外植體褐變及解決措施

第第頁(yè)外植體褐變及解決措施外植體褐變及其解決措施植物組織培育過(guò)程中，褐變問(wèn)題普遍存在，與菌類(lèi)污染和玻璃化現(xiàn)象并稱為植物組織培育的三大難題。針對(duì)褐變難題，本文結(jié)合相關(guān)資料，對(duì)影響褐變的因素作了全面分析，并針對(duì)這些因素提出了相應(yīng)的解決措施。

褐變是指外植體在培育過(guò)程中，自身組織向表面培育基釋放褐色物質(zhì)，以致培育基漸漸變成褐色，外植體也隨之進(jìn)一步變褐而死亡的現(xiàn)象。

一、褐變產(chǎn)生的機(jī)理

1.非酶促褐變

非酶促褐變是由于細(xì)胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細(xì)胞程序化死亡或自然發(fā)生的細(xì)胞死亡，即壞死形成的褐變現(xiàn)象，并不涉及酚類(lèi)物質(zhì)的產(chǎn)生。徐振彪等將生長(zhǎng)正常的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含NaCl的培育基中，組織四周尤其是接觸培育基部分發(fā)生褐變，但培育基中沒(méi)有看到擴(kuò)散的褐化物質(zhì)。當(dāng)溫度上升時(shí)繼代保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也會(huì)發(fā)生此類(lèi)現(xiàn)象。但這種褐變假設(shè)采用適當(dāng)措施或者愈傷組織適應(yīng)了脅迫環(huán)境就不再發(fā)生了。

2.酶促褐變

目前認(rèn)為植物組織培育中的褐變主要是由酶促褐變引起的，培育材料變褐主要是由傷口處分泌的酚類(lèi)化合物引起的。酶促褐變猶如一般的酶促反應(yīng)，其發(fā)生需要具備三個(gè)條件，即酶、底物和氧。引起褐變的酶有多酚氧化酶(PPO)、過(guò)氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。從初次培育和繼代培育過(guò)程中試管苗的褐變程度和PPO的活性來(lái)看，說(shuō)明PPO活性的高低是引起培育材料褐變的關(guān)鍵。引起褐變的酶的底物主要是酚類(lèi)化合物，按其組成可分成3類(lèi):苯基羧酸〔包括鄰羥基苯酚、兒茶酚、沒(méi)食子酸、莽草酸等〕，苯丙烷衍生物〔包括綠原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、單寧、木質(zhì)素等〕，第三類(lèi)是黃烷衍生物〔包括花青素、黃酮、蕓香苷等〕，但并非全部的酚類(lèi)物質(zhì)都是PPO的底物。

在正常發(fā)育的植物組織中,底物、氧氣、PPO同時(shí)存在并不發(fā)生褐變，是由于在正常的組織細(xì)胞內(nèi)由于多酚類(lèi)物質(zhì)分布在細(xì)胞的液泡內(nèi)，而PPO那么分布在各種質(zhì)體或細(xì)胞質(zhì)中，這種區(qū)域性分布使底物與PPO不能接觸。而當(dāng)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變和破壞時(shí)，那么為酶制造了與PPO接觸的條件，在氧存在的狀況下使酚類(lèi)物質(zhì)氧化成醌，進(jìn)行一系列的脫水、聚合反應(yīng)，最末形成黑褐色物質(zhì)，從

而引起褐變。

二、褐變產(chǎn)生的影響因素

1.植物種類(lèi)及基因型不同的植物和不同的基因型決斷了不同的褐化程度。在組織培育中，品種褐化難易可能是與該品種中多酚類(lèi)物質(zhì)含量的多少及多酚氧化酶〔PPO〕活性的差異有關(guān)。木本植物和單寧含量高的植物都簡(jiǎn)單褐變，一般木本植物比草本植物更簡(jiǎn)單發(fā)生很扁現(xiàn)象，如鵝掌楸、油茶等，褐變現(xiàn)象特別明顯。

