GB-T蛋白致敏性細(xì)胞學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范征求意見(jiàn)稿

ICS07.080

A21

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

GB/TXXXXX—201X

蛋白質(zhì)致敏性細(xì)胞學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范

Technicalspecificationsofproteinallergenicityinvitrobasedoncellular

assay

（征求意見(jiàn)稿）

201X-XX-XX發(fā)布201X-XX-XX實(shí)施

中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布

中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)1化管理委員會(huì)

GB/T××××—201×

蛋白質(zhì)致敏性細(xì)胞學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了以嗜堿性粒細(xì)胞活化試驗(yàn)對(duì)蛋白質(zhì)致敏性評(píng)價(jià)的方法，包括儀器和設(shè)備，試劑和材料，

分析步驟及結(jié)果計(jì)算。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于蛋白質(zhì)的細(xì)胞致敏性測(cè)定，包括β-氨基己糖苷酶釋放率、半最大效應(yīng)濃度。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

3術(shù)語(yǔ)與定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

β-氨基己糖苷酶釋放率β-hexosaminidasereleaserate

蛋白質(zhì)與處于活化狀態(tài)的RBL-2H3細(xì)胞結(jié)合后，會(huì)使其產(chǎn)生脫顆粒效應(yīng)從而導(dǎo)致β－氨基己糖苷酶

的釋放，上清液中β－氨基己糖苷酶含量與細(xì)胞內(nèi)總的β－氨基己糖苷酶含量的比值表示β-氨基己糖苷酶

釋放率。

3.2

半最大效應(yīng)濃度concentrationfor50%ofmaximaleffect,EC50

指β-氨基己糖苷酶最大釋放率的一半時(shí)對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度。

4原理

嗜堿性粒細(xì)胞RBL-2H3細(xì)胞表面含有大量高親和力IgE受體，當(dāng)處于被IgE活化狀態(tài)時(shí)，RBL-2H3

細(xì)胞與蛋白質(zhì)結(jié)合后，會(huì)引起細(xì)胞膜穩(wěn)定性下降，產(chǎn)生脫顆粒效應(yīng)，從而在胞外釋放出β－氨基己糖苷

酶等生物活性物質(zhì)，通過(guò)測(cè)定β－氨基己糖苷酶釋放率和半最大效應(yīng)濃度可以評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)致敏程度。

5儀器和設(shè)備

GB/T××××—201×

5.1離心機(jī)：相對(duì)離心力≥1000×g

5.2微量移液器：規(guī)格2.5μL，20μL，200μL，1mL

5.3恒溫水浴鍋：精度0.1℃

5.4二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱：精度0.1℃

5.5電子分析天平：精度0.1mg

5.6酶標(biāo)儀:檢測(cè)波長(zhǎng)405nm

6試劑和材料

使用分析純?cè)噭┖头螱B/T6682規(guī)定的二級(jí)水，除非另有說(shuō)明。

6.1小鼠IgE抗體

6.210mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.2（，）

稱(chēng)取80gNaCl，2gKCl，2gKH2PO4，36.2gNa2HPO4·12H2O，溶于超純水，全部溶解后，定容

至1000mL，充分混勻后，調(diào)pH至7.2，0.22μm微孔濾膜濾過(guò)除菌，4℃保存?zhèn)溆没蛸?gòu)買(mǎi)同類(lèi)商品化產(chǎn)

品。

6.3嗜堿性粒細(xì)胞系：RBL-2H3(ATCCCRL-2256)

6.4MEM細(xì)胞培養(yǎng)基

取5%終體積的水加入到1L燒杯中，將MEM干粉培養(yǎng)基倒入燒杯，水洗包裝袋內(nèi)面兩次，倒入燒杯

中，磁力攪拌助溶，隨后加入2.2gNaHCO3，2.383gHEPES。加水定容至1000mL，用HCl或者NaOH調(diào)

節(jié)pH至7.2，0.22μm微孔濾膜濾過(guò)除菌，4℃保存?zhèn)溆没蛸?gòu)買(mǎi)同類(lèi)商品化產(chǎn)品。臨用前加10%胎牛血清

(FBS)、1%青霉素/鏈霉素。

6.5PNAG溶液

稱(chēng)取3.68gNa2HPO4·12H2O，0.933g檸檬酸，溶解后加入34.2g

4-nitrophenylNacetyl-p-D-glucosaminide（PNAG），加超純水定容至100mL，即為1mmol/LPNAG溶液。

6.6Na2CO3終止液

GB/T××××—201×

稱(chēng)取5gNa2CO3，加水定容至118mL，避光保存。

6.7臺(tái)氏液（Tyrode’s）

..

