的核酸的分布不

很清楚，也可以通過預(yù)備實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析，還可以采取適當(dāng)?shù)拇胧┰黾訉?shí)驗(yàn)材料中目的核酸的

含量，例如在提取質(zhì)粒DNA時(shí)，可以先用氯霉素處理宿主細(xì)菌，從而使質(zhì)粒的拷貝數(shù)顯著

增加。③對(duì)于一些存在于特定細(xì)胞或細(xì)胞器中的核酸，應(yīng)先分離富集這些細(xì)胞或細(xì)胞器，然

后再進(jìn)行核酸的提取，例如要提取葉綠體或線粒體中的核酸，可以先采用超速離心的方法收

集葉綠體或線粒體，然后再進(jìn)行核酸提取。

（2）細(xì)胞的破碎

在天然狀態(tài)下，除了少數(shù)病毒的核酸不存在于細(xì)胞內(nèi)外，其他核酸都存在于動(dòng)物、植物

或微生物的細(xì)胞內(nèi)，所以在提取核酸前首先要進(jìn)行細(xì)胞的破碎。破碎細(xì)胞的方法很多，大體

上可以分為三大類，①機(jī)械破碎細(xì)胞，機(jī)械法破碎細(xì)胞通常適合于細(xì)胞壁比較堅(jiān)固的植物細(xì)

胞和真菌細(xì)胞，最常用的手段是液氮冷凍研磨，即加人液氮使樣品迅速冷凍，然后研磨破碎

細(xì)胞，有時(shí)也采用高速組織搗碎機(jī)、超聲波和反復(fù)融凍等手段進(jìn)行破碎。②化學(xué)法破碎細(xì)胞,

化學(xué)破碎法是采用一些化學(xué)試劑使細(xì)胞破碎，最常用的破碎細(xì)胞化學(xué)試劑是十二烷基磺酸鈉

（SDS）和NaOH,另外，還有Tween-80和TritonX-100等,化學(xué)方法常用于動(dòng)物細(xì)胞的破

碎和質(zhì)粒DNA提取時(shí)破碎細(xì)菌細(xì)胞。③酶法破碎細(xì)胞，酶法是采用生物酶制劑破碎細(xì)胞的

方法，最常用的是在細(xì)菌細(xì)胞破碎中的溶菌酶。除了上述細(xì)胞破碎方法之外，還可以采用直

接加熱等方法破碎細(xì)胞。上述方法可以單獨(dú)使用，也可以聯(lián)合起來使用，例如將溶菌酶和

SDS一起使用，能很好地破碎細(xì)菌細(xì)胞。另外，有些細(xì)胞破碎方法還兼有其他作用，例如

SDS和Tween-80等去污劑，除了能使細(xì)胞溶解破碎之外，還具有使蛋白質(zhì)和核酸分離以及

抑制核糖核酸酶活性等作用。

2.核酸的提取和純化

(1)蛋白質(zhì)的沉淀

細(xì)胞破碎后，核酸和胞內(nèi)的其他物質(zhì)混合在一起，因此必須采用適當(dāng)?shù)拇胧┦购怂釓闹?/p>

分離出來。對(duì)核酸分離純化影響最大的是蛋白質(zhì)，去除蛋白質(zhì)的方法很多，常用的方法包括:

①使用SDS、脫氧膽酸鈉、4-氨基水楊酸鈉、秦-1,5-二磺酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)與核酸分

離；②采用苯酚和氯仿使蛋白質(zhì)沉淀；③采用某些蛋白酶使蛋白質(zhì)降解，最常用的是蛋白酶

K和鏈霉蛋白酶。

(2)核酸酶的抑制

在核酸提取中，還要特別注意的是應(yīng)采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄒ种苹蛳怂崦傅幕钚?，以避?/p>

