TLR4 在腦出血繼發(fā)性損傷中腦水腫形成的

TLR4在腦出血繼發(fā)性損傷中腦水腫形成的炎性機制研究

實驗背景及意義腦出血后繼發(fā)性損傷腦水腫形成是多種機制的綜合結果，其中炎性損傷機制備受矚目[3,4]，各種炎性細胞的激活，細胞因子、炎性遞質的釋放，共同造成或加重繼發(fā)性腦損傷[5]。研究表明炎性反應與腦水腫有著密切聯(lián)系：炎性反應是腦水腫形成的重要原因[6,7]。目前在炎癥免疫反應的研究領域里，Toll樣受體家族（Toll-likeReceptors,TLRs）是眾多學者的關注熱點，其屬于跨膜信號轉導受體家族，通過感知病原微生物存在，轉導細胞的炎性信號，參與多細胞生命體古老的防御機制，是連接先天免疫和特異性免疫的紐帶。TLR4參與腦缺血再灌注損傷已被實驗所證[16,17,18]，TLR4激活炎性反應是缺血性卒中后腦水腫形成的重要環(huán)節(jié)。Cao等[16]采用大鼠大腦中動脈線栓模型,研究發(fā)現(xiàn)腦缺血6h再灌注24h后,無論是腦水腫程度、腦梗死體積,還是神經元損傷程度,TLR4缺陷的小鼠都明顯低于野生型,并且TNF-α和IL-6水平降低,認為腦缺血再灌注后TLR4缺陷的小鼠可能通過抑制炎性細胞的激活,下調炎性細胞因子的產生來減少炎癥反應,從而減輕損傷程度。其實腦出血后血腫周圍也存在缺血現(xiàn)象[19]，出血性卒中與缺血性卒中的損傷機制在某種程度上有著共性。但TLR4是否參與腦出血后繼發(fā)性損傷,是否通過介導炎性機制在腦水腫形成的病理生理演變過程中發(fā)揮作用,至今尚不清楚。水通道蛋白4(Aquaporin4,AQP4)是焦點，作為一種與水通透有關的細胞膜轉運蛋白，影響水跨膜轉運和調節(jié)細胞內外環(huán)境平衡。在正常腦組織中主要分布于鄰近毛細血管壁的星形膠質細胞足突上和腦室周圍的室管膜細胞，成為水在細胞、血管和腦室移動的關鍵部位[20]。星形膠質細胞瘤中AQP4表達明顯上調,并與腦水腫程度、血腦屏障的開放有顯著的相關性[21]。多種腦水腫實驗模型均顯示AQP4在腦水腫的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[22，23]。實驗表明：炎性反應可上調AQP4的表達。在過敏原和IL-13誘導的哮喘小鼠模型中[24],炎性反應顯著，基底膜側的AQP4表達上調是特征性的改變。AQP4在實驗性自身免疫腦脊髓炎模型的腦皮質和脊髓中表達也上調[25],提示AQP4可能與急性期炎癥的發(fā)展相關。張新宇等[26]通過在大鼠腦內微量注射炎性因子TNF-α后，發(fā)現(xiàn)早期就可出現(xiàn)腦水腫，并測得AQP4明顯上調、血腦屏障通透性顯著增加，且二者成顯著正相關。因此，炎性因子誘發(fā)腦水腫的機制可能是：通過多種途徑破壞血腦屏障，繼而誘導AQP4表達上調，進一步加重腦水腫，形成惡性循環(huán)。進而推測：TLR4作為炎性信號通路轉導受體，激活下游強有力的炎性級聯(lián)反應，介導炎性損傷,極有可能也通過誘導AQP4表達上調,參與腦水腫形成。但目前，國內外缺乏此方面的研究。實驗研究內容本課題采用大鼠尾狀核立體定向注射自體血模型，研究TLR4是否通過介導炎性反應，上調AQP4表達參與腦出血后腦水腫形成，探索TLR4在腦出血繼發(fā)性損傷中腦水腫形成的炎性機制。具體內容：1、從基因分子水平，研究時間演變過程中TLR4mRNA、TNF-αmRNA表達與AQP4mRNA表達、腦出血后腦水腫程度的相關性。2、并與蛋白、細胞水平結合，研究腦出血損傷后TLR4、TNF-α與AQP4在時空上的變化及聯(lián)系。實驗方法3腦含水量的測定：取每只大鼠右側大腦半球穿刺點前半部的腦組織分別稱重(濕重)，然后置入100℃恒溫烤箱中，24h后取出再稱重(干重)。以(濕重－干重)／濕重×100％計算腦含水量，以此代表腦水腫的程度。4免疫組化法檢測冠狀腦切片TLR4、TNF-α、AQP4蛋白水平及對腦組織行RT-PCR分析TLR4、TNF-α、AQP4。實驗可行性分析實驗可行性分析實驗預期結果1腦出血后TLR4作為炎性信號通路轉導受體，激活下游強有力的炎性級聯(lián)反應，通過誘導AQP4表達上調,參與腦水