準(zhǔn)確稱(chēng)取8.0gNaCl,0.2gKCl,0.26gMgSO47H2O,0.065gNaH2PO42H2O,1.0gNaHCO3,0.2gCaCl2和

1.0g葡萄糖，加水定容至1000mL，充分混勻后，調(diào)pH至7.2，0.2μm微孔濾膜濾過(guò)除菌，4℃保存?zhèn)溆?/p>

或購(gòu)買(mǎi)同類(lèi)商品化產(chǎn)品。

7分析步驟

7.1細(xì)胞培養(yǎng)

2

將RBL-2H3細(xì)胞，置于75cm培養(yǎng)瓶中，加入10mL含10%FBS的MEM培養(yǎng)液，于37℃，5%CO2培

養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。

7.2細(xì)胞接種

在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)（達(dá)80-90%）時(shí)，棄去培養(yǎng)液，向瓶?jī)?nèi)

加入2.0mL胰蛋白酶液，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓，迅速拿回操作臺(tái)，

棄去胰蛋白酶液，向瓶?jī)?nèi)加入10mL含10%FBS的MEM培養(yǎng)液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使得細(xì)胞以

5

1×10/mL（200μL/孔）接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h使其貼壁。

7.3細(xì)胞活化

棄去上述96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上的細(xì)胞培養(yǎng)液，用pH7.2的PBS緩沖液200μL/孔洗滌，洗滌三次后，加

入100μL/孔含IgE抗體（濃度為50μg/mL）的MEM培養(yǎng)液，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

7.4細(xì)胞與蛋白激發(fā)

7.4.1樣品組：棄去上述培養(yǎng)液，用pH7.2的PBS緩沖液200μL/孔洗滌，洗滌3次，洗液全部吸凈后，各

組依次加入不同稀釋度的待測(cè)蛋白(0.05μg/mL,0.1μg/mL,0.5μg/mL,1μg/mL,5μg/mL,10μg/mL)。上

述蛋白溶液均用Tyrode's緩沖液稀釋?zhuān)?0μL/孔，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱反應(yīng)45min。反應(yīng)結(jié)束后，放入

冰盒中終止反應(yīng)。

7.4.2全部釋放組：棄去上述培養(yǎng)液，用pH7.2的PBS緩沖液200μL/孔洗滌，洗滌3次，洗液全部吸凈后，

加入50μL/孔1%TritionX-100裂解液，輕輕吹打使得裂解液和RBL-2H3細(xì)胞充分接觸，置于4℃反應(yīng)

45min后，吸取培養(yǎng)上清，1000×g離心5min,收集上清液。

GB/T××××—201×

7.4.3空白對(duì)照組：棄去上述培養(yǎng)液，用pH7.2的PBS緩沖液200μL/孔洗滌，洗滌3次，洗液全部吸凈后，

用50μL/孔Tyrode's緩沖液代替蛋白處理細(xì)胞，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱反應(yīng)45min。

7.5β-氨基己糖苷酶含量測(cè)定

將作用后的反應(yīng)液，按30μL/孔上清液轉(zhuǎn)移至96孔板，加入50μLPNAG溶液，37℃反應(yīng)1h后，加

200μL碳酸鈉終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)405nm處測(cè)各孔吸光度值。樣品組的吸光度標(biāo)記為

C1，空白對(duì)照組的吸光度標(biāo)記為C0，全部釋放組標(biāo)記為Cm。

8結(jié)果計(jì)算

8.1β-氨基己糖苷酶釋放率

按照式（1）計(jì)算：

[CC]

r10100%………………….（1）

(CmC0)

式中：

r——釋放率（%）；

C1——樣品組吸光度；

C0——空白對(duì)照組吸光度；

Cm——全部釋放組吸光度。

8.2半最大效應(yīng)濃度（EC50