核酸在提取過程中被分解。實(shí)際上，①上述各種蛋白質(zhì)沉淀劑都是很好的核酸酶抑制劑，它

們?cè)诔恋淼鞍踪|(zhì)的同時(shí)，也抑制了核酸酶的活性。②另外，在核酸的提取中，通常加入乙二

胺四乙酸(EDTA),它能夠絡(luò)合Mg2+和Ca2+等二價(jià)金屬離子，從而抑制DNA酶的活性；

③也可以在核酸的提取過程中加入一些化學(xué)物質(zhì)來抑制酶活性，例如異硫氟酸胭和3-筑基

乙醇都能很好地抑制RNA酶的活性。

(3)RNA與DNA的分離

去除了蛋白質(zhì)等雜質(zhì)后，接下來是如何將DNA和RNA進(jìn)行分離?？梢韵葘⒉牧现械目?/p>

核酸沉淀分離出來，然后采用①RNA酶分解RNA就可以得到DNA,②也可以采用LiCl選

擇性地沉淀DNA從而使RNA與DNA分開。③另外，可以利用DNA核蛋白能溶于水和高

濃度(例如1?2mol/L。)的NaCl溶液而難溶于低濃度(例如0.14mol/L)的NaCl溶液,

而RNA核蛋白則易溶于低濃度(例如0.14mol/L)的NaCl溶液的特性，首先采用低濃度

NaCl溶液將RNA核蛋白從溶液中去除，然后采用SDS等使蛋白質(zhì)變性沉淀，并用高濃度

的NaCl溶液溶解DNA,從而實(shí)現(xiàn)RNA與DNA的分離與純化。

對(duì)于不同RNA(mRNA、tRNA、rRNA)的分離通常很不容易，可以先將細(xì)胞勻漿進(jìn)行超

速離心，制得細(xì)胞核、線粒體和核糖體等細(xì)胞器，然后再分別從中提取不同類型的RNA。

對(duì)于真核生物的mRNA,由于在3,端有polyA尾巴，所以可以使其和固定化的寡聚脫氧胸

腺核甘酸［oligo(dT)］結(jié)合，從而選擇性地分離純化mRNA。另外，目前從動(dòng)物組織和培養(yǎng)

細(xì)胞中提取完整總RNA普遍采用的方法是異硫鼠酸服法,異硫氟酸胭具有很強(qiáng)的抑制RNA

酶活性的能力，同時(shí)能很好地使蛋白質(zhì)變性沉淀，經(jīng)異硫氟酸呱提取的RNA可以直接用于

逆轉(zhuǎn)錄生成cDNAo

(4)核酸的濃縮

根據(jù)核酸溶于水而不溶于有機(jī)溶劑的特性，采用70%濃度的乙醇，就可以將核酸從溶

液中沉淀分離出來，從而實(shí)現(xiàn)核酸的濃縮，當(dāng)然也可以采用其他有機(jī)溶劑沉淀、濃縮核酸。

3.核酸純度的鑒定和定量分析

核酸在260nm處有最大吸收值，而蛋白質(zhì)最大吸收值在280nm處。通過測(cè)定核酸溶液

260nm和280nm處的吸光值，并計(jì)算它們的比值，可以估計(jì)核酸的純度，DNA純品的

A260nm/A280nm比值為1.8,而RNA純品的比值為2.0,如果樣品中含有蛋白質(zhì)和苯酚等

雜質(zhì)，則兩者的比值明顯會(huì)低于上述值。

同樣，利用核酸紫外吸收的特性可以進(jìn)行定量分析。對(duì)純品核酸，在260nm處的一個(gè)

吸光值單位相當(dāng)于50ug/ml的雙鏈DNA,37ug/ml的單鏈DNA或RNA,或者20ug/ml

的單鏈寡核甘酸。

對(duì)于核酸的分子質(zhì)量大小和組成等，可以通過瓊脂糖凝膠電泳等方法進(jìn)行分析和鑒定。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PoIymerasechainreaction（PCR）

一、PCR的定義

在引物指導(dǎo)下由酶催化的對(duì)特定克隆或基因組DNA序列進(jìn)行的體外擴(kuò)增反應(yīng)。

二、PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究

的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍

三、PCR原理

PCR是KaryMullis于1985年發(fā)明的一種模擬天然DNA復(fù)制過程,即利用DNA聚合酶

（如TaqDNA聚合前）等在體外條件下，催化一對(duì)引物間的特異DNA片段合成的基因體外

擴(kuò)增技術(shù)。

PCR技術(shù)原理

類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核甘酸引物。模

板DNA變性：加熱至940c左右，雙鏈DNA解離成單鏈；模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：

55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：在TaqDNA聚合酶

作用下，以dNTP為原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的雙

鏈；重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。

PCR通用操作程序

①配制反應(yīng)體系，混勻后，離心數(shù)秒。

②PCR儀上設(shè)置程序，置反應(yīng)管于PCR儀上，進(jìn)行熱循環(huán)（加礦物油50?100口1于反應(yīng)

液表面以防蒸發(fā)）

③瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

四、PCR的主要用途

（）目的基因的克隆

（二）基因的體外突變

（三）DNA和RNA的微量分析

（四）DNA序列測(cè)定

（五）基因突變分析

幾種重要的PCR衍生技術(shù)

