臨床檢驗(yàn)免疫學(xué)

臨床檢驗(yàn)免疫學(xué)

一.緒論

免疫學(xué)教學(xué)內(nèi)容

1.基礎(chǔ)免疫學(xué)（Basicimmunology）

相關(guān)內(nèi)容：抗原、抗體、補(bǔ)體、細(xì)胞因子、HLA、免疫系統(tǒng)、免疫應(yīng)答。以免疫應(yīng)答為中心。

2.臨床免疫學(xué)（Clinicalimmunology）

1）抗感染免疫（Infectionimmunology）

2）超敏反應(yīng)（Hypersensitivity）

3）自身免疫（Autoimmunity）

4）腫瘤免疫（Tumo門mmunology）

5）移植免疫（Transplantationimmunology）

3.免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)（immunologicaltechniques）即：免疫學(xué)檢驗(yàn)，根據(jù)免疫學(xué)基本理論建立起來的試驗(yàn)方法

二.抗原抗體反應(yīng)

抗原抗體反應(yīng)是抗原和相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)，這種結(jié)合具有高度特異性，它既可以發(fā)生

在體內(nèi)，也可以發(fā)生在體外。

發(fā)生在體內(nèi)的抗原抗體反應(yīng)，是機(jī)體體液免疫效應(yīng)的表現(xiàn)方式，具有溶菌、殺菌、中和毒素及調(diào)理吞噬的

作用。

發(fā)生在體外的抗原抗體反應(yīng)，根據(jù)抗原的物理性狀（可溶性Ag或顆粒性Ag）及參加反應(yīng)的物質(zhì)不同，可分

為：沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)、中和試驗(yàn)及補(bǔ)體參與的反應(yīng)等

由于抗體都來自于血清，因此，我們將體外的抗原抗體反應(yīng)又稱為血清學(xué)反應(yīng)。

本章講的抗原抗體反應(yīng)就是指發(fā)生在體外的抗原抗體反應(yīng)

抗原抗體反應(yīng)原理

l.Ag>Ab能特異性結(jié)合（內(nèi)因）：

Ag、Ab能特異性結(jié)合，是由于Ag表位（抗原決定簇）和AbV區(qū)之間的特異性結(jié)合，二者在空間結(jié)構(gòu)上是

嚴(yán)格互補(bǔ)的。

2.Ag、Ab結(jié)合的動力（外因）：

靜電引力（又稱庫侖引力）：它是指抗原和抗體分子上帶有相反電荷-NH3+或-CO。一之間的相互吸引力。

例如Ab分子上賴氨酸離解層中含有-NH3+,Ag分子上天門冬氨酸離后含有-C。。，這兩者之間就可相互吸

引而產(chǎn)生靜電引力。

該力的大小與兩個電荷間距離的平方成反比。距離越近，靜電引力就越強(qiáng)。

范得華力（又稱電子云力）：該力是原子與原子、分子與分子間所具有的一種吸引力。當(dāng)Ag、Ab兩分子外

層軌道上的電子相互作用時，電子云由于偶極擺動而產(chǎn)生吸引力，從而促使Ag、Ab的結(jié)合。該力大小小

于靜電引力。

氫鍵:該力是由于分子中的H原子和電負(fù)性較大的O、N、S原子間的相互吸引而形成的。Ag（-NH2、-COOH、

-OH、-SH）、Ab（-NH2、-COOH>-OH、-SH）可形成氫鍵橋梁，促使Ag、Ab的結(jié)合。

氫鍵對于維持生物大分子<AgAb）的形態(tài)和結(jié)構(gòu)有重要作用。它的大小大于范得華力。

疏水作用力：A?是蛋白質(zhì)，Ag少數(shù)是多糖，多數(shù)也是蛋白質(zhì)，那么它們就是膠體物質(zhì)，在水溶液中就帶

有-NH3+或-COCF極性基團(tuán)，從而帶上正電或負(fù)電，成為親水膠體。當(dāng)Ag表位和AbFab段相互靠近時，親

水層消失，排斥掉兩者間的H20分子，促進(jìn)Ag、Ab的結(jié)合。疏水作用力在整個Ag、Ab反應(yīng)中提供的作

用最大。

在高濃度電解質(zhì)（如NaCI等）存在的條件下，NaCI可先與Ab分子結(jié)合（在Ab未與Ag相遇時），排斥H2。

分子，從而使Ab蛋白質(zhì)優(yōu)先沉降，稱為鹽析現(xiàn)象

由于抗原抗體反應(yīng)不含有共價鍵，因此抗原抗體反應(yīng)不為化學(xué)反應(yīng)，不產(chǎn)生新的物質(zhì)。

Ag+Ab-*AgAb

抗原抗體反應(yīng)特點(diǎn)

1.特異性：

Ag、Ab的結(jié)合實(shí)質(zhì)上是抗原表位和抗體可變區(qū)之間的結(jié)合。Ab可變區(qū)可形成一個平穴槽，Ag則楔狀

嵌入，由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)上的互補(bǔ)，使得它們的結(jié)合具有特異性。這種結(jié)合如同鑰匙與鎖的

關(guān)系，一把鑰匙只能開相應(yīng)的一把鎖.

交叉反應(yīng)（cross-reaction）一抗體對,具有相同或相似抗原表位的不同抗原的反應(yīng)稱為交叉反應(yīng)。

交叉反應(yīng)并沒有違背Ag、Ab特異性結(jié)合的原則，其產(chǎn)生的先決條件是不同抗原之間存在共同Ag表位。

交叉反應(yīng)的意義：

1.幫助免疫學(xué)診斷：eg外斐氏反應(yīng)等:用變形桿菌0X19、0X2、OXk作抗原查血清抗體，診斷斑疹傷寒（立

克次氏體感染所致）

2.可造成免疫病理損害：eg鏈球菌感染后易導(dǎo)致腎小球腎炎，其原因?yàn)殒溓蚓c人體腎小球基底膜有共同

Ag表位所致。

2.比例性:

Ag、Ab的結(jié)合并不是在任何比例下都進(jìn)行得充分、完全的。要形成我們?nèi)庋劭梢姷姆磻?yīng)（如沉淀、凝集

現(xiàn)象等），就涉及到最適比例問題。

以沉淀反應(yīng)為例：在一排試管中加入等量的Ab,然后依次向各管加入遞增量的可溶性Ag,根據(jù)形成的沉

淀物及抗原抗體比例可見：（圖）

①：Ab過剩區(qū)，又稱前帶，此時，上清液中Ab過剩，大多出現(xiàn)的是可溶性抗原抗體復(fù)合物。

②：Ag過剩區(qū)，又稱后帶，此時，上清液中Ag過剩，大多出現(xiàn)的也是可溶性抗原抗體復(fù)合物。

③：是Ag、Ab合適比例范圍，又稱等價帶。在這一帶中，Ag、Ab反應(yīng)充分，形成的沉淀物快而多；其中

有一管Ag、Ab反應(yīng)速度最快、形成的沉淀物最多，上清液中幾乎沒有游離的Ag或Ab存在。這時候，抗

原抗體之間的比例稱為最適比（頂點(diǎn)處）。

利用沉淀反應(yīng)對不同來源的抗血清比較后，發(fā)現(xiàn)抗體根據(jù)等價帶范圍不同可分為兩種類型：

①R型抗體：它以家兔免疫血清為代表，具有較寬的抗原抗體合適比例范圍，只有在Ag過剩時;才出現(xiàn)可

溶性抗原抗體復(fù)合物。大多數(shù)小動物的免疫血清屬于該類型。

②H型抗體：它以馬免疫血清為代表，抗原抗體合適比例范圍較窄，在Ag、Ab過剩時，都可出現(xiàn)可溶性

抗原抗體復(fù)合物。人和多數(shù)大動物的免疫血清屬于該類型。

3.可逆性：

Ag、Ab結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，這一過程是一個動態(tài)平衡，在一定的條件下，反應(yīng)是可逆的：Ag+Ab-

