溫度對發(fā)酵的影響

PAGEPAGE7溫度對發(fā)酵的影響（1）影響產(chǎn)物生成速率和產(chǎn)率.溫度越高，酶反應(yīng)速度越快，微生物細(xì)胞生長代謝加快，產(chǎn)物提前生成。（2）改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)而間接影響發(fā)酵.改變培養(yǎng)液的物理性質(zhì)會影響到微生物細(xì)胞的生長。例如，溫度通過影響氧在培養(yǎng)液中的溶解、傳遞速度等，進而影響發(fā)酵過程。（3）影響生物合成的方向：金色鏈霉菌的四環(huán)素發(fā)酵中，在低于30℃主要合成金霉素，溫度達35（4）影響酶系組成及酶的特性：溫度越高，酶反應(yīng)速度越快，微生物細(xì)胞生長代謝加快，產(chǎn)物提前生成。但溫度升高，酶的失活也越快，表現(xiàn)出微生物細(xì)胞容易衰老，使發(fā)酵周期縮短，從而影響發(fā)酵過程最終產(chǎn)物的產(chǎn)量。（5）同一種生產(chǎn)菌，菌體生長和積累代謝產(chǎn)物的最適溫度也往往不同。最適溫度：最適于菌的生長或發(fā)酵產(chǎn)物生成的溫度。如谷氨酸菌的生長最適溫度為30℃-32℃pH值對發(fā)酵的影響發(fā)酵液pH的改變將對發(fā)酵產(chǎn)生很大的影響。①改變細(xì)胞膜的電荷性質(zhì)，影響新陳代謝的正常進行。原生質(zhì)體膜具有膠體性質(zhì)，在一定pH時原生質(zhì)體膜可以帶正電荷，而在另一pH值時，原生質(zhì)體膜則帶負(fù)電荷。這種電荷的改變同時會引起原生質(zhì)體膜對個別離子滲透性的改變，從而影響微生物對培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝產(chǎn)物的分泌，妨礙新陳代謝的正常進行。如產(chǎn)黃青霉的細(xì)胞壁厚度隨pH的增加而減小，其菌絲的直徑在pH6.0時為2～3um，在pH7.4時，則為2～1.8um，呈膨脹酵母狀細(xì)胞，隨pH下降菌絲形狀可恢復(fù)正常。②影響菌體代謝方向。培養(yǎng)液的pH對微生物的代謝有更直接的影響。在產(chǎn)氣桿菌中，與吡咯并喹呤醌(PQQ)結(jié)合的葡萄糖脫氫酶受培養(yǎng)液pH影響很大。在鉀營養(yǎng)限制性培養(yǎng)基中，pH8.O時不產(chǎn)生葡萄糖酸，而在pH5.0～5.5時產(chǎn)生的葡糖酸和2-酮葡萄糖酸最多。此外，在硫或氨營養(yǎng)限制性的培養(yǎng)基中，此菌生長在pH5.5下產(chǎn)生葡萄酸與2-酮葡萄酸，但在pH6.8時不產(chǎn)生這些化合物。發(fā)酵過程中在不同pH范圍內(nèi)以恒定速率(O.055%／h)加糖，青霉素產(chǎn)量和糖耗并不一樣，見表8—4。表8—4在不同pH范圍內(nèi)恒定速率加糖，青霉素產(chǎn)量和糖耗的關(guān)系pH范圍糖耗殘?zhí)荘enG相對單位pH范圍糖耗殘?zhí)荘enG相對單位pH6．O～6.3加糖pH6.6～6.9加糖10%7%O.5％0.2％較高高pH7.3～7.6pH6.8控制加糖7%<7%>O.5％<O.2％低最高③影響代謝產(chǎn)物合成。如采用基因工程菌畢赤酵母生產(chǎn)重組人血清白蛋白，生產(chǎn)過程中最不希望產(chǎn)生蛋白酶。在pH5.0以下，蛋白酶的活性迅速上升，對白蛋白的生產(chǎn)很不利；而pH在5.6以上則蛋白酶活性很低，可避免白蛋白的損失。不僅如此，pH的變化還會影響菌體中的各種酶活以及菌體對基質(zhì)的利用速率，從而影響菌體的生長和產(chǎn)物的合成。故在工業(yè)發(fā)酵中維持生長和產(chǎn)物合成的最適pH是生產(chǎn)成敗的關(guān)鍵之一。CO2對發(fā)酵的影響（1）CO2可作為重要的基質(zhì)。如在以氨甲酰磷酸為前體之一的精氨酸的合成過程中，無機化能營養(yǎng)菌能以CO2作為唯一的碳源加以利用。異養(yǎng)菌在需要時可利用補給反應(yīng)來固定CO2，細(xì)胞本身的代謝途徑通常能滿足這一需要。若發(fā)酵前期大量通氣，可能出現(xiàn)CO2減少，導(dǎo)致這種異養(yǎng)菌延遲期延長。