（-）反轉(zhuǎn)錄PCR

把RNA提取后反轉(zhuǎn)錄成cDNA,并以其為模板進(jìn)行的PCR反應(yīng)，通常用于檢測(cè)某種

RNA是否被表達(dá)，或者比較其相對(duì)表達(dá)水平巢式PCR（nestedPCR）,是指利用兩套PCR

引物（巢式引物）對(duì)進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在第一輪擴(kuò)增中，外引物用以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，

此產(chǎn)物在在內(nèi)引物的存在下進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。由于巢式PCR反應(yīng)有兩次PCR擴(kuò)增，從而降

低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性（因?yàn)榕c兩套引物都互補(bǔ)的引物很少）增加了檢測(cè)的敏感性；

又有兩對(duì)PCR引物與檢測(cè)模板的配對(duì)，增加了檢測(cè)的可靠性。所以反轉(zhuǎn)錄-巢式PCR就是

以cDNA為模板進(jìn)行的巢式PCR,它和簡(jiǎn)單的反轉(zhuǎn)錄PCR-樣是用于檢測(cè)某種RNA是否

被表達(dá)，或者比較其相對(duì)表達(dá)水平，但是特異性更高，可靠性更強(qiáng)。

（二）原位PCR（In-situPCR）

原位PCR是指直接用細(xì)胞涂片或石蠟片包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然

后用特異探針進(jìn)行原位雜交檢測(cè)含該特異序列的細(xì)胞的一種方法。

五、PCR的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系

?10義擴(kuò)增緩沖液10ul

4種dNTP混合物#200ymol/L

引物10?100pmol

模板DNA0.1?2ug

TaqDNA聚合酶（耐熱聚合酶）2.5u

(Mg2+)1.5mmol/L

加雙或三蒸水lOOul

反應(yīng)體系對(duì)PCR擴(kuò)增的影響

DNA模板

?純度：蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)會(huì)抑制PCR反應(yīng)

?完整性：模板降解會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增無(wú)產(chǎn)物

?濃度：加量過多導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加

?特異性：長(zhǎng)度適當(dāng)、避免二級(jí)結(jié)構(gòu)和二聚體

?完整性：避免反復(fù)凍融

?濃度：應(yīng)適當(dāng)，過高導(dǎo)致非特異性增加

六、PCR反應(yīng)五要素

引物（primer）、酶（T叫DNApolymerase）、dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）、模

板（template）、Mg2+（magnesium）

（一）引物

引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度

引物設(shè)計(jì)的原則

①引物長(zhǎng)度：15-30個(gè)堿基，常為20個(gè)堿基左右

②引物擴(kuò)增跨度：以500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,ATGC最好隨機(jī)分布

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)避免兩引物間互補(bǔ)，特別是3'端

⑤引物3、端的堿基要求嚴(yán)格配對(duì)，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基

⑥引物中可以加上合適的酶切位點(diǎn)要作酶切時(shí)加

⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性

（二）酶及其濃度

TaqDNA聚合酶

一個(gè)典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U,濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合

成產(chǎn)物量減少

特異性：基因組擴(kuò)增、RT-PCR

保真性：基因篩選、測(cè)序、基因克隆

長(zhǎng)片段擴(kuò)增：構(gòu)建基因圖譜、測(cè)序、分子遺傳學(xué)

擴(kuò)增效率：復(fù)雜模板擴(kuò)增（GC含量高、二級(jí)結(jié)構(gòu)）

PCR試劑盒：復(fù)雜模板擴(kuò)增、大規(guī)模基因檢測(cè)

（三）dNTP的質(zhì)量與濃度

dNTP質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系

DdNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度，小量分裝，-20C冰凍保存。多次凍融會(huì)使

dNTP降解；

2）在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為20~200umol/L,注意4種dNTP的濃度要相等;

3）dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離Mg2+濃度降低

（四）模板（template）

模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。

（五）Mg?+濃度

1）Mg2+對(duì)擴(kuò)增特異性和產(chǎn)量有顯著影響：

Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低；

濃度過低會(huì)降低ThqDNA聚合酶活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。

2）在一般的PCR反應(yīng)中,各種dNTP濃度為200Hmol/L時(shí),Mg2+濃度為1.5?2.0mmol/L

為宜；

七、PCR熱循環(huán)條件的選擇

（一）溫度與時(shí)間的設(shè)置：

?設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)：

1）93-95℃變性；

2）40-60C退火；

3）70-75℃延伸

?對(duì)于較短靶基因（長(zhǎng)度為100?300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法，一般采用94℃變性，65℃