AgAb,其主要原因?yàn)锳g、Ab結(jié)合是非共價鍵結(jié)合，不為化學(xué)反應(yīng)。

抗原抗體反應(yīng)的影響因素

自身因素：

1.Ag：與Ag的理化性質(zhì)、抗原表位的數(shù)目及種類有關(guān)；

2.Ab：與Ab的來源有關(guān)：是R型抗體或H型抗體；與Ab的特異性、親合性有關(guān)；與Ab的濃度有關(guān)。

外界環(huán)境條件：

1.電解質(zhì)：一般實(shí)驗(yàn)室所用電解質(zhì)都是生理鹽水（0.9%NaCI）,濃度不能過高。濃度過高，會使Ab蛋白

質(zhì)優(yōu)先沉淀而出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象。

2.PH：一般為PH6-8,當(dāng)PH<3時，可出現(xiàn)顆粒性的非特異性凝集，稱酸凝集；當(dāng)PH過高，可造成堿變性。

3.溫度：抗原抗體反應(yīng)的常用溫度為37。Co

抗原抗體反應(yīng)的類型

分5大類型：

沉淀反應(yīng)；凝集反應(yīng)；補(bǔ)體參與的溶血反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)；中和試驗(yàn)；免疫標(biāo)記技術(shù)。

思考題：

1.抗原抗體反應(yīng)的原理

2.抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)

3.影響抗原抗體反應(yīng)的主要因素

4.抗原抗體反應(yīng)分哪些種類？

5.什么是交叉反應(yīng)，有無特異性，為什么？在臨床工作中有何意義？

三.沉淀反應(yīng)（precipitationreaction）

概念：可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在電解質(zhì)存在，兩者比例恰當(dāng)時，可出現(xiàn)肉眼可見的沉淀現(xiàn)象。

Ag沉淀原Ab沉淀素（precipitin）

實(shí)驗(yàn)中為使抗原抗體比例（數(shù)量）恰當(dāng)，應(yīng)稀釋Ag

顆粒性抗原：光鏡下可見，肉眼觀呈渾濁懸液，如細(xì)菌、RBC等。-凝集反應(yīng)

可溶性抗原：光鏡無形態(tài)，肉眼觀呈澄清透明，如血清蛋白溶液、多糖抗原等。一沉淀反應(yīng)

分類：

液相沉淀：絮狀沉淀試驗(yàn)、環(huán)狀沉淀試驗(yàn)、免疫比濁測定法

凝膠擴(kuò)散：雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)等

凝膠免疫電泳：免疫電泳、對流免疫電泳、火箭免疫電泳等

一.液相沉淀反應(yīng)

（-）絮狀沉淀試驗(yàn)（flocculation）：抗原抗體結(jié)合，在電解質(zhì)存在的情況下出現(xiàn)絮狀/塊狀沉淀。既可在試

管內(nèi)進(jìn)行，也可在玻片上進(jìn)行。

用于：玻片法常用于定性測定試管法:半定量測定

在沉淀反應(yīng)前，應(yīng)測試抗原、抗體最佳稀釋度，一般采用方陣滴定法。

（二）環(huán)狀沉淀反應(yīng)

方法：在環(huán)沉管（0.2X3cm）中進(jìn)行。先加抗體，后加抗原。靜置30分鐘后觀察在Ag、Ab交界處是否有

白色沉淀環(huán)，若有，為陽性）。

用途：多用于測抗原（法醫(yī)學(xué)上血跡鑒定等）

（三）免疫濁度法（immunoturbidimetry）

原理：免疫比濁實(shí)驗(yàn)是在一定量的Ab中加入遞增量的Ag,反應(yīng)一段時間后，形成可溶性AgAb復(fù)合物,

此復(fù)合物在PEG作用下，自液相析出，形成微粒，使檢測濁度發(fā)生改變，用濁度計檢測相應(yīng)濁度，濁度高

低與復(fù)合物含量成正比。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)濁度推算樣品中Ag含量。

1.免疫透射濁度測定法

原理：緩沖液中，先加入已知過量Ab,然后加入待測Ag,AgAb復(fù)合物的量隨Ag量的增加而增加，反應(yīng)

液的濁度亦隨之增加，與一系列標(biāo)準(zhǔn)品對照，即可算出未知Ag含量。

優(yōu)點(diǎn)：

該法操作方便、檢測快速。臨床上多用于檢測IgG、IgA、IgM、C3、C反應(yīng)蛋白（CRP）等。

缺點(diǎn)：

反應(yīng)時間長，加促聚劑PEG。所需Ag/Ab量大。

2.免疫膠乳濁度測定法

原理：將已知Ab吸附在大小適中、均勻一致的膠乳顆粒上，當(dāng)遇到相應(yīng)Ag時，使膠乳顆粒發(fā)生凝集，減

少透光度。透光度減少程度與膠乳凝聚成正比，當(dāng)然也與Ag量成正比。

本法不易選擇適用的乳膠，同時Ab與膠乳結(jié)合也困難。

二.凝膠擴(kuò)散（agarimmunodiffusion）

在凝膠中進(jìn)行的沉淀反應(yīng)

凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)：可溶性抗原與相應(yīng)抗體在電解質(zhì)存在下，在瓊脂基質(zhì)中擴(kuò)散，當(dāng)兩者相遇，比例恰當(dāng)時結(jié)

合，可出現(xiàn)肉眼可見的沉淀線。

（一）雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（簡稱雙擴(kuò)doubleimmunodiffusion）

方法：制瓊脂板（3ml1.5%NS瓊脂）

打孔（雙孔型/三角孔型/梅花孔型）

加樣（平孔沿加滿）

擴(kuò)散（37C、24h觀察結(jié)果）

優(yōu)點(diǎn)：簡單、易行，用途廣

用途：

1.已知Ag或Ab測未知Ab或Ag：雙孔型

2.抗原性質(zhì)分析：三角孔型

3.測Ag有效稀釋度：梅花孔型

缺點(diǎn)：敏感性低、出結(jié)果慢、只定性，不能定量

（二）單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（簡稱單擴(kuò)singleimmunodiffusion）

方法：已知Ab+瓊脂制板、打孔-一在瓊脂板小孔中加梯度Ag--Ag向四周擴(kuò)散形成沉淀環(huán)--Ag濃度與

沉淀環(huán)直徑呈線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線一一從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出并計算出待測標(biāo)本含量

用途：定量測定，如測IgG、IgA、IgM、C3等含量

三.凝膠免疫電泳（agargelimmunoelectrophoresis）

在電場作用下的凝膠擴(kuò)散

電泳技術(shù)：帶電膠體顆粒在電場中向相反電極泳動，利用電泳現(xiàn)象研究某些化學(xué)組分的分離技術(shù)。

免疫電泳技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：

1.加快反應(yīng)速度

2.規(guī)定了抗原、抗體擴(kuò)散方向，提高反應(yīng)敏感性

3.可將某些帶電性不同的組分分開，再進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)

影響電泳的因素：

1.與溶液的pH有關(guān)：常用pH8~9,蛋白質(zhì)帶負(fù)電

2.與溶液離子強(qiáng)度有關(guān)：愈高，泳動慢，一般0.02~0.2M

3.與電場強(qiáng)度有關(guān)：愈高，愈快，一般4~6v/cm（瓊脂長），約40V左右

4.電滲作用的影響

電滲作用：電場中液體對于一固體的固定相對移動的現(xiàn)象。電滲方向與電泳方向相反。

（一）對流免疫電泳（counter-immunoelectrophoresis）

原理：定向加速的免疫雙擴(kuò)（雙擴(kuò)+電場，使抗原、抗體相對泳動）

方法：抗原、抗體分別在瓊脂板上不同孔內(nèi)，抗原在負(fù)極端，抗體在正極端，電泳。

電壓：4~6v/cm（瓊脂長度）

電泳時間：45分鐘~1小時

優(yōu)點(diǎn)、用途：耗時短，反應(yīng)敏感性強(qiáng)。用于HBsAg、AFP等檢測

（二）火箭免疫電泳（rocketimmunoelectrophoresis）

原理：單擴(kuò)+電場，為定量試驗(yàn)

