GB-T微生物源抗生素類次生代謝物抗細(xì)菌活性測定 抑菌圈法征求意見稿

ICS07.080

A21

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

GB/TXXXXX—201X

微生物源抗生素類次生代謝產(chǎn)物抗細(xì)菌活

性測定抑菌圈法

Themethodofassayingantibacterialactivityformicrobialsecondary

metabolites——inhibitionzonemethod

（征求意見稿）

201X-XX-XX發(fā)布201X-XX-XX實(shí)施

中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布

中國國家標(biāo)準(zhǔn)1化管理委員會(huì)

GB/T××××—201×

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GB/T××××—201×

微生物源抗生素類次生代謝產(chǎn)物抗細(xì)菌活性測定抑菌圈法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了微生物源抗生素類次生代謝產(chǎn)物抗細(xì)菌活性抑菌圈法測定原理、儀器設(shè)備及器具、試

劑和材料、操作步驟和結(jié)果判定。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于微生物源抗生素類次生代謝產(chǎn)物抗細(xì)菌活性測定.

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

抑制中濃度medianinhibitionconcentration，IC50

次生代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)菌的抑制率達(dá)到50%時(shí)所用的濃度。

3.2

抑細(xì)菌活性antibacterialactivity

具有抑制細(xì)菌生長繁殖的能力。

3.3

抗菌圈zoneofmicrobialinhibition

也稱抗菌圈，固體培養(yǎng)基表面與試樣接觸的邊界處無菌繁殖的環(huán)帶區(qū)域。

4原理

利用待測次生代謝產(chǎn)物在瓊脂平板中擴(kuò)散使其周圍的細(xì)菌生長受到抑制形成的抑菌圈大小，計(jì)算

IC50來判定待測次生代謝產(chǎn)物抑菌效果。

本方法適用于微生物源抗生素類次生代謝產(chǎn)物的抗細(xì)菌活性測定方法。

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GB/T××××—201×

5儀器設(shè)備及器具

5.1超凈工作臺(tái)

可滿足無菌要求的潔凈工作臺(tái)、生物安全柜或無菌室。

5.2恒溫培養(yǎng)箱

溫度范圍5℃~50℃。

5.3電子天平

精度為0.0001g。

5.4無菌培養(yǎng)皿

帶陶瓦蓋，直徑90mm。

5.5牛津杯

不銹鋼，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格：內(nèi)徑6mm、外徑8mm、高10mm。

5.6測量儀

游標(biāo)卡尺或抑菌圈測量儀，精度0.1mm。

5.7分光光度計(jì)

檢測波長600nm。

6試劑和材料

本方法所用試劑均為分析純，除特殊說明外，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T6682規(guī)定的二級(jí)水。

6.1LB液體培養(yǎng)基

胰蛋白胨10.0g

酵母提取物5.0g

氯化鈉10.0g

蒸餾水1000mL

將上述各成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2，分裝至錐形瓶中，121℃滅菌20min，

備用。也可采用市售的商業(yè)培養(yǎng)基。

用途：用于指示菌菌種的活化及菌懸液的培養(yǎng)。

6.2LB固體培養(yǎng)基

胰蛋白胨10.0g

酵母提取物5.0g

氯化鈉10.0g

瓊脂20.0g

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GB/T××××—201×

蒸餾水1000mL

將上述各成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2，分裝至錐形瓶中，121℃滅菌20min，

備用。也可采用市售的商業(yè)培養(yǎng)基。

用途：用于指示菌的培養(yǎng)及含菌檢測平板的制備。

6.3指示菌標(biāo)準(zhǔn)菌株

革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）ATCC6538。

革蘭氏陰性菌：大腸桿菌（Escherichiacoli）ATCC11229。

7操作步驟

7.1凍干菌活化

將凍干菌融化分散在5mL的LB液體培養(yǎng)基中成懸浮狀，在37℃±2℃下培養(yǎng)18~24h。用接種環(huán)

取菌懸液以劃線法接種到LB固體平板上，在37℃±2℃下培養(yǎng)18~24h。從培養(yǎng)皿上挑取典型菌落接

種在LB固體培養(yǎng)基斜面試管內(nèi)，，在37℃±2℃下培養(yǎng)18~24h。將試管斜面貯存于冰箱內(nèi)（5℃

~10℃），作為保存菌，保存期不超過一個(gè)月，每月傳代一次，傳代次數(shù)不超過10代。

7.2試驗(yàn)菌懸液制備

7.2.1用接種環(huán)取保存菌，以劃線法接種到LB固體平板上，37℃±2℃下培養(yǎng)24h。

注：平皿在5℃~10℃條件下保存，在1周內(nèi)使用。

7.2.2取LB液體培養(yǎng)基20mL放入100mL的三角燒瓶內(nèi)，用接種環(huán)取7.2.1平皿上的典型菌落接種在LB

液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度37℃±2℃，振動(dòng)頻率110min-1，時(shí)間18~24h。

7.2.3用蒸餾水20倍稀釋LB液體培養(yǎng)基，用其調(diào)節(jié)培養(yǎng)后的菌濃度為1×108CFU/mL~5×108CFU/mL，

作為試驗(yàn)菌液。采用分光光度計(jì)或適當(dāng)?shù)姆椒y定菌液濃度。

注：試驗(yàn)菌液冰冷保存（3℃~4℃），在4h內(nèi)使用。

7.3供試樣品制備

將供試樣品配置成一定濃度的母液，并用無菌水將母液按2倍濃度稀釋，制備成至少5個(gè)不同濃度的

待測溶液，備用。

7.4檢測平板制備

傾注融化并冷卻至55℃左右的LB固體培養(yǎng)基10mL于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，待其凝固后制成LB平板，備

用。

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GB/T××××—201×

將7.2.3中的試驗(yàn)菌液分別用冷卻至55℃左右的LB固體培養(yǎng)基按1∶10的比例稀釋，充分混勻后各取

5mL至上述已制備好的LB平板內(nèi)，輕輕搖動(dòng)平板使菌液均勻鋪平，待其凝固后制成檢測平板，備用。

7.5抑菌活性測定

分別將牛津杯輕輕地放在7.4制備的平板中，而后用無菌吸管分別將7.3中制備的200μL不同濃度的

供試樣品溶液加入牛津杯中，空白對(duì)照組加入200μL無菌水，每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)。將平板正置于36℃

±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，取出，用測量儀測量待測樣品和空白對(duì)照形成的抑菌圈直徑。

8結(jié)果判定

8.1計(jì)算方法

抑制率按式（1）計(jì)算：

處理對(duì)照

R=…………（1）

???對(duì)?照?

式中：??×100

R——抑制率（%）；

CK處理——供試次生代謝產(chǎn)物平板中形成的抑菌圈直徑（mm）；

CK對(duì)照——空白對(duì)照平板中形成的抑菌圈直徑（mm）。

8.2結(jié)果分析

根據(jù)藥劑濃度對(duì)數(shù)值與對(duì)應(yīng)抑制率的幾率值作回歸分析，