左右退火與延伸

①變性溫度與時(shí)間：

變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因，一般93℃?94℃1min足以

使模板DNA變性；若低于93℃則需延長(zhǎng)時(shí)間，但溫度不能過高，高溫環(huán)境對(duì)酶的活性有影

響。

②退火（復(fù)性）溫度與時(shí)間：

退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素

變性后溫度快速冷卻至40℃?60℃,可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。

退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶片段的長(zhǎng)度

引物的復(fù)性溫度

當(dāng)引物長(zhǎng)度為15-20個(gè)堿基時(shí)一，在高離子強(qiáng)度中反應(yīng)（如IMNaCl）

Tm=4（G+C）+2（A+T）復(fù)性溫度=Tm值-（5-10℃）

復(fù)性時(shí)間一般為30?60sec,足以使引物與模板之間完全結(jié)合

③延伸溫度與時(shí)間：

延伸溫度：一般選擇在70?75℃之間，常用溫度為72℃

延伸反應(yīng)時(shí)間：根據(jù)待擴(kuò)增片段長(zhǎng)度而定,1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間Imin

延伸時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增；對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些

（-）循環(huán)次數(shù)

?決定PCR擴(kuò)增程度

?主要取決于模板DNA的濃度

?選在25?40次之間

平臺(tái)期與平臺(tái)效應(yīng)（plateaueffect）

PCR經(jīng)過一定數(shù)量的循環(huán)后，隨著產(chǎn)物的對(duì)數(shù)累積趨于飽和，DNA片段不再呈指數(shù)積累，

而是進(jìn)入線性增長(zhǎng)期或靜止期，此過程稱為平臺(tái)效應(yīng)。

八、PCR反應(yīng)特點(diǎn)

（-）特異性強(qiáng)

?靶序列的特異性決定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

?在較高的溫度下進(jìn)行，引物結(jié)合的特異性大大增加。

（二）靈敏度高

?PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加

?從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞，在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌

(三)簡(jiǎn)便、快速

?在DNA擴(kuò)增儀中進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般1?3小時(shí)完成。

(三)對(duì)模板的純度要求低

可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的DNA

或RNA擴(kuò)增檢測(cè)。

九、PCR常見問題與對(duì)策

PCR常見問題之一

?無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物現(xiàn)象：正對(duì)照有條帶，而樣品則無(wú)；

?原因：模板:含有抑制物，含量低

,Buffer對(duì)樣品不合適

?引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解

?反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時(shí)間太短

?對(duì)策：純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量

?更換Buffer或調(diào)整濃度

?重新設(shè)計(jì)引物(避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu))或者換?管新引物

?降低退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間

PCR常見問題之二

非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象：PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，

或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。

原因：引物特異性差模板或引物濃度過高酶量過多Mg2+濃度偏高退火溫度

偏低循環(huán)次數(shù)過多

對(duì)策：重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)減少

酶量降低鎂離子濃度適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法減少循環(huán)次數(shù)

PCR常見問題之三

拖尾現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)

原因：模板不純Buffer不合適退火溫度偏低酶量過多dNTP、Mg2+濃度偏高

循環(huán)次數(shù)過多

對(duì)策：純化模板更換Buffer適當(dāng)提高退火溫度適量用能適當(dāng)降低dNTP和鎂

離子的濃度減少循環(huán)次數(shù)

PCR常見問題之四

假陽(yáng)性(篩選轉(zhuǎn)基因、檢測(cè)基因表達(dá)情況)

現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物

原因：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染

對(duì)策：1操作時(shí)防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；

2除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。離心管及槍頭等均一次性使

用。

3各種試劑先進(jìn)行分裝，低溫貯存。

四種策略

巢式PCR(Nest-PCR)、遞減PCR(TouchDownPCR)>熱啟動(dòng)PCR(HotStartPCR),使用

PCR增強(qiáng)劑

策略之一巢式PCR(Nest-PCR)

?巢式PCR的使用降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性，因?yàn)橥嗵滓锒蓟パa(bǔ)的靶序列

很少。

A巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的靈敏度，并且提高了困難PCR

（如5'RACE）的特異性。

策略之二遞減PCR（TouchDownPCR）

?遞減PCR通過在PCR的前幾個(gè)循環(huán)使用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饤l件提高特異性。循環(huán)設(shè)在比

估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開始，然后每個(gè)循環(huán)降低1-2℃,直到退火溫度低

于Tm5"C。

＞特異性最高的目的模板會(huì)被優(yōu)先擴(kuò)增，這些產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增占據(jù)優(yōu)勢(shì)。

＞遞減PCR對(duì)于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更為有用，如AFLP、

DNA指紋分析等。

策略之三熱啟動(dòng)PCR（HotStartPCR）

?熱啟動(dòng)主要是通過抑制?種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度；

?現(xiàn)在有很多公司都有HotStartT叫酶出售，該酶具有熱啟動(dòng)的性能，使用簡(jiǎn)單方便，

適合于高通量應(yīng)用；

?熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性最重要的方法之一.