方法：已知Ab+瓊脂混合，制板---在玻板一端打孔、加梯度Ag……電泳……根據(jù)所知樣品悌度含量……

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線一一查出待測樣品含量

優(yōu)點(diǎn)與用途：與單擴(kuò)相同，已知Ab定量測Ag,但出結(jié)果快。

（三）免疫電泳（immunoelectrophoresis）

多用于分析復(fù)雜抗原組分

原理：Ag區(qū)帶電泳+雙擴(kuò)結(jié)合

方法：

l.Ag電泳分出區(qū)帶

2.Ag、Ab免疫雙擴(kuò)

用途：常用于分析復(fù)雜Ag的組分。（如人全血清組分的分析）

優(yōu)點(diǎn)：用樣品量小、特異性高、分辨力強(qiáng)

缺點(diǎn)：由于復(fù)雜抗原中各成分含量差異大，不能全部顯出，敏感性不高。

用途：分析復(fù)雜抗原組分；多發(fā)性骨髓瘤等疾病的測定

思考題：

1.雙擴(kuò)、單擴(kuò)、對流免疫電泳、免疫電泳實(shí)驗(yàn)的原理，方法，用途。

2.影響電泳的因素有哪些？

四.凝集反應(yīng)（Agglutination）

概念：細(xì)菌、細(xì)胞等顆粒性抗原懸液加入相應(yīng)抗體，在電解質(zhì)存在下，兩者特異性結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見的

凝聚塊。

凝集反應(yīng)應(yīng)稀釋抗體。

Ag凝集原agglutinogen

Ab凝集素agglutinin

分類：

直接凝集反應(yīng)directagglutination

I間接凝集反應(yīng)indirectagglutinationorpassiveagglutination

一.直接凝集反應(yīng)（directagglutination）:

細(xì)菌、螺旋體、細(xì)胞等顆粒性抗原（抗原是細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)）在適當(dāng)電解質(zhì)參與下，直接與相應(yīng)抗體結(jié)合,

出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。

育榜滯集反應(yīng)分類?

（-）玻片法：用已知抗體檢測未知抗原

玻片凝集試驗(yàn)（定性試驗(yàn)）：

于玻片上先加已知抗體，再加入待測物（未知抗原），混勻。如發(fā)生凝聚，說明待測物中有與抗體相對應(yīng)

的抗原。

用途：ABO血型鑒定、菌種鑒定

（-）試管法：用已知抗原測未知抗體的效價，屬半定量試驗(yàn)。

試管凝集試驗(yàn)：

方法：1~9號試管分別加不同稀釋度待檢血清（容量相同，Ab）,10號加NS（對照），各管再加定量（濃

度、容量一樣）的Ag。

結(jié)果：以出現(xiàn)明顯凝集的血清最高稀釋度（即可以判為++者）作為該血清（Ab）的凝集效價。

舉例：

1.肥達(dá)氏反應(yīng)（Widaltest）

2.外斐氏試驗(yàn)（Weil-Felixtest）

二.間接凝集反應(yīng)（indirectagglutinationorpassiveagglutination）

將可溶性抗原或抗體吸附在某種載體（carrier）微球上，使之成為顆粒性抗原或抗體，然后再與相應(yīng)的抗體或

抗原結(jié)合，出現(xiàn)載體微球的凝集現(xiàn)象。

（-）載體要求與種類

要求：不干預(yù)免疫反應(yīng)、顆粒大小均勻

常用載體種類：紅細(xì)胞（綿羊、家兔、人。型）、活性炭粒、硅酸鋁顆粒、聚苯乙烯膠乳顆粒（人工合成

高分子材料）等。

致敏微粒或致敏顆粒：吸附有抗原或抗體的載體顆粒

間接凝集試驗(yàn)命名：根據(jù)載體不同而命名。

血凝試驗(yàn)（以RBC為載體）

乳膠凝集試驗(yàn)（以膠乳顆粒為載體）

（二）間接凝集試驗(yàn)的分類：

1.（正向）間接（血、膠乳）凝集試驗(yàn)

原理：將已知的可溶性抗原吸附于顆粒性載體匕檢測未知抗體。

2.反向間接（血、膠乳）凝集試驗(yàn)

原理：將已知抗體吸附于顆粒性載體上，檢測未知抗原。

如:反向間接血凝檢測HBsAg、AFP等

3.間接凝集抑制試驗(yàn)

原理：待測樣本（可溶性Ag?）+已知Ab-+已知致敏Ag顆粒（已成為顆粒性Ag）一觀察是否有凝集

現(xiàn)象。

不凝集為陽性，凝集為陰性。

如：用膠乳凝集抑制試驗(yàn)檢測尿液中絨毛膜促性腺激素（HCG）

4.協(xié)同凝集試驗(yàn)（coagglutination）

原理：實(shí)質(zhì)為反向間接凝集反應(yīng)。

葡萄球菌A蛋白（StaphylococcusproteinA,SPA）能非特異地與IgG的Fc段結(jié)合，當(dāng)與特異性抗原相遇時，IgG

的Fab段與抗原結(jié)合，出現(xiàn)金葡菌的凝集現(xiàn)象（屬特殊間接凝集試驗(yàn)）。

協(xié)同凝集試驗(yàn)實(shí)際是用已知抗體檢測未知抗原，可用于多種抗原的檢測

沉淀試驗(yàn)與凝集試驗(yàn)的比較

沉淀試驗(yàn)?zāi)囼?yàn)

抗原性質(zhì)可溶性Ag顆粒性Ag

稀釋對象抗原抗體

結(jié)果現(xiàn)象沉淀現(xiàn)象凝集現(xiàn)象

敏感性低高

思考題：

1.玻片凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)的區(qū)別

2.反向間接凝集試驗(yàn)、間接凝集抑制試驗(yàn)的原理及實(shí)例

3.協(xié)同凝集試驗(yàn)的原理

4.比較沉淀試驗(yàn)和凝集試驗(yàn)的異同

五.免疫標(biāo)記技術(shù)

用可以微量檢測的標(biāo)記物（示蹤物質(zhì)）標(biāo)記抗原或抗體，作為試劑，與相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合反應(yīng)后，測定

抗原抗體復(fù)合物中的標(biāo)記物，從而推斷所測抗體或抗原有無及量的多少。

免疫標(biāo)記技術(shù)=免疫技術(shù)（抗原抗體反應(yīng)：特異性）+標(biāo)記技術(shù)（示蹤物標(biāo)記：靈敏性）

常用標(biāo)記物：熒光素、酶、同位素、膠體金、可發(fā)光化學(xué)物質(zhì)。

試驗(yàn)命名：根據(jù)標(biāo)記物命名。如：免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)等

免疫熒光技術(shù)（Immunologicalfluorescenttechnique,IF）

原理：用熒光素標(biāo)記抗原或抗體，與待測標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合，通過檢測熒光，確定標(biāo)本中有無待