2.材料的年齡和生理狀態(tài)很多試驗(yàn)說(shuō)明，幼齡材料酚類(lèi)物質(zhì)含量少，褐變現(xiàn)象較輕；成齡材料酚類(lèi)物質(zhì)含量較多，簡(jiǎn)單發(fā)生褐變。

3.取材時(shí)間和部位由于植物體內(nèi)酚類(lèi)化合物含量和多酚氧化酶的活性在不同的生長(zhǎng)季節(jié)不相同，一般在生長(zhǎng)季節(jié)，酚類(lèi)物質(zhì)含量增加，多酚氧化酶的活性也漸漸加強(qiáng)，褐變現(xiàn)象回嚴(yán)峻許多，因而一般都選在早春或秋季取材。同一外植體不同取材部位，褐變程度不同，如蘋(píng)果、石竹、菊花，選擇頂芽比側(cè)芽，褐變程度低，更易成活。王異星用荔枝無(wú)菌苗不同組織的誘導(dǎo)試驗(yàn)說(shuō)明，莖最簡(jiǎn)單誘導(dǎo)出愈傷組織，培育2周后長(zhǎng)出淺黃色的愈傷組織；葉大部分不能產(chǎn)生愈傷組織或誘導(dǎo)出的愈傷組織中度褐變；而根極大部分不產(chǎn)生愈傷組織，誘導(dǎo)出的愈傷組織全部褐變。因此，取材時(shí)應(yīng)選擇褐變程度輕的部位。

4.外植體的大小肯定程度上，外植體材料越小越簡(jiǎn)單發(fā)生褐變，相對(duì)較大的材料涌現(xiàn)褐變程度較輕。

5.外植體材料受傷程度外植體材料受傷會(huì)加劇褐變的發(fā)生。取材時(shí)，應(yīng)用銳利的器械，盡可能減削受傷面積，以減輕褐變的發(fā)生。此外，外植體表面消毒時(shí)所用的化學(xué)消毒劑及較長(zhǎng)的滅菌時(shí)間也會(huì)加重褐變現(xiàn)象。

6.培育條件溫度過(guò)高或光照過(guò)強(qiáng)，均可加速被培育組織的褐變。

7.培育基成分培育基成分中的無(wú)機(jī)鹽、蔗糖濃度、激素水同等對(duì)褐變的程度的影響尤為重要。另外，其pH值也與褐變程度有較大關(guān)系。

三、防止外植體產(chǎn)生褐變的對(duì)策

適當(dāng)外植體的選擇

取材時(shí)應(yīng)留意選擇褐變程度較小的品種和部位作外植體。成年植株比幼苗褐變程度厲害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐變要嚴(yán)峻。冬季的芽不易生

長(zhǎng)，宜選用早春和秋季的材料作為外植體。

對(duì)外植體的處理

通過(guò)對(duì)較易褐變的外植體材料的預(yù)處理能減輕醌類(lèi)物質(zhì)的毒害作用。處理方法如下：外植體經(jīng)流水沖洗后，在2-5℃的低溫下處理12-24小時(shí)，再用升汞或70%酒精消毒，然后接種于只含有蔗糖的瓊脂培育基中培育5-7天，使組織中的酚類(lèi)物質(zhì)部分滲入培育基中。取出外植體用0.1%漂白粉溶液浸泡10分鐘，再接種到合適的培育基中。假設(shè)仍有酚類(lèi)物質(zhì)滲出，3-5天后再轉(zhuǎn)移培育基2-3次，當(dāng)外植體的切口愈合后，酚類(lèi)物質(zhì)減削，這樣可使外植體褐變減輕或完全被抑制。何瓊英等用抗壞血酸預(yù)處理香蕉吸芽外植體，能減輕外植體褐變，從而提高芽叢誘導(dǎo)率。

