分子生物學實驗

關(guān)于分子生物學實驗基因多態(tài)性

多態(tài)性是指在一個生物群體中，同時和經(jīng)常存在兩種或多種不連續(xù)的變異型或基因型(genotype)或等位基因(allele)，亦稱遺傳多態(tài)性(geneticpolymorphism)或基因多態(tài)性。

DNA片段長度多態(tài)性基因多態(tài)性DNA重復序列多態(tài)性單核苷酸多態(tài)性

第2頁,共18頁，2024年2月25日，星期天

DNA片段長度多態(tài)性(FLP)：

即由于單個堿基的缺失、重復和插入所引起限制性內(nèi)切酶位點的變化，而導致DNA片段長度的變化，又稱限制性片段長度多態(tài)性。

DNA重復序列的多態(tài)性(RSP)：

主要表現(xiàn)于重復序列拷貝數(shù)的變異，如小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA。單核苷酸多態(tài)性(SNP)：

即散在的單個堿基的不同，基因組中單核苷酸的缺失,插入與重復序列不屬於SNP，但更多的是單個堿基的置換。

第3頁,共18頁，2024年2月25日，星期天CLEC是Ctypelectin（C型凝集素）家族基因

CLEC4M基因是19號染色體上C型凝集素家族中的一員，它被證明是多種傳染性疾病病毒的受體，如HIV-1,SARS-Cov,HCV等。該基因的第4外顯子的VNTR(VariableNumberofTandemRepeats，VNTR)在全球人類群體中存在3-9次重復的多態(tài)現(xiàn)象，并被認為這種不同長度的多態(tài)可能和宿主對病毒的易感性有關(guān)。

第4頁,共18頁，2024年2月25日，星期天第5頁,共18頁，2024年2月25日，星期天CLEC4M與SARS體內(nèi)存在一種SARS冠狀病毒的受體L-SIGN，由CLEC4M基因所編碼。該基因第4外顯子存在3-9個69bp的重復片段，人群中超過50%的人以7個重復為主，常見的基因型為7/7，5/5，7/5等不同的純合或雜合狀態(tài)，這個重復區(qū)編碼位于胞外受體的頸部。研究表明，純合型如7/7或5/5的個體較雜合型7/5的個體較少感染SARS病毒。第6頁,共18頁，2024年2月25日，星期天CLEC4M基因序列第7頁,共18頁，2024年2月25日，星期天實驗原理原理：用裂解液和蛋白酶K裂解口腔黏膜細胞，釋放DNA，用濃鹽法沉淀蛋白質(zhì)，離心去除蛋白質(zhì)，再用異丙醇沉淀DNA。裂解液配方：10mMTris-HCl，10mMKCl,10mMMgCl2,2mMEDTA,0.4MNaCl,1%SDS.第8頁,共18頁，2024年2月25日，星期天第9頁,共18頁，2024年2月25日，星期天2×PCRmixddH2O引物1，引物22×PCRmix10μl引物1，引物2各0.4μlddH2O6.2μlDNA樣品3μlPCR反應體系，總共20μl第10頁,共18頁，2024年2月25日，星期天在PCR管蓋上標記號碼，便于辨認第11頁,共18頁，2024年2月25日，星期天放入PCR儀，并設(shè)置程序變性95℃5min

95℃20s30循環(huán)59℃30s72℃45s延伸72℃5min第12頁,共18頁，2024年2月25日，星期天PCR過程大概100分鐘第13頁,共18頁，2024年2月25日，星期天PCR儀器界面和參數(shù)第14頁,共18頁，2024年2月25日，星期天紫外透射分析第15頁,共18頁，2024年2月25日，星期天點樣將PCR擴增產(chǎn)物加入瓊脂糖凝膠孔內(nèi)，點樣量10μl第16頁,共18頁，2024年2月25日，星期天100bpDNAmarker，最亮的為500bp500bp雜合子，根據(jù)位置判斷為589和727bp。雜帶，分子量小，或是引物二聚體結(jié)果分析