測的抗體或抗原。

免疫熒光技術(shù)分類：免疫熒光顯微技術(shù)（定性）

免疫熒光測定技術(shù)（定量）

一.熒光、熒光素及熒光顯微鏡

（-）熒光

一種光照射某種物質(zhì)時，該物質(zhì)可發(fā)出比照射光波長更長的光稱為熒光。照射光:可見光、紫外光

（二）熒光素

能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，可作為染料。

常用熒光素：

1.異硫氟酸熒光黃（FITC）：可發(fā)出黃綠色熒光

2.四乙基羅丹明（RB2OO）：發(fā)橘紅色熒光

3.藻紅蛋白（PE）：發(fā)出橙色熒光

（三）熒光顯微鏡

L結(jié)構(gòu)：主要組成

A.白熾光源（超高壓汞燈）：發(fā)射紫外光或蘭紫光；

B.兩組濾光板:激發(fā)濾板（選擇合適的激發(fā)光譜）；抑制濾板（抑制紫外光或蘭紫光進(jìn)入視野，只允許熒

光通過。

C.顯微鏡：普通的光學(xué)顯微鏡。

光路程序：

白熾光源——發(fā)射紫外光or蘭紫光——激發(fā)濾板——紫外光——被檢物（熒光染色標(biāo)本）——紫外光+熒

光——抑制濾板一-熒光（顯微鏡下可見）

熒光顯微鏡據(jù)光源路徑分類：

透射式（光源從下面經(jīng)聚光器會聚后到達(dá)樣品，適用于觀察對光可透的標(biāo)本）

落射式（光源從上面到達(dá)樣品，經(jīng)標(biāo)本反射進(jìn)入物鏡。適用于觀察透明度不好的標(biāo)本及各種活性組織等）

2.使用注意事項(xiàng)：

染色后立即檢查（熒光易猝滅）

準(zhǔn)備好后開啟白熾光源，不能隨時啟滅。打開后15分鐘才能關(guān)閉

每次使用2小時

保持室內(nèi)通風(fēng)

3.熒光素可以標(biāo)記（染色）抗原，也可以標(biāo)記抗體，一般免疫熒光顯微技術(shù)均標(biāo)記抗體

二.免疫熒光顯微技術(shù)

（--）熒光抗體的制備：

純化的一定量抗體……加-定量FITC（攪拌使結(jié)合）---去除游離熒光素---測抗體效價、測熒光素

與蛋白質(zhì)（Ab）結(jié)合比（F/P）——小量分裝保存?zhèn)溆?/p>

（-）片子的制作：

1.常做切片、涂片、印片，要求薄、均勻，并與玻片充分固定。固定后不能被洗脫。

2.注意保持抗原完整性

3.不同材料固定方法不同（無水已醇、丙醇、聚甲醛等）

（三）熒光抗體染色法

1.直接法

待測標(biāo)本固定（Ag?）+Ab--洗滌--AgAb

特點(diǎn)：快、直接、干擾因素少。

用于檢測抗原。

每檢測一種抗原需標(biāo)記相應(yīng)的熒光抗體,較麻煩

2.間接法

分兩步：

第一步：熒光素標(biāo)記抗抗體（如熒光標(biāo)記的羊抗人IgG）；

第二步：已知Ag固定+待測標(biāo)本（Ab?）——洗滌，+熒光標(biāo)記的抗抗體——洗滌，熒光顯微鏡鏡檢

間接法用得最多

優(yōu)點(diǎn)：制備一種熒光標(biāo)記二抗（抗抗體）可用于多種Ab檢測。

靈敏度高

3.補(bǔ)體法：

第一步：熒光素標(biāo)記抗補(bǔ)體；

第二步：已知Ag固定+待測標(biāo)本（Ab?）+補(bǔ)體——洗滌，+熒光標(biāo)記的抗補(bǔ)體——洗滌，熒光顯微鏡

鏡檢

特點(diǎn)：靈敏度高，制備一種熒光抗補(bǔ)體用于多種檢測

干擾因素多，補(bǔ)體不穩(wěn)定，易失活，

該法少用

4.雙標(biāo)記法

用兩種熒光素（FITC、羅丹明）分別標(biāo)記針對同一Ag上不同抗原表位的抗體，對同一標(biāo)本染色，當(dāng)Ag

有兩種相應(yīng)抗原表位存在時.，可同時見到黃綠和橙紅兩種熒光。

（四）免疫熒光顯微技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：

1.特異性、敏感性高

2.快速

3.可定位

4.既可測Ag又可測Ab

缺點(diǎn)：

L需要熒光顯微鏡

2.存在非特異熒光干擾（產(chǎn)生原因：自發(fā)、抗體不純、交叉反應(yīng)、技術(shù)問題）

3.定性測定、判斷結(jié)果不客觀

4.制備的片子難以長期保存（熒光猝滅）

三.時間分辨熒光免疫測定（液相檢測）

原理：用箱（Eu）等具有較長熒光壽命的稀土金屬作熒光標(biāo)記物來標(biāo)記Ab或Ag,從而檢測待測標(biāo)本中相應(yīng)

Ag或Ab的新技術(shù)。

其特點(diǎn)是：利用時間分辨熒光儀延緩檢測時間，排除非特異性干擾熒光。

靈敏度可達(dá)0.2~1ng/mL.

思考題：

1.免疫標(biāo)記技術(shù)的原理

2.免疫熒光技術(shù)中最常用的熒光素是什么？

3.免疫熒光顯微染色的各種方法及優(yōu)缺點(diǎn)？

4.免疫熒光顯微技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)？

5.熒光顯微鏡的光源分幾種？

六.免疫酶技術(shù)(Immunoenzymetechnique)

概述：70年代初在免疫熒光技術(shù)基礎(chǔ)上建立。較IF、RIA(radioimmunoassay)更優(yōu)越，具有敏感、安全、穩(wěn)

定、易觀察結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)。

原理：利用酶標(biāo)記Ag或Ab后不改變Ag、Ab反應(yīng)特異性，同時又不影響酶的活性，結(jié)合在AgAb上的酶

催化底物，生成有色產(chǎn)物，根據(jù)產(chǎn)物顏色深淺推測出待測物中相應(yīng)物質(zhì)(Ab、Ag)有無及含量多少。

Ag+AbE---AgAbE+底物一呈色反應(yīng)

免疫酶技術(shù)具有：

特異性一Ag、Ab反應(yīng)

敏感性一能的高效催化作用

兩種方法：

酶免疫組織化學(xué)染色技術(shù)(免疫組化)

酶免疫測定法(酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，

Enzyme-Linkedimmunosorbentassay;ELISA)

常用的酶：

(一)選擇酶的要求

1.自然界存在廣，易獲得

2.易純化、性穩(wěn)、活力高

3.形成的酶結(jié)合物穩(wěn)定，并保留醐、抗體或抗原的活性

4.底物來源方便并易保存

5.反應(yīng)后有色產(chǎn)物能快速測定

6.酶分子量不能太大，太大不易進(jìn)入組織細(xì)胞內(nèi)，影響組化染色定位

(-)常用的酶：

辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等

辣根過氧化物酶(Horseradishperoxidase,HRP)：?種鐵嚇琳蛋白質(zhì)，分子量4.4萬，能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

酶活性強(qiáng)，酶結(jié)合物可長期保存。最適pH為5.5左右。選用時注意酶純度和活性

純度：RZ表示，反映酶含量與蛋白含量之比，最好要RZ值為3.0左右

活性：每lmg酶中所具有的活性單位，應(yīng)大于250u/mg

HRP的底物：鄰苯二胺(OPD),四甲基聯(lián)苯胺(TMB)---反應(yīng)體系中作為供氫體

DH2+H2O2——D+2H2O

供氫體受氫體HRP有色產(chǎn)物

OPD特點(diǎn)：

有色產(chǎn)物為黃色

空白對照接近無色

敏感度高，有致癌作用

TMB特點(diǎn)：

有色產(chǎn)物為藍(lán)色

無致癌作用

底物系統(tǒng)(包括供氫體、受氫體)臨用時配，配后避光保存

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-Linkedimmunosorbentassay,ELISA)