選擇適當(dāng)?shù)呐嘤?/p>

1〕適當(dāng)?shù)臒o(wú)機(jī)鹽濃度張妙霞等在柿樹(shù)組織培育防止褐變所進(jìn)行的試驗(yàn)中，4種培育基的無(wú)機(jī)鹽以改良MS〔大量元素減半〕和1/2MS的效果最好，MS的效果較差，結(jié)果證明低濃度的無(wú)機(jī)鹽可促進(jìn)外植體的生長(zhǎng)與分化，減輕外植體褐變的程度。徐振彪在對(duì)玉米幼胚耐NaCl愈傷組織的篩選說(shuō)明，隨NaCl濃度上升，褐變現(xiàn)象加重。

2〕適當(dāng)和適量的激素王異星在荔枝的組織培育過(guò)程中，培育基中添加1mg/LBA+0.5mg/L2,4-D時(shí)，愈傷組織較堅(jiān)硬，增殖緩慢，易產(chǎn)生褐變。培育基中添加1mg/LBA+1mg/L2,4-D時(shí)，愈傷組織淺黃疏松，增殖也快。

3〕培育基的硬度在肯定范圍內(nèi)，瓊脂用量大，培育基硬度大，褐變率低，這可能是培育基的硬度影響了酚類(lèi)物質(zhì)的擴(kuò)散速度的緣故。

4〕培育基中水的硬度的影響硬度低的蒸餾水褐變率低，而運(yùn)用硬度較高的自來(lái)水，褐變嚴(yán)峻，甚至?xí)楷F(xiàn)褐變死亡。這可能是配制培育基的水轉(zhuǎn)變了培育基中無(wú)機(jī)鹽的濃度，間接地影響了植物外植體的褐變。

5〕培育基的pH值在水稻體細(xì)胞培育中，pH值為4.5-5.0時(shí)MS液體培育基可保持愈傷組織處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，其表面呈黃白色，而pH值為5.5-6.0時(shí)，愈傷組織嚴(yán)峻褐變。一般來(lái)說(shuō)，酸性環(huán)境〔pH值為4.5-5.0〕不利于褐變過(guò)程的發(fā)生。

4.培育條件如溫度過(guò)高或光照過(guò)強(qiáng)，光照會(huì)提高PPO的活性，促進(jìn)多酚類(lèi)

物質(zhì)的氧化，從而加速被培育的組織褐變。高濃度CO2也會(huì)促進(jìn)褐變，其緣由是環(huán)境中的CO2向細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散，細(xì)胞內(nèi)CO32-增多，CO32-與細(xì)胞膜上的Ca2+結(jié)合，導(dǎo)致內(nèi)膜系統(tǒng)瓦解，酚類(lèi)物質(zhì)與PPO相互接觸，產(chǎn)生褐變。因此，初期培育要在黑暗或弱光下進(jìn)行。

5.添加褐變抑制劑和吸附劑

褐變抑制劑主要包括抗氧化劑和PPO抑制劑。在培育基中加入偏二亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇等抗氧化劑都可以與氧化產(chǎn)物醌發(fā)生作用，使其重新還原為酚。由于其作用過(guò)程均為消耗性的，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)留意添加量，其中L-半胱氨酸和抗壞血酸均對(duì)外植體無(wú)毒副作用，在生產(chǎn)應(yīng)用中可不受限制。在水稻細(xì)胞的培育基中，添加植酸〔PA〕，可防止褐變，PA分子中眾多的羥基產(chǎn)生抗氧化作用，使生色物質(zhì)的含量下降或PA與PPO分子中的Cu2+結(jié)合，從而降低了其活力。陳學(xué)森等在對(duì)植酸在銀杏組織培育中應(yīng)用的討論中也證明了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。