（2）溶解在發(fā)酵液中的CO2對氨基酸、抗生素等發(fā)酵有抑制或刺激作用。大多數(shù)微生物適應(yīng)低含量CO2(O.02％～O.04％)。當(dāng)尾氣CO2含量高于4％時，微生物的糖代謝與呼吸速率下降；當(dāng)CO2分壓為0.08×105Pa時，青霉素比合成速率降低40％。又如發(fā)酵液中溶解CO2為O.0016％時會強烈抑制酵母的生長。當(dāng)進氣CO2含量占混合氣體流量的80％時，酵母活力只有對照值的80％。在充分供氧條件下，即使細(xì)胞的最大攝氧率得到滿足，發(fā)酵液中的CO2濃度對精氨酸和組氨酸發(fā)酵仍有影響。組氨酸發(fā)酵中CO2分壓大于0.05×105Pa時，其產(chǎn)量隨CO2分壓的提高而下降。精氨酸發(fā)酵中有一最適CO2分壓，即1.25×105Pa,高于此值對精氨酸合成有較大影響。因此，即使供氧已足夠,但應(yīng)考慮通氣量,以控制發(fā)酵液中的CO2含量。（3）CO2抑對氨基糖苷類抗生素如紫蘇霉素的合成也有影響。當(dāng)進氣中的CO2含量為1%和2%時，紫蘇霉素的產(chǎn)量分別為對照組的2/3和1/7。（4）CO2對細(xì)胞的作用機制溶解于培養(yǎng)液中的CO2主要作用在細(xì)胞膜的脂溶性部位，而CO2溶解于水后形成的HCO3-則影響細(xì)胞膜上的膜磷脂、膜蛋白質(zhì)等親水性部位。當(dāng)細(xì)胞膜的脂質(zhì)相中CO2濃度達一臨界值時，使膜的流動性及表面電荷密度發(fā)生變化，這將導(dǎo)致許多基質(zhì)的跨膜運輸受阻，影響了細(xì)胞膜的運輸效率，使細(xì)胞處于“麻醉”狀態(tài)，細(xì)胞生長受到抑制，形態(tài)發(fā)生了變化。為了排除CO2的影響，工業(yè)生產(chǎn)中需要綜合考慮發(fā)酵液的溫度、通氣狀況和CO2在發(fā)酵液中的溶解度。用呼吸商RQ表示：RQ=CER/OUR=QCO2*X/QO2*X式中：CERCO2釋放率OUR菌耗氧速率QO2呼吸強度mol/(g.h)QCO2比釋放速率mol/(g.h)X菌體干重g/L發(fā)酵過程中尾氣O2含量的變化恰與CO2含量的變化成反向同步關(guān)系，由此可判斷菌的生長、呼吸情況，求得菌的呼吸商RQ值。3、呼吸商與發(fā)酵的關(guān)系（1）RQ可以反映菌的代謝情況：如酵母發(fā)酵過程RQ=1，表示糖代謝走有氧分解代謝途徑，僅生成菌體，無產(chǎn)物形成；RQ>1.1,表示走EMP途徑,生成乙醇.(2)菌在利用不同基質(zhì)時,RQ值也不相同.如大腸桿菌發(fā)酵,丙酮酸RQ=1.26,葡萄糖RQ=1.02(3)在抗生素發(fā)酵的不同階段,RQ值也不相同:菌體生長RQ=0.909,菌體維持RQ=1,青霉素合成RQ=4基質(zhì)濃度對發(fā)酵的影響（1）momod模型μ=μmax*S/(Ks+S)式中：μ比生長速率μmax最大的比生長速率S基質(zhì)濃度Ks飽和常數(shù)，是在μ=0.5μmax時的基質(zhì)濃度解釋P148圖9-34（2）、基質(zhì)濃度對發(fā)酵的影響1）高濃度基質(zhì)制菌體生長和產(chǎn)物形成：主要是通過高滲壓脫水、酶中毒、分解代謝物阻遏作用實現(xiàn)的。2）培養(yǎng)基過于豐富，菌體生長過盛，對產(chǎn)物合成不利。染菌的主要途徑1）種子帶菌2）無菌空氣帶菌3）操作不當(dāng)4）培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌不徹底5）冷卻管等設(shè)備滲濾6）泡沫外溢雜菌污染的預(yù)防1）杜絕種子染菌強無菌室管理、嚴(yán)格接種的無菌操作、定期取樣無菌檢驗。2）消滅設(shè)備和管道死角檢查設(shè)備消除死角、發(fā)酵罐每使用一次應(yīng)徹底洗刷一次。3）防止設(shè)備滲漏經(jīng)常檢查，按時更換和修理4）加強空氣凈化，防止空氣帶菌減少進口空氣中的含菌數(shù)、加強對空氣的除油除水保證介質(zhì)過濾的高效率、合理設(shè)計過濾器、按要求裝填過濾介質(zhì)、定期檢查分過濾器。