一.原理：將酶分子與Ab或Ag連接成一酶結(jié)合物(酶標(biāo)記物)，當(dāng)它與固相載體中相應(yīng)Ag或Ab相遇，形

成酶標(biāo)記的AgAb復(fù)合物，加入底物，酶催化底物，生成有色產(chǎn)物，根據(jù)顏色深淺可測出溶液中Ag或Ab

的量。

固相載體：聚苯乙烯

實(shí)驗(yàn)中所需酶標(biāo)抗體的制備方法同熒光抗體制備：純化后的抗體+酶-―-透析去除游離酶---測定酶標(biāo)抗體

工作濃度

試驗(yàn)中有關(guān)術(shù)語及試劑：

包被(coat)：將Ag或Ab吸附在固相載體上的過程，又稱固相化或吸附。包被后，不能被洗脫。包被緩沖

液：PH9.6CB

洗滌（wash）：PH7.2-7.4PBS

酶結(jié)合物：酶標(biāo)抗體或酶標(biāo)抗原

終止液：2MH2SO4

OPD：HRP催化后其有色產(chǎn)物為黃色，H2SO4終止后變?yōu)槌壬ㄗ厣?/p>

TMB：HRP催化后其有色產(chǎn)物為藍(lán)色，H2s04終止后變?yōu)辄S色

二.方法類型和操作步驟

（■'）雙抗體夾心法

雙抗體夾心法步驟：包被已知Ab---洗滌一一加待測標(biāo)本（測Ag?）一一洗滌---加前標(biāo)Ab--一洗滌一一

加底物--加終止液---觀察結(jié)果

特點(diǎn)：該法主要用于檢測抗原

包被的抗體與酶標(biāo)抗體屬同一種類抗體

每檢測一種抗原就需制備相應(yīng)的酶標(biāo)抗體，較麻煩

（二）間接法測抗體

步驟：包被已知Ag+待測標(biāo)本（測Ab?）——反應(yīng)一段時間后，洗滌——加酶標(biāo)抗抗體（酶標(biāo)羊抗人IgG）

——洗滌——加底物——加終止液，觀察結(jié)果。

特點(diǎn)：該法主要用于測抗體

酶標(biāo)記一種抗抗體可以用于多種抗體的檢測

間接法測抗原：包被抗體……加標(biāo)本（抗原）---加抗體一加酶標(biāo)抗抗體

（三）雙位點(diǎn)一步法

步驟：包被抗體A+待測標(biāo)本+酶標(biāo)抗體B——洗滌，+底物——終止液，觀察結(jié)果

（檢測Ag,Ag至少含A、B兩個抗原表位）

特點(diǎn)：該法是一次性加入標(biāo)本和酶標(biāo)抗體，試驗(yàn)程序簡單，提高了檢測的特異性

用于檢測Ag,且Ag是具有至少2種抗原表位的多價抗原

反應(yīng)系統(tǒng)中固相Ab與酶標(biāo)Ab的量相對于待測Ag是過量的，因此復(fù)合物的形成量與待測Ag含量成

正比（在方法可檢測范圍內(nèi)）

（四）競爭法

步驟：

待測管：已知Ab包被+待測標(biāo)本（Ag?）——洗滌，+酶標(biāo)Ag——洗滌，+底物——顯色

（五）應(yīng)用親和素和生物素的EUSA

親和素（avidin）：糖蛋白，-分子由四個亞基組成，每一亞基可以與一分子生物素結(jié)合

生物素（biotin）：維生素H,可與蛋白質(zhì)、糖類、酶類等結(jié)合，與親和素特異結(jié)合后極穩(wěn)定

三.ELISA結(jié)果的判定

（-）肉眼判定

與陽性、陰性對照顏色比較：

1.若待檢孔顯色深于或等于陽性對照孔則判定為陽性；

2,若待檢孔顯色介于陰性對照孔和陽性對照孔之間則判定為弱陽性。

3.若待檢孔顯色淺于陰性對照則判定為陰性；

（二）酶標(biāo)光度儀檢測A492值（吸光率）：比色法

1.與陽性、陰性對照測定值比較

2.P/N比值：大于2.0為陽性，小于2.0為陰性

P:positive（待測吸光度值）N:negative

四.ELISA試驗(yàn)的影響因素

（1）固相載體

常用固相載體材料：聚苯乙烯。其特點(diǎn)為吸附Ag或Ab的能力強(qiáng)，一但吸附后，不能被洗脫。

固相載體：酶標(biāo)板可分軟、硬板。一次性使用，不可回收

酶標(biāo)板要求：吸附性能好、空白值低、透明度高

板批間、孔間性能相近

（―）抗原、抗體

Ag：需純化

Ab：需效價高、親和力強(qiáng)、純化

（三）試驗(yàn)條件

1.包被：一般用pH9.6CB（carbonatebuffer）,0.05M,有利于蛋白質(zhì)吸附

包被濃度：0.1~100ug/ml,一般常用10ug/ml

包被時間、溫度：4℃過夜或37℃l-3h

包被量：1003

封閉：用0.1~5%牛血清白蛋白緩沖液浸泡0.5小時

2.抗原抗體反應(yīng)的條件

（1）微堿性有利于抗原抗體結(jié)合，故用pH7.4PBS（phosphatebuffersaline）洗滌

（2）去污劑有利于AgAb形成，洗液中加0.05%Tween-20

（3）Ag、Ab反應(yīng)時間、溫度：一般37℃、30~40min

3.洗滌：采用PH7.2-7.4PBS洗滌，規(guī)一化，每次浸泡l~2min,拍干，共洗滌3~4次

4.酶促反應(yīng)條件：

溫度：37℃時間：lOminpH：5.5底物量：一致

5.排除干擾：多設(shè)對照

ELISA試驗(yàn)應(yīng)設(shè)對照:

應(yīng)設(shè)對照操作應(yīng)得結(jié)果

陽性對照同標(biāo)本一樣顏色深

陰性對照同標(biāo)本一樣顏色淺or無色

酶結(jié)合物對照加酶步加入無色

底物對照加底物步加入無色

空白對照只加終止液無色

（以間接法為例，每孔均已包被Ag）

血清100ul酶標(biāo)二抗100ul底物100ul終止液100ul

待測標(biāo)本待測血清+++

陽性對照陽性血清+++

陰性對照陰性血清+++

的結(jié)合物對照PBSlOOul+++

底物對照PBSlOOulPBSlOOul+

空白對照PBSlOOulPBSlOOulPBSlOOul+

五.ELISA試驗(yàn)優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：1.既可測抗原又可測抗體

2微.量、定性、定量

3.特異性、敏感性高

4.操作簡單，可不用特殊儀器

缺點(diǎn)：1.影響因素多，多方把關(guān)

2.偶有假陽性、假陰性

六.膜載體的酶免疫測定

（一）斑點(diǎn)-ELISA

特點(diǎn)：1.固相載體為硝酸纖維素膜

2.酶促反應(yīng)后在膜上形成有色沉淀物

（二）免疫印跡法（immunoblottingtestJBT）

七.應(yīng)用（包括所有標(biāo)記技術(shù)）

（-）病原體的診斷及研究

1.病毒、細(xì)菌等傳染病的診斷（測抗原或抗體）

2.病毒、細(xì)菌表面抗原的研究

（二）某些疾病的診斷

1.某些微量物質(zhì)有關(guān)疾病的診斷

2.腫瘤的診斷及定位

3.自身抗體檢測協(xié)助自身免疫病診斷

4.寄生蟲疾病的診斷等

（三）免疫學(xué)方面的研究

T、B細(xì)胞的發(fā)生、演化、表面抗原改變等的研究

（四）微量物質(zhì)的檢測

體內(nèi)：微量蛋白質(zhì)、激素、酶等抗原；藥物、糖等半抗原

工農(nóng)業(yè)：微生物、微量物質(zhì)等

思考題：

1.ELISA的原理、方法（以間接法測抗體和雙抗夾心法為例）及影響因素。

2.ELISA試驗(yàn)應(yīng)設(shè)哪些對照，為什么？

3.判斷ELISA試驗(yàn)結(jié)果的方法。

發(fā)光免疫技術(shù)

發(fā)光免疫技術(shù)是將發(fā)光系統(tǒng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合，來檢測抗原、或抗體的方法。

化學(xué)發(fā)光免疫測定

一.化學(xué)發(fā)光酶免疫測定（chemiluminescentenzymemunoassay,CLEIA）

試驗(yàn)前部分與ELISA一樣，改變所加底物，使產(chǎn)物能發(fā)光，用儀器檢測發(fā)光強(qiáng)度，判斷結(jié)果。如酶是用辣

根過氧化物酶，常用底物是魯米諾或其衍生物。

二.化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫測定（chemiluminescentmunoassay,CLIA）