策略之四使用PCR增強(qiáng)劑

?甲酰胺，DMSO,甘油，甜菜堿等都可充當(dāng)PCR的增強(qiáng)劑。

?其可能的機(jī)理是降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助DNA聚合酶延伸通過

二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)。

＞增強(qiáng)劑濃度要適當(dāng)

十、PCR污染

（-）污染原因

1模板間交叉污染2PCR試劑污染3實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染

（二）防止污染的方法

1合理分隔實(shí)驗(yàn)室2移液槍不能接觸PCR相關(guān)試劑3手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性

使用4設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照，重復(fù)實(shí)驗(yàn)

—、PCR技術(shù)的應(yīng)用

?1基因組中特異片段克隆

?2反向PCR

?3不對(duì)稱PCR

?4RT-PCR

?5基因的體外誘變

?6基因組的比較研究

核酸的分子雜交NucleicAcidHybridization

核酸分子雜交：

把同源關(guān)系較近的，不同生物個(gè)體來源的變性DNA或RNA單鏈，經(jīng)退火處理形成

DNA-DNA或DNA-RNA這一過程叫分子雜交。

或是指同一生物個(gè)體非同一分子來源但具有互補(bǔ)序列（或某一區(qū)段互補(bǔ)）的兩條多核甘酸

鏈，通過堿基配對(duì)形成穩(wěn)定的雙鏈分子的過程。

五、DNA芯片技術(shù)

一、核酸分子雜交技術(shù)的原理

有互補(bǔ)特定核甘酸序列的單鏈DNA或RNA混在一起時(shí);其相應(yīng)同源區(qū)段將會(huì)退火形

成雙鏈結(jié)構(gòu)。

如把一段已知基因（DNA或RNA）的核酸序列用合適的標(biāo)記物（如放射性同位素、生

物素等）予以標(biāo)記，當(dāng)作探針（probe）,在一定條件下，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與變性后的互

補(bǔ)單鏈基因組DNA或RNA等進(jìn)行雜交（變性）形成雙鏈雜交體，鑒定靶序列的存在、分

子大小或進(jìn)行靶序列的相對(duì)定量分析。

用合適方法（如放射自顯影或免疫組織化學(xué)等技術(shù)）把標(biāo)記物檢測(cè)出來，就可確定靶核

甘酸序列的拷貝數(shù)及表達(dá)豐度等。

應(yīng)用：

1）檢測(cè)特定生物有機(jī)體之間是否存在親緣關(guān)系；

2）用來揭示核酸片段中某一特定基因的存在與否、拷貝數(shù)及表達(dá)豐度。

二、核酸探針的制備

探針（Probe）：

一段帶有檢測(cè)標(biāo)記的與目的基因或目的DNA特異互補(bǔ)的已知核昔酸序列。

探針的制備方法

探針長(zhǎng)度一般以50~300bp為宜。

制備方法：

1）利用DNA重組技術(shù)

2）PCR擴(kuò)增

3）化學(xué)合成

探針的分類：

據(jù)制備方法及核酸性質(zhì)不同，可分為：

1基因組DNA探針

2cDNA探針

3RNA探針

4寡核甘酸探針

注意的問題

?蛋白質(zhì)電泳

?常用SDS

?非變性PAGE

,Tris-Tricine膠中電泳

聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時(shí)要戴手套

合成寡核甘酸探針注意原則：

1）長(zhǎng)度（10-50bp）;

2）G:C對(duì)含量40%-60%：

3）探針內(nèi)避免互補(bǔ)：

4）避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)；

5）與非靶序列有70%以上同源性或連續(xù)8個(gè)以上堿基序列相同，最好不用。

三、核酸探針的標(biāo)記

為確定探針是否與相應(yīng)基因組DNA雜交，有必要對(duì)探針加以標(biāo)記，以便在結(jié)合部位獲得可

識(shí)別的信號(hào)。

1、標(biāo)記的種類

同位素：

32P、35S、3H、1251等標(biāo)記探針

非同位素：

生物素、地高辛配體、熒光素等作為標(biāo)記物

兩者比較：后者不及前者敏感，但后者保存時(shí)間較長(zhǎng)，無(wú)同位素污染。

一個(gè)理想的標(biāo)記物：

1）標(biāo)記前后探針的基本結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)相同；

2）特異性強(qiáng)、本底低、重復(fù)性好：

3）操作簡(jiǎn)單、節(jié)時(shí)；

4）安全、無(wú)環(huán)境污染。

2、探針的標(biāo)記方法

（1）缺口平移法

（2）隨機(jī)引物標(biāo)記法

（3）末端標(biāo)記法

（4）生物素光照標(biāo)記法

缺口平移法的原理

將DNAaseI的水解活性與大腸桿菌DNApolymeraseI的5'f3'的聚合酶活性和5'