常用的吸附劑有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮〔PVP〕?；钚蕴渴且环N吸附性較強(qiáng)的無(wú)機(jī)吸附劑，能吸附培育基中的有害物質(zhì)，包括瓊脂中的雜質(zhì)、培育物在培育過(guò)程中分泌的酚、醌類(lèi)物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時(shí)產(chǎn)生的5-羥甲基糠醛等,從而有利于培育物的生長(zhǎng)。粉末狀的活性炭與顆粒狀的活性炭相比吸附性更強(qiáng)，一般在培育基中加入1-4g/L的活性炭。在運(yùn)用過(guò)程中應(yīng)留意，盡量用最低濃度的活性炭來(lái)對(duì)抗褐變的產(chǎn)生，由于活性炭的吸附作用是沒(méi)有選擇性的，在吸附物質(zhì)的同時(shí)，也會(huì)吸附培育基中的其他成分，對(duì)外植體的誘導(dǎo)分化會(huì)產(chǎn)生肯定的負(fù)面影響。而聚乙烯吡咯烷酮〔PVP〕是酚類(lèi)物質(zhì)的專一性吸附劑，在生化制備中常用作酚類(lèi)物質(zhì)和細(xì)胞器的愛(ài)護(hù)劑，可用于防止褐變。

6.進(jìn)行細(xì)胞篩選和多次轉(zhuǎn)移

在組織培育過(guò)程中，常常進(jìn)行細(xì)胞篩選，可以剔除易褐變的細(xì)胞。在外植體接種1-2天后應(yīng)馬上轉(zhuǎn)移到新鮮培育基中，能減輕酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)培育物的毒害作用，降低抑制作用，使外植體盡快分生，連續(xù)轉(zhuǎn)移5-6次，可基本解決外植體的褐變問(wèn)題。

外植體褐變及其解決措施植物組織培育過(guò)程中，褐變問(wèn)題普遍存在，與菌類(lèi)污染和玻璃化現(xiàn)象并稱為植物組織培育的三大難題。針對(duì)褐變難題，本文結(jié)合相關(guān)資料，對(duì)影響褐變的因素作了全面分析，并針對(duì)這些因素提出了相應(yīng)的解決措施。

褐變是指外植體在培育過(guò)程中，自身組織向表面培育基釋放褐色物質(zhì)，以致培育基漸漸變成褐色，外植體也隨之進(jìn)一步變褐而死亡的現(xiàn)象。

一、褐變產(chǎn)生的機(jī)理

1.非酶促褐變

非酶促褐變是由于細(xì)胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細(xì)胞程序化死亡或自然發(fā)生的細(xì)胞死亡，即壞死形成的褐變現(xiàn)象，并不涉及酚類(lèi)物質(zhì)的產(chǎn)生。徐振彪等將生長(zhǎng)正常的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含NaCl的培育基中，組織四周尤其是接觸培育基部分發(fā)生褐變，但培育基中沒(méi)有看到擴(kuò)散的褐化物質(zhì)。當(dāng)溫度上升時(shí)繼代保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也會(huì)發(fā)生此類(lèi)現(xiàn)象。但這種褐變假設(shè)采用適當(dāng)措施或者愈傷組織適應(yīng)了脅迫環(huán)境就不再發(fā)生了。

2.酶促褐變

目前認(rèn)為植物組織培育中的褐變主要是由酶促褐變引起的，培育材料變褐主要是由傷口處分泌的酚類(lèi)化合物引起的。酶促褐變猶如一般的酶促反應(yīng)，其發(fā)生需要具備三個(gè)條件，即酶、底物和氧。引起褐變的酶有多酚氧化酶(PPO)、過(guò)氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。從初次培育和繼代培育過(guò)程中試管苗的褐變程度和PPO的活性來(lái)看，說(shuō)明PPO活性的高低是引起培育材料褐變的關(guān)鍵。引起褐變的酶的底物主要是酚類(lèi)化合物，按其組成可分成3類(lèi):苯基羧酸〔包括鄰羥基苯酚、兒茶酚、沒(méi)食子酸、莽草酸等〕，苯丙烷衍生物〔包括綠原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、單寧、木質(zhì)素等〕，第三類(lèi)是黃烷衍生物〔包括花青素、