是用化學(xué)發(fā)光劑作為標(biāo)記物直接標(biāo)記抗原或抗體的免疫測定方法。

金免疫技術(shù)

采用膠體金作為標(biāo)記物

膠體金又稱金溶膠，是金鹽（氯金酸）被還原（還原劑：檸檬酸鈉）成原子金后形成的金顆粒懸液

膠體金的特性：

1.膠體金性質(zhì)：顆粒穩(wěn)定均勻，分散懸浮，l~100nm

2.呈色性：顏色與顆粒大小有關(guān)

2~5nm:橙黃色10-20nm：酒紅色30-80nm：紫紅色

?.斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)（dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA）

原理：采用膠體金標(biāo)記抗體，以硝酸纖維素膜為載體，使抗原抗體反應(yīng)和洗滌在同一滲濾膜上，反應(yīng)后根

據(jù)在膜中央形成的紅色斑點(diǎn)（膠體金聚集）有無來判斷結(jié)果。

技術(shù)類型：雙抗體夾心法（測Ag）；間接法（測Ab）

二.斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)（dotimmunochromatographicassay,DICA）

以硝酸纖維素膜為載體，利用微孔膜毛細(xì)管作用，使膜一端的液體慢慢向另一端滲移，猶如層析。

HCG金標(biāo)試紙：帶條中均勻含有膠體金標(biāo)記的鼠抗人HCG單抗

尿中HCG與金標(biāo)記的鼠抗人HCG單抗結(jié)合形成免疫復(fù)合物；隨層析作用向上移動，至檢測線與鼠抗人HCG

抗體結(jié)合而聚集顯色。

在檢測線未結(jié)合的金標(biāo)記鼠抗人HCG單抗（IgG）隨著尿液上行，到達(dá)質(zhì)控線與羊抗鼠IgG（二抗）結(jié)合而顯色，

作為質(zhì)控對照。

思考題：

1.發(fā)光免疫技術(shù)、金免疫技術(shù)的原理

2.用金標(biāo)記免疫法（斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)）檢測HCG的原理

七.免疫血清的制備

一.概述：

1.免疫5清：含有某種抗體的血清。它是免疫化學(xué)和細(xì)胞免疫的主要試劑，其質(zhì)量的好壞由Ab的效價、特

異性決定。

2.來源：山Ag免疫動物而來。Ag可以是純Ag（如白蛋白），也可以是復(fù)雜Ag（如人全血清）

二.免疫血清的制備：

（-）動物的選擇：

1.常用動物：哺乳類較多：馬、羊、豬、猴、兔、豚鼠等；禽類：雞

2.選擇原則：

免疫的Ag與動物的種類要求越遠(yuǎn)越好（即免疫原性好）；

與免疫血清的量有關(guān)：所需量大，用馬、羊、猴等大動物；所需量小，用兔、豚鼠等小動物；

動物的個體狀態(tài)：雄性、適齡、健康、無感染；

其它：根據(jù)實(shí)驗(yàn)的特殊要求。

（-）抗原的條件：

具有良好的抗原決定簇（表位）：易被LC識別而產(chǎn)生Ab；

具有可靠的純度；

具有足夠大的分子量及相對復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)；

注射量：嚴(yán)格掌握，寧可小，一般用25ug/kg動物；量大可出現(xiàn)免疫抑制

（三）佐劑的應(yīng)用：

佐劑（adjuvant）：同Ag一起或預(yù)先注入機(jī)體，能增強(qiáng)機(jī)體對該Ag的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)。

多用于可溶性Ag,顆粒性Ag一般不用佐劑。

使用佐劑的目的：增加Ag的免疫原性，從而提高抗血清的效價

佐劑的種類：

1.福氏不完全佐劑（FIA）：

組成：羊毛脂+石臘油，二者比例為4：1

FIA的制備：將Ag溶液逐滴加入羊毛脂和石臘油中，不斷研磨，使Ag溶液均勻混于佐劑中，形成“油包

水”乳劑，“水包油”不行。

要形成“油包水”乳劑的原因?yàn)椋?/p>

延緩Ag在體內(nèi)的破壞和消失，并緩慢釋放Ag；

刺激單核-巨噬細(xì)胞對抗原的處理和提呈能力；

刺激淋巴細(xì)胞的增殖、分化從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。

2.福氏完全佐劑（FCA）：

組成：羊毛脂+石臘油+卡介苗

免疫效果更好，進(jìn)一步提高、加強(qiáng)了免疫反應(yīng)，并使免疫反應(yīng)發(fā)生質(zhì)的改變。

表現(xiàn)：促進(jìn)、誘發(fā)Ag產(chǎn)生強(qiáng)大、持久的細(xì)胞免疫反應(yīng)；

促使機(jī)體合成新的1g種類

FCA特點(diǎn)：

卡介苗同Ag一起加到羊毛脂和石臘油中，兒滴即可；

免疫效果好；

注射局部易形成肉芽腫，潰爛，但對Ab生成無危害。

3.另外還有明研佐劑、氫氧化鋁佐劑等非免疫原性佐劑

4.細(xì)胞因子佐劑：與Ag合用可以有效地激發(fā)機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)免疫反應(yīng)。如IL-2、IFN-Y、IL-1等

（四）免疫程序及采血：

1.注射途徑：靜脈、皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)、腹腔。采用一種途徑多點(diǎn)注射

可溶性Ag：常選用皮內(nèi)或皮下（皮內(nèi)易引起細(xì)胞免疫反應(yīng)，對產(chǎn)生Ab有利）

顆粒性Ag：常選用靜脈或腹腔

若Ag量少，可直接注射淋巴結(jié)

2.注射間隔及次數(shù)：

單次注射：Ab生成慢、持續(xù)時間短、效價低，但特異性好；

再次注射：注射2次，Ab效價上升快，持續(xù)時間長；

間隔一定時間多次注射：Ab效價高、生成時間長，但特異性差。間隔時間一般為7-10天

?般采用后兩種注射方法

3.注射量：蛋白質(zhì)Ag一般注射l-4mg/次，注射量過大易形成免疫耐受

4.制定免疫程序

5.試血和放血：

試血：末次Ag注射后，測定血清中Ab的效價，叫試血。

若Ab達(dá)到所需效價，即可放血。若未達(dá)到，繼續(xù)追加免疫Ag一次。

試血：可溶性Ag：用雙擴(kuò)（梅花孔型）；顆粒性Ag：用直接凝集試驗(yàn)（試管法）

放血：直接頸動脈放血或直接心臟穿刺抽血。然后分離出血清，即可得到Ab

測抗體效價：雙擴(kuò)梅花孔型

試管凝集試驗(yàn)：

方法：1-9號試管分別加不同稀釋度待檢血清（容量相同，Ab）,10號加NS（對照），各管再加定量（濃

度、容量一樣）的Ag。

Ab效價判定：以出現(xiàn)明顯凝集現(xiàn)象的（記為：++凝集）抗體最高稀釋度作為該抗體的效價。又稱滴度Titer）

6.鑒定

Ab效價的鑒定：

可溶性Ag用雙擴(kuò)法（梅花孔型）；

顆粒性Ag用直接凝集試驗(yàn)（試管法）

Ab特異性的鑒定：雙擴(kuò)法（雙孔型）

方法：在瓊脂上打兩排孔，左邊一側(cè)一孔加粗Ag（Ag粗提物），一孔加純Ag（特異性Ag）,右邊一側(cè)兩孔

分別加免疫血清,放37°C、24ho

結(jié)果：若抗血清與粗Ag及純Ag之間皆出現(xiàn)一條沉淀線，且兩條線融合，則說明動物已產(chǎn)生單價特異性

Ab；若與純Ag出現(xiàn)1條線，與粗Ag出現(xiàn)多條線，則說明血清中有雜Ab。

Ab純度的鑒定：

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，若出現(xiàn)多條電泳帶，即提示免疫血清中有雜蛋白，需進(jìn)一步分離、純化