-3'的外切酶活性相結(jié)合。

首先用DNAaseI在探針DNA雙鏈上造成缺口，然后再借助于Eco〃的DNApolI的

5'-3'外切酶活性，切去帶有5'-磷酸的核甘酸；同時(shí)利用該酶5'-3'聚合酶活性，使生物素

或同位素標(biāo)記的互補(bǔ)核甘酸補(bǔ)入缺口。

這兩種活性同時(shí)作用，缺口不斷向3'方向移動(dòng)，DNA鏈上的核昔酸不斷為標(biāo)記的核普

酸取代，成為帶有標(biāo)記的DNA,純化除去游離脫氧核甘酸后成為標(biāo)記DNA探針。

隨機(jī)引物標(biāo)記法原理

用一些六核甘酸作為隨機(jī)引物，將這些引物和探針DNA片段一起熱變性，退火后，引

物與單鏈DNA互補(bǔ)結(jié)合，再在DNA聚合酶的作用下，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則不斷在其3'-0H

端添加標(biāo)記的單核甘酸修補(bǔ)缺口，合成新的標(biāo)記的探針片段。

末端標(biāo)記法原理

（1）一種是在5,末端加成標(biāo)記法：

先用堿性磷酸酶（AP）去掉dsDNA5'-磷酸，再用T4多核甘酸激酶催化標(biāo)記的ATP轉(zhuǎn)

移加到DNA片段5'-0H上。

（2）在探針3'-末端用末端轉(zhuǎn)移酶摻入一個(gè)單標(biāo)記的ddUTPo

生物素光照標(biāo)記法

光敏生物素在紫外線照射下與DNA或RNA的堿基發(fā)生化學(xué)加成反應(yīng)，獲得生物素標(biāo)記的

DNA探針。

四、核酸分子雜交技術(shù)

?將特定的單鏈DNA或RNA混合在一起，其相應(yīng)的同源區(qū)段（互補(bǔ)）就會(huì)退火形成

雙鏈結(jié)構(gòu)。如果退火的核酸來自不同的生物有機(jī)體，所形成的雙鏈分子就被稱為雜

種核酸分子。能夠雜交形成雜種分子的不同來源的DNA分子，其親緣關(guān)系較為密

切；反之，其親緣關(guān)系則比較疏遠(yuǎn)。因此，DNA/DNA的雜交作用，可以用來檢測(cè)

特定生物有機(jī)體之間是否存在著親緣關(guān)系，而形成DNA/RNA間雜種分子的能力可

被用來揭示核酸片段中某一特定基因的位置。

?在大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中，經(jīng)過凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都必須通過毛

細(xì)管或電導(dǎo)作用被轉(zhuǎn)移到濾膜上，而且是按其在凝膠中的位置原封不動(dòng)地"吸印”上

去的，因此,核酸雜交也被稱為"DNA印跡雜交"。由于該方法是E-M6outhern于1975

年首先設(shè)計(jì)出來的，所以又叫做Southernblotting。雜交中常用的濾膜有尼龍濾膜、

硝酸纖維素濾膜和二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）等。

?核酸分子雜交包括兩個(gè)步驟：第一，將樣品轉(zhuǎn)移到濾膜（卬跡轉(zhuǎn)移）；第二，將濾膜

與DNA或RNA探針進(jìn)行雜交。具體步驟：1、轉(zhuǎn)移。2、在80℃下烘烤1?2h或用

紫外線交聯(lián)法將DNA片段永久性地固定在濾膜上。3、放入探針溶液中進(jìn)行核酸雜

交。一旦與濾膜上的單鏈DNA雜交之后，就很難再解鏈。4、用漂洗法去掉沒有雜

交上的探針分子。放射性同位素標(biāo)記的探針可檢測(cè)2ng；為了安全，我們用DIG（地

高辛）標(biāo)記探針，熒光法檢測(cè)雜交信號(hào)。

?基因組DNA被限制性內(nèi)切酶酶切為DNA片段；各片段經(jīng)電泳后在凝膠分為條帶;