發(fā)酵產(chǎn)物的提取與精制過程一般包括如下四個階段：(1)發(fā)酵液的預(yù)處理即去除細(xì)胞及不溶性物質(zhì)，主要單元操作方法是離心和過濾。此階段產(chǎn)品濃度和質(zhì)量僅有少量改善，其主要任務(wù)是去除發(fā)酵液中的固體物質(zhì)，為后續(xù)階段提供澄清、潔凈的原料液。(2)產(chǎn)品的提取主要單元操作方法有萃取、吸附、沉淀、蒸發(fā)等典型方法。此階殷主要任務(wù)是去除與目的產(chǎn)物有較大差異的物質(zhì)以提高產(chǎn)品濃度，而提高產(chǎn)品質(zhì)量為輔。(3)產(chǎn)品的精制主要單元操作方法有層析法、膜分離法、離子交換法、沉淀法、電泳法等。此階段的主要任務(wù)是去除與目的產(chǎn)物有類似化學(xué)性質(zhì)和物理性質(zhì)的雜質(zhì)，使產(chǎn)物的純度有較大程度的提高。(4)產(chǎn)品的最后加工主要單元操作方法有結(jié)晶、干燥、蒸餾等。最終產(chǎn)品的使用要求決定了此階段可采用的方法。提取與精制的工藝流程從該程序可見，各種發(fā)酵醪特性不同，含菌體不同，發(fā)酵產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)不同，提取和精制的方法的選擇也不同。對于某些發(fā)酵產(chǎn)品，在提取和精制過程中要注意防止變性和降解現(xiàn)象的發(fā)生。例如，酶制劑、抗生素、單細(xì)胞蛋白、氨基酸及核酸等，由于其大分子空間結(jié)構(gòu)主要依靠氫鍵、鹽鍵和范德華引力而形成，過酸、過堿、高溫、劇烈的機械作用、強烈的輻射等都可能導(dǎo)致大分子活性的喪失和不穩(wěn)定。因此，在提取和精制過程中要注意避免pH值過高或過低，避免高溫、劇烈攪拌而產(chǎn)生大量泡沫，避免和重金屬離子及其他蛋白質(zhì)變性劑接觸。有必要用有機溶劑處理的，必須在低溫下，短時間內(nèi)進行。有些酶以金屬離子或小分子有機化合物為輔基，在進行提取和精制時，要防止這些輔基的流失。此外，在發(fā)酵液中，除所需要的酶以外，常常還同時存在蛋白酶，為防止發(fā)酵醪中所需的酶被蛋白酶分解，要及早除去蛋白酶或使其失活。生產(chǎn)效率又稱發(fā)酵速率，是指單位操作時問、單位發(fā)酵體積所產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物量，它是評價發(fā)酵生產(chǎn)的主要指標(biāo)之一。生產(chǎn)效率有如下兩種表示方法：發(fā)酵過程的生產(chǎn)速率和發(fā)酵設(shè)備的生產(chǎn)能力。發(fā)酵液中的產(chǎn)物濃度一般以g/L表示，也有用質(zhì)量百分比表示的,對于活性物質(zhì)產(chǎn)品，則常采用活性單位，稱為發(fā)酵單位或發(fā)酵效價，以U/mL表示.發(fā)酵產(chǎn)物濃度在一定情況下可以代表菌種和發(fā)酵水平的高低，如酶試劑、抗生素等基質(zhì)轉(zhuǎn)化率是指發(fā)酵工藝中所使用的主要基質(zhì)(一般指碳源或其他成本較高的基質(zhì))轉(zhuǎn)化為發(fā)酵產(chǎn)物的得率，常以g/kg或%表示。對于微生物代謝產(chǎn)物的發(fā)酵，基質(zhì)轉(zhuǎn)化率通常是指發(fā)酵使用的碳源轉(zhuǎn)化為目的產(chǎn)物的得率。對于細(xì)胞產(chǎn)品，則指碳源合成細(xì)胞的得率。對于生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)品，基質(zhì)轉(zhuǎn)化率表示前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的得率。對于活性物質(zhì)產(chǎn)品，基質(zhì)轉(zhuǎn)化率的含義中還必須包括活力單位?