7.保存：

小包裝低溫保存：將血清分成小包裝-20°C保存，避免反復(fù)凍融，可保存5年，效價不下降：

冰凍干燥保存：用冰凍干燥器使免疫血清形成凍干粉，可保存5-10年；

4℃加防腐劑保存：可保存半年。如石炭酸、疊氮蘭、硫柳汞等防腐劑

1.免疫血清制備的主要程序。

2.佐劑概念、作用機(jī)理、福氏不完全/完全佐劑的組成。

八.免疫球蛋白的分離提純

（separationandpurificationofimmunoglobulin）

目的：有利于標(biāo)記

減少非特異性反應(yīng)

有利于ig定量

—,鹽析法

（-）原理：在不同濃度的中性鹽中蛋白質(zhì)會脫水，降低帶電電勢，由親水性變?yōu)槭杷?，分子間相互凝

聚而沉淀（鹽析作用）。

不同蛋白質(zhì)鹽析所需中性鹽的濃度不同，故可分離不同蛋白質(zhì)。

分離蛋白質(zhì)所用硫酸胺的濃度：

纖維蛋白原20%飽和度

V球蛋白、部分1a球蛋白33%飽和度

白蛋白＞50%飽和度

（二）常用的中性鹽：硫酸胺

硫酸胺鹽析的優(yōu)點(diǎn)：

溶解度大（飽和700~800g/1000ml）

溶解度受溫度影響小

蛋白質(zhì)不易變性

操作簡便

缺點(diǎn)：

需除去NH4+,透析時間長

含氮，干擾蛋白質(zhì)定量

不純的硫酸胺含有金屬，可與蛋白質(zhì)結(jié)合，因此硫酸胺需用分析純試劑

（三）方法：

1.配制飽和硫酸胺溶液

2.加入稀釋血清

3.透析去除NH4+（奈氏試劑檢測）

注意：

pH：硫酸胺pH應(yīng)接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，才易形成沉淀（1g的pl=7.3~8.2,pH應(yīng)7.7左右）

蛋白質(zhì)濃度：2.5~3%為宜，所以血清要稀釋

溫度：室溫即可（除特殊要求者）

二.離子交換層析法

原理：利用不同的蛋白質(zhì)在緩沖溶液中所帶電荷不同，與某一載體上的具有相反電荷的離子基團(tuán)進(jìn)行吸附,

然后進(jìn)行解脫，達(dá)到純化蛋白質(zhì)目的。

常用載體是纖維素（DEAE）

例如在PH6.5的醋酸緩沖液中，侵泡DEAE,使DEAE帶正電，因此它能吸附帶負(fù)電的Alb、a、B球蛋白

（其PI均<6,PH6.5>PI,帶負(fù)電），僅Y球蛋白PI為7.3,帶正電（PH6.5<PI,帶正電）不能被DEAE吸附

而直接流出，此時收集的第一峰即為提純的Y球蛋白。然后通過改變緩沖液PH和離子強(qiáng)度，使Alb、a、

B依次洗脫下來。

方法：

1.用酸處理載體二乙氨乙基纖維素（DEAE）,使其帶正電荷

2.裝柱

3.加入蛋白質(zhì)溶液，過柱時帶負(fù)電的蛋白質(zhì)吸附于載體上，帶正電的蛋白質(zhì)流出

4.然后用堿性溶液洗脫

三.凝膠過濾法

原理：凝膠顆粒是網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)分子大小不同的混合物通過凝膠柱時，分子大的先下來，分子小的則嵌

入凝膠顆粒的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中后下來，從而將分子大小不同的物質(zhì)分離，即為分子篩的作用。

常用凝膠：

葡聚糖凝膠Sephadex、聚丙烯酰胺凝膠Sephacryl、瓊脂糖凝膠Sepharose

常用葡聚糖凝膠Sephadex的型號：G10、25、50、75、100、150、200

蛋白質(zhì)孔徑愈小，選用型號愈小

不同型號分離蛋白質(zhì)大小不同，分離1g多用G150

方法：

1.用緩沖液浸泡凝膠干粉，使其充分膨脹

2.裝柱

3.蛋白質(zhì)溶液過柱，收集過柱后的蛋白質(zhì)溶液，一般5ml/小時

凝膠過濾分離的優(yōu)點(diǎn)：

1.使用單一緩沖液，不需梯度洗脫

2.用后凝膠不需要再生，可連續(xù)使用

3.重復(fù)性好，樣品回收率高

4.不引起蛋白質(zhì)變性和失去生物學(xué)活性

缺點(diǎn)：

1.網(wǎng)孔徑大小有限，限制分離物

2.凝膠可吸附芳香類、脂蛋白等物質(zhì)，影響分離效果

3.過濾速度慢（5ml/h）,上樣后要走1-2天

四.親和層析法

原理：利用抗原抗體的結(jié)合具有特異性、可逆性，將純化抗原先交聯(lián)到載體上，制成親和層析柱，當(dāng)Ab

（Ig）通過時，與抗原在柱上特異性結(jié)合，Ab中雜質(zhì)流出。然后通過改變緩沖液pH、離子強(qiáng)度，使Ab

解脫下來。

方法：

1.親和層析柱制備：Sepharose4B——（浪化鼠）——吸附特異Ag裝柱

2.蛋白質(zhì)溶液過柱（特異性Ag與相應(yīng)Ab結(jié)合）

3.改變緩沖液pH沖洗柱子，使Ag、Ab分離，收集Ab

優(yōu)點(diǎn)：分離的1g很純、柱子可反復(fù)使用

缺點(diǎn)：柱子制備較復(fù)雜

以上四種方法一般選用1~2~3種，或者一種方法反復(fù)進(jìn)行2~3次

思考題：

1.分離提純免疫球蛋白有哪些方法，其原理是什么？

九.單克隆抗體及應(yīng)用（monoclonalantibody,McAbormAb）

一.概述

克?。簾o性繁殖的細(xì)胞株

單克隆：由一個細(xì)胞無性繁殖而來的一個細(xì)胞株（一團(tuán)細(xì)胞），其中所有細(xì)胞特性完全相同

（一）單克隆抗體：

針對Ag分子表面某一抗原決定簇（表位）而產(chǎn)生的抗體分子，稱McAb。

單克隆抗體——由一個B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的識別單一抗原表位的同源抗體。

（二）產(chǎn)生

1.1975年KohlerandMilstein首創(chuàng)用雜交瘤技術(shù)成功制備McAb

2.80年代初用基因工程成功制備McAb

（三）制備McAb的方法

1.雜交瘤技術(shù)

2.基因工程技術(shù)

二.雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體

（一）雜交瘤技術(shù)（hibrydoma）制備單克隆抗體的原理

B細(xì)胞（漿）+瘤細(xì)胞—（雜交）…雜交瘤細(xì)胞--（分泌）一單克隆抗體

（B細(xì)胞：能產(chǎn)生抗體的小鼠B（漿）細(xì)胞瘤細(xì)胞：小鼠骨髓瘤細(xì)胞）

1.B細(xì)胞（漿細(xì)胞）特點(diǎn)：

1）能產(chǎn)生抗體

2）但不能在體外長期培養(yǎng)

3）細(xì)胞內(nèi)含HGPRT酶（次黃喋吟鳥喋吟磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶）和TK酶（胸腺嚅咤核苜激酶），可通過旁路途徑

合成DNA

2.骨髓瘤細(xì)胞特點(diǎn)：

1）能在體外長期培養(yǎng)