（c）中由下到上是：玻璃板、一層濾紙、凝膠、濾膜、很多層濾紙、玻璃板、重物。

通過毛細(xì)管作用將凝膠上的DNA條帶原封不動(dòng)地"吸印"到濾膜上去。（d）在80℃

下烘烤1?2h或用紫外線交聯(lián)法將DNA片段永久性地固定在濾膜上并形成單鏈。（e）

濾膜放入帶標(biāo)記的DNA或RNA核酸探針溶液中進(jìn)行核酸雜交。

核甘酸序列分析

?儀器分析發(fā)展很快。

?如果將來做測(cè)序工作，有了分子生物學(xué)基礎(chǔ)，就可以做。

?如果將來工作中需要測(cè)序，一般送到公司去測(cè)。

（一）Southern印跡雜交

此技術(shù)由Southern1975年首先設(shè)計(jì)。被檢測(cè)對(duì)象為DNA。

（二）Northern印跡雜交

與Southern雜交類似。檢測(cè)目的RNA的存在與否及含量。

（三）Western印跡雜交

將待檢測(cè)蛋白質(zhì)（或酶）經(jīng)PAGE電泳并染色后，轉(zhuǎn)移到濾膜上固定，再用“抗體

-抗原”免疫反應(yīng)或“DNA-protein”結(jié)合反應(yīng)鑒別濾膜上的蛋白質(zhì)。

（四）斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交

適合于核酸樣品的定性檢測(cè)，而不是定量檢測(cè)。

優(yōu)點(diǎn)--簡(jiǎn)單、迅速；核酸粗提、多樣品檢測(cè)

缺點(diǎn)--不確定分子量、特異性不高，假陽(yáng)性

（五）原位雜交

insituhybridization

又分為菌落雜交或噬菌斑、以及真核細(xì)胞原位雜交。

標(biāo)記的核酸探針與組織切片或細(xì)胞中的待測(cè)核酸中的互補(bǔ)序列雜交。

1969.Pardue-爪蟾核糖體基因探針

1970,Orth一兔乳頭狀瘤病毒cDNA探針

?核酸原位雜交技術(shù)就是利用放射性或非放射性標(biāo)記的已知核限探針,通過放射自顯

影或非放射檢測(cè)系統(tǒng)在組織、細(xì)胞及染色體上檢測(cè)特異DNA或RNA序列的一種技

術(shù)，是一種直接、簡(jiǎn)便的研究基因定位和表達(dá)的方法。

原位雜交的雜交雙方是待測(cè)核酸序列及探針，待測(cè)核酸序列可以是克隆的基因片段，

也可以是未克隆化的基因組DNA和細(xì)胞總RNA。核酸探針是指用放射性同位素、非放射性

熒光染料直接或間接標(biāo)記的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知DNA或RNA片

段。根據(jù)其來源和性質(zhì)可分為cDNA探針、基因組DNA探針、寡核甘酸探針、RNA探針

等。

一、原位雜交的基本原理

?當(dāng)溶液中的DNA分子經(jīng)高溫或高PH處理后，DNA雙鏈分子會(huì)變性產(chǎn)生兩條單鏈,

如果將溫度逐漸下降或PH恢復(fù)到中性，單鏈會(huì)按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，重新形

成氫鍵恢復(fù)到原來的雙鏈結(jié)構(gòu)。如果兩條單鏈的來源不同，只要它們之間的堿基順

序同源互補(bǔ)或者部分同源互補(bǔ)，在條件適宜時(shí)，就可以全部或部分復(fù)性，產(chǎn)生分子

雜交。

,原位雜交技術(shù)包括有：菌落原位雜交(colonyinsituhybridization)>斑點(diǎn)雜交法(Dot

blot)>SouthernE|1跡雜交(Southernblot)>Northern印跡雜交(Northernblot)、

原位雜交(Tissueinsituhybridization)和基因組原位雜交(Genomeinsitu

hybridization)

?原位雜交組織化學(xué)技術(shù)在生命科學(xué)的研究中可視為一項(xiàng)革命性的技術(shù)。它使它們的

研究從器官、組織和細(xì)胞水平走向分子水平。為各個(gè)學(xué)科的研究帶來突破性的進(jìn)展。

其中特別突出的是細(xì)胞或組織的基因表達(dá)、染色體分析、病毒診斷和發(fā)育生物學(xué)。

原位雜交技術(shù)主要步驟：

?材料處理及細(xì)胞樣品的固定；

?樣品的制備和預(yù)處理；

?探針的制備和預(yù)雜交；

?探針及樣品的變性；

?雜交溫育；

?檢測(cè)雜交信號(hào)，進(jìn)行結(jié)果分析。

染色體制片技術(shù)發(fā)展

?染色體制片主要包括三類：一是中期染色體制片，二是粗線期染色體制片，然后是

DNA纖維制片。

?中期染色體具有良好的形態(tài)結(jié)構(gòu)，容易辨認(rèn)，分辨率低，僅能達(dá)到l~3Mb,可檢測(cè)