；|(zhì)轉(zhuǎn)化率是原材料成本效益的指示值以好氧發(fā)酵產(chǎn)品為例，試述生產(chǎn)工藝流程和工藝控制要點谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝（一）、工藝流程淀粉--→糖液--→發(fā)酵--→提取--→精制--→包裝--→成品菌種（二）、操作要點1、淀粉水解糖的制備（1）酸水解工藝流程原料（淀粉、水、鹽酸）→調(diào)漿（調(diào)漿）→糖化→冷卻→中和、脫色→過濾→糖液（2）工藝要點1）調(diào)漿：淀粉乳濃度為10—11。波美，用鹽酸調(diào)pH值1.5左右。2）糖化：在糖化鍋內(nèi)進行，直接蒸汽加熱，壓力（表壓）控制29.34*104—34.43*104Pa，時間為25min。3）冷卻：將糖化醪溫度控制在80℃4）中和：用燒堿配成一定濃度調(diào)pH值4.0—5.0左右，使糖液中蛋白質(zhì)和其它膠體物質(zhì)沉淀析出。5）脫色：用粉末活性炭脫色，用量為淀粉原料的0.6%--0.8%，在70℃6）過濾：過濾溫度控制在45--60℃2、菌種的擴大培養(yǎng)（1）工藝流程菌種--→斜面培養(yǎng)--→一級種子培養(yǎng)--→二級種子培養(yǎng)--→發(fā)酵（2）工藝要點1）菌種：我國生產(chǎn)谷氨酸的菌種有北京棒狀桿菌AS1229、鈍齒棒狀桿菌AS1542、HU7251及7338、B9、T6-13、672等。2）斜面培養(yǎng)：A、培養(yǎng)基：葡萄糖0.1%、牛肉膏1%、蛋白胨1%、氯化鈉0.5%、瓊脂2%，40%氫氧化鈉溶液調(diào)pH7.0—7.2；B、裝試管：傳代用斜面每支18*180試管裝約10毫升，生產(chǎn)用斜面每支25*200毫升裝約25毫升；C、滅菌：120℃，30min,取出冷至45℃攤成斜面，凝固后入培養(yǎng)箱32-D、經(jīng)分離復(fù)壯、活化至第三代的斜面菌種，在無菌操作下移種（1支接10支左右），于32--34℃3）一級種子培養(yǎng)A、培養(yǎng)基：葡萄糖2.5%、尿素0.5%、硫酸鎂0.04%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸亞鐵2ppm、硫酸錳2ppm、玉米漿3%--3.5%，40%氫氧化鈉溶液調(diào)pH7.0—7.2；B、裝三角瓶：1000毫升三角瓶液量約200毫升，瓶口包扎要緊；C、滅菌：120℃D、接種培養(yǎng)：一支斜面菌接5瓶，34℃E、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：種齡11--12h、pH6.4±0.1、OD凈增0.5以上、殘?zhí)?.5%以下、無雜菌和噬菌體，鏡檢菌體生長均勻、粗壯、排列整齊、革蘭氏陽性反應(yīng)。4）二級種子培養(yǎng)：A、接種培養(yǎng)：培養(yǎng)基與一級相似，主要區(qū)別在于用水解糖代替葡萄糖，一般于32℃B、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：種齡7--10h、pH7.2左右、OD凈增0.5左右、殘?zhí)窍?%左右、無雜菌和噬菌體，鏡檢菌體生長旺盛、排列整齊、革蘭氏陽性反應(yīng)，活菌數(shù)為每毫升含108—109個細(xì)胞。3、谷氨酸發(fā)酵發(fā)酵過程中代謝變化以P216圖25—6為例說明。（1）初期：菌體生長的遲滯期，糖基本沒有利用，pH因尿素分解有所上升，一般為2--4h；（2）對數(shù)生長期：主要是菌體生長，耗糖快，pH先升后降，溶氧急劇下降后維持在一定水平上，菌體濃度（OD）迅速增大。操作時通過流加尿素以供給氮源和調(diào)pH7.5—8.0，控溫在30--32℃（3）谷氨酸合成期：微生物利用糖與尿素分解后產(chǎn)生的α-酮戊二酸和氨合成谷氨酸。流加尿素控制pH7.2—7.4，加大通風(fēng)，提高發(fā)酵溫度至34--37℃（4）發(fā)酵后期：當(dāng)營養(yǎng)耗盡酸不再增加時，應(yīng)及時放罐，發(fā)酵周期一般為30多小時。4、谷氨酸提取提取方法一般有等電點法、離子交換法、金屬鹽沉淀法、鹽酸鹽法和電滲析法及其組合法，以等電點法為例講述其工藝流程：發(fā)酵液→↓←起晶中和點pH4—4.5↓20。波美鹽酸育晶2h↓←等電攪拌pH3—3.22↓靜置沉淀4—6h↓→母液菌體及細(xì)小GA←離心分離↓谷氨酸等電