2）不含HGPRT和TK酶

3.雜交瘤細(xì)胞具有以匕兩種細(xì)胞的共性：

既能產(chǎn)生抗體、在體外能長期培養(yǎng)；

含有HGPRT和TK酶，可通過旁路途徑合成DNA

4.HAT培養(yǎng)液篩選出雜交瘤細(xì)胞（次黃喋吟、氨基蝶吟、胸腺喀呢）：

家基蝶吟是抗代謝的藥物，能阻斷內(nèi)源性合成DNA（合成DNA的主要途徑）。

氨甲蝶n令（葉酸拮抗劑）阻止合成DNA

雜交瘤細(xì)胞（含HGPRT、TK）經(jīng)旁路途徑合成DNA

5.B細(xì)胞、瘤細(xì)胞雜交，經(jīng)HAT培養(yǎng)液培養(yǎng)數(shù)日后，五種細(xì)胞的存活情況：

（1）B細(xì)胞：自然死亡（不能在體外長期培養(yǎng)）

（2）瘤細(xì)胞：HAT培養(yǎng)液（氨甲蝶吟）阻止細(xì)胞合成DNA；同時無HGPRT、TK酶，不能通過旁路途徑合

成DNA,故死亡

（3）B/B雜交細(xì)胞：自然死亡

（4）瘤/瘤雜交細(xì)胞：死亡

（5）漿細(xì)胞/瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞：可以生長（HAT培養(yǎng)液中氨甲蝶吟阻止DNA合成；但其含有HGPRT、TK

酶,可通過旁路途徑合成DNA）

（-）雜交瘤技術(shù)制備McAb的簡要步驟：

1.制備能產(chǎn)生單抗的雜交瘤細(xì)胞

2.克隆化雜交瘤細(xì)胞

3.篩選雜交瘤細(xì)胞

4.擴(kuò)大培養(yǎng)單克隆雜交瘤細(xì)胞

5.收集單抗并鑒定

6.純化單抗

1.制備雜交瘤細(xì)胞

（1）制備能產(chǎn)生McAb的小鼠脾（B）細(xì)胞：

Ag免疫Balb/c小鼠---測抗體--一取脾--一制備脾細(xì)胞懸液---計數(shù)

（2）細(xì)胞融合：脾細(xì)胞（B）+小鼠骨髓瘤細(xì)胞一雜交

脾細(xì)胞（l-5X107/ml）瘤細(xì)胞（107-8/ml）

融合劑：40%聚乙二醇（PEG）

⑶篩選：培養(yǎng)過程中加入HAT培養(yǎng)液，培養(yǎng)14天，存活細(xì)胞為雜交瘤細(xì)胞。

2.鑒定：將篩選出的能產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行鑒定：

方法：采用ELISA、IF間接法檢測雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中有無目的Ab,包被已知Ag+雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上

清（Ab?）-洗滌，+醐標(biāo)羊抗鼠IgG-洗滌，+底物一根據(jù)顯色判斷有無特異Ab

3.克隆化

（1）有限稀釋法：特異雜交瘤細(xì)胞稀釋：7-10個/ml,取0.1ml/孔，反復(fù)稀釋培養(yǎng)、測相關(guān)抗體

（2）顯微操作法：直接在顯微鏡下取單個雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)、測相關(guān)抗體

※篩選和克隆化應(yīng)反復(fù)交叉進(jìn)行。

4.凍存或擴(kuò)大培養(yǎng)

（1）在液氮中凍存經(jīng)鑒定后的雜交瘤細(xì)胞備用，需要忖復(fù)蘇

（2）擴(kuò)大培養(yǎng)（增殖），可得到大量單克隆抗體

體外法：將雜交瘤細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)、傳代

體內(nèi)法：將雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔內(nèi)，利用雜交瘤細(xì)胞能大量繁殖的特點(diǎn)，產(chǎn)生腹水，腹水中有大量的

單抗

5.鑒定

（1）聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定單克隆抗體的純度；

（2）用ELISA、免疫電泳法鑒定抗體特性

6.純化：鹽析法、離子交換層析法、凝膠過濾法、親和層析法任選1-2種

清

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一

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離

產(chǎn)

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曩

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雜

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碧

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一

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耨

（三）雜交瘤技術(shù)制單抗的優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：

1.制備的單抗特異性高、效價高、產(chǎn)量高

缺點(diǎn)：

1.需特殊條件、無菌操作、難得到穩(wěn)定細(xì)胞株；

2.抗體為抗鼠的IgG抗體，長期用于人體不利

三.人源單克隆抗體

（-）概念：單克隆抗體為人IgG

（二）制備目的：用于人

（三）雜交瘤技術(shù)制人源單抗的方法

1.人B細(xì)胞+鼠瘤細(xì)胞不穩(wěn)定

2.人B細(xì)胞+人瘤細(xì)胞大多人瘤細(xì)胞含有HGPRT酶

3.人B細(xì)胞+人淋巳母細(xì)胞樣細(xì)胞惡性、難以獲得

4.EBV轉(zhuǎn)化的能產(chǎn)生Ab的B細(xì)胞轉(zhuǎn)化復(fù)雜

四.基因工程制備單克隆抗體

（-）概念：在基因水平上對編碼抗體的基因進(jìn)行切割、拼接或修飾，甚至人工合成，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞

內(nèi)表達(dá)而產(chǎn)生的抗體（單克隆抗體）。

人-鼠嵌合抗體（chimericantibody）

重構(gòu)抗體（reshapedhumanizedantibody）

小分子抗體：Fab片段

Fc片段

Fv片段

雙特異性抗體（bispecificantibody）：1g-融合蛋白，抗體導(dǎo)向酶等

（二）基因工程抗體種類

1.嵌合抗體

（1）概念：用DNA重組技術(shù)將鼠源單抗基因的可變區(qū)（V區(qū)）基因與產(chǎn)生人1g的恒定區(qū)（C區(qū)）基因相

連接，構(gòu)成嵌合基因，導(dǎo)入受體細(xì)胞（骨髓瘤細(xì)胞），表達(dá)出嵌合抗體。

嵌合基因：紅色一鼠McAb可變區(qū)基因；綠色一人1g的恒定區(qū)基因

嵌合抗體：可變區(qū)為鼠McAb部分，其它部分為人1g部分

構(gòu)建成功的嵌合抗體：

抗乳腺癌（1986）、抗結(jié)腸癌（1987）、抗肺癌（1987）抗CEA（癌胚抗原）（1989）、抗HBsAg（1990我國）

抗T表面受體BMA031-lgG（1991我國）

（2）嵌合抗體優(yōu)點(diǎn)：

a.免疫原性低，有利于用于人體

b.在人體內(nèi)半衰期較鼠單抗長

c.在人體內(nèi)生物學(xué)作用（如CDC、ADCC）較鼠單抗強(qiáng)

d.與人/人雜交瘤比，體外傳代更穩(wěn)定

（3）嵌合抗體制備流程：（不用記）

a.提取能產(chǎn)生McAb雜交瘤細(xì)胞的DNA、RNA、mRNA

b.建立基因文庫：分純輕、重鏈V區(qū)基因

c.測輕、重鏈V區(qū)基因DNA序列

d.與人1g輕、重鏈C區(qū)基因及表達(dá)載體連接，構(gòu)成嵌合基因

e.導(dǎo)入受體細(xì)胞表達(dá)，并篩選

f.產(chǎn)物鑒定

2.重構(gòu)抗體（ReshapedAntibody）

在嵌合抗體基礎(chǔ)卜.發(fā)展而來，使嵌合抗體進(jìn)一步“人化”

以人1g基因?yàn)榭蚣?，去掉高變區(qū)部分，用鼠單抗高變區(qū)基因連接上，構(gòu)成重構(gòu)基因，導(dǎo)入受體細(xì)胞表達(dá)出

的抗體。

研究表明，1g的氨基酸序列在重、輕鏈各有三個高變區(qū)（與抗原結(jié)合的部位）：

重鏈（共450aa）；N端31~37、51~68、84~91

輕鏈（共214aa）：N端26~32、48~55、90~95

重構(gòu)基因：綠色為人1g基因（框架），紅色為鼠McAb基因（高變區(qū)部位基因）

重構(gòu)抗體：所有綠色部分均為人源，紅色部分為鼠源（CDR）

重構(gòu)抗體在臨床應(yīng)用更優(yōu)于嵌合抗