到的DNA序列間長(zhǎng)度一般要求超過1Mb。

?粗線期的染色體的線性長(zhǎng)度約為中期染色體的5~30倍，分辨率可達(dá)lOOkb,可識(shí)別

的DNA片段長(zhǎng)度大于lOOkbo

?DNA纖維制備技術(shù)所產(chǎn)生的染色體纖維的分辨率接近游離態(tài)DNA雙螺旋，實(shí)際實(shí)

驗(yàn)中可以達(dá)到幾個(gè)kb。

玻片的處理

?原位雜交程序繁雜而且周期長(zhǎng)，DNA更需要在玻片上表現(xiàn)出強(qiáng)有力的粘附性。

?常用的粘附劑有銘磯-明膠液、多聚賴氨酸溶液、VectorbandReagent粘附劑、

Tricholosilane(分子式為SiC13-(CH2)6-CH=CH2)、3-氨內(nèi)基三乙氧基硅烷

(3-Aminopropyl-triethoxysilane,APES)

探針制備技術(shù)

?探針的制備主要采用缺刻平移法、隨機(jī)引物法或者PCR擴(kuò)增合成，對(duì)同位素標(biāo)記探

針的方法還經(jīng)常用到末端標(biāo)記法。

?而探針的標(biāo)記物分為同位素標(biāo)記和非同位素標(biāo)記兩大類，前者標(biāo)記物一般為3H、

35S或32P：,后者有生物素或地高辛的間接標(biāo)記或者利用FITC或者羅丹明對(duì)探針

分子進(jìn)行直接標(biāo)記。

探針標(biāo)記方法

?放射性標(biāo)記有體內(nèi)標(biāo)記法及體外標(biāo)記法。

?體外標(biāo)記法不需要活體生物，所得探針放射性較高。故一般用體外標(biāo)記法。體外標(biāo)

記法有兩種：化學(xué)法和酶法。

?化學(xué)法是通過標(biāo)記物的活性基團(tuán)與核酸分子中的某種基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而進(jìn)行標(biāo)

記，標(biāo)記物直接與核酸分子相連。

?酶法是先將標(biāo)記物標(biāo)記在核背酸上,然后再通過酶促聚合反應(yīng)使帶標(biāo)記的核甘酸摻

入到核酸序列中，產(chǎn)生核酸探針。常用的有切口平移法、隨機(jī)引物法、未端標(biāo)記法。

切口平移法

?原理：DNA酶I在Mg2+離子存在時(shí)，能在雙鏈DNA的各股單鏈的不同位置上造成

隨機(jī)切口，然后在存在著一種已標(biāo)記DNTP底物(如Dig-dUTP)的體系中用大腸桿

菌聚合酶I(poll)進(jìn)行修復(fù)合成，在這個(gè)反應(yīng)過程中將已標(biāo)記的DNTP合成

進(jìn)DNA鏈中。

切口平移法可對(duì)環(huán)狀或線性雙鏈DNA進(jìn)行標(biāo)記。一般對(duì)克隆的DNA片段用這種方法標(biāo)

記的效果較好。

該方法使用時(shí)應(yīng)注意：

A.只能標(biāo)記雙鏈DNA,使用探針時(shí)要預(yù)先變性后再使用，而且標(biāo)記時(shí)DNA片段不太?。?/p>

B.DNA酶I使用的量要合適，太多會(huì)將DNA模板切碎，不能進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)：太少則不能

有效地打開缺口，使標(biāo)記物不能進(jìn)入缺口；

C.標(biāo)記時(shí)間不能太短，太短時(shí)間會(huì)造成標(biāo)記量不足，影響雜交的進(jìn)行。

隨機(jī)引物合成法

?用一些隨機(jī)引物和探針DNA片段一起加熱變性，退火后，引物與單鏈DNA互補(bǔ)結(jié)

合，再在大腸桿菌聚合酶I的作用下，按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則不斷在其3,端添加標(biāo)

記的單核甘酸修補(bǔ)缺口，合成新的探針片段。

隨機(jī)引物法是近幾年來興起的種有效的標(biāo)記方法，可與PCR技術(shù)方法結(jié)合進(jìn)行引物的

標(biāo)記。此法對(duì)于較小的DNA片段也能很好地進(jìn)行標(biāo)記，一般對(duì)基因組DNA進(jìn)行標(biāo)記時(shí)用

這種方法的效果較好。

除此之外，該方法有如下一些優(yōu)點(diǎn)：

A.模板的純度不