胰島素生產(chǎn)流程圖

胰島素(E.Coli)生產(chǎn)流程2021/3/29星期一1

2021/3/29星期一2人胰島素—碳水化合物代謝和體細(xì)胞供能一級結(jié)構(gòu)：51個氨基酸雙鏈（A：21，B：30）分子量：5734g/mol等電點(diǎn)：5.4胰島素產(chǎn)生受損導(dǎo)致糖尿病2021/3/29星期一3人胰島素的制備方法人胰腺提取---原料來源有限通過單個氨基酸化學(xué)合成---生產(chǎn)成本太高豬胰島素轉(zhuǎn)化或“半合成”--成本高，來源少基因工程菌發(fā)酵--雙鏈—Genentech,開發(fā)，EliLilly放大--胰島素原（82個氨基酸，胰島素的前體）--分泌法（Yeast），NovoNordisk產(chǎn)業(yè)化

--細(xì)胞內(nèi)法（E.coli），表達(dá)121+82個氨基酸的Trp-LE’-Met-proinsulin包涵體，EliLilly產(chǎn)業(yè)化2021/3/29星期一4E.Coli胰島素原法

轉(zhuǎn)化流程2021/3/29星期一5市場分析和設(shè)計基礎(chǔ)（2005）

糖尿病人數(shù)：美國1800萬，全世界1.5-2.0億，年增長率3-4%胰島素年銷售額35-40億美元,由NovoNordisc、EliLilly和SanofiAventis三家壟斷每個患者每年購買胰島素的花費(fèi)：$250-750每個病人每年平均用量：0.5克純胰島素對1.5-2.0億患者，年需求75-100噸純胰島素目前年產(chǎn)量20-30噸純胰島素設(shè)計年產(chǎn)量：1800kg純胰島素，滿足350萬人年工作330天，每48小時生產(chǎn)一批次，每年160批次每批次發(fā)酵液體積：37.5立方米，發(fā)酵罐空罐體積：50立方米2021/3/29星期一6人重組胰島素（E.coli）生產(chǎn)流程發(fā)酵工段初回收工段反應(yīng)工段終純化工段2021/3/29星期一72021/3/29星期一8通氣量：0.5VVM空罐體積：50立方米前接2級種子罐發(fā)酵周期：18小時發(fā)酵溫度：37度終菌密度：30克（干重）/升包涵體含量：干重的20%終保溫：10度發(fā)酵工段2021/3/29星期一9初回收工段—物料溫度保持10度--三個平行的碟片式離心機(jī)收獲菌體--菌液從37000L濃縮到9165L菌泥--菌體收率98%加與菌泥等體積的緩沖液(96.4%w/wWFI注射用水,0.7%EDTA,和2.9%TRIS-base)稀釋,有利于菌體碎片與包涵體分離三次高壓勻漿機(jī)破菌釋放包涵體壓降800bar終物料體積：1400L用前面的碟片式離心機(jī)回收包涵體收率98%加2倍體積的清洗劑(0.66%Triton-X100),洗滌包涵體2021/3/29星期一10反應(yīng)工段—溶解包涵體玻璃反應(yīng)釜內(nèi)加終濃度為300g/L(5M)的尿素（溶解變性蛋白）和40g/L的2-巰基乙醇（減少二硫鍵的結(jié)合）反應(yīng)時間：8小時溶解收率：95%包涵體內(nèi)Trp-LE’-Met-proinsulin含量

：80%w/wWFI透析6小時，收率98%，去除尿素和2-巰基乙醇過濾去除細(xì)小顆粒，保護(hù)后續(xù)層析柱。終體積5200L再次離心，去除菌體碎片和可溶性蛋白共用前面回收工段的碟片離心機(jī)2021/3/29星期一11反應(yīng)工段—嵌合蛋白被CNBr溴化氰裂解為121個氨基酸的Trp-LE’-Met和82個氨基酸的Proinsulin70%甲酸溶液30倍過量加入CNBr(理論摩爾比1:1)收率95%反應(yīng)時間：12小時反應(yīng)溫度：20度利用前面溶解反應(yīng)釜在CNBr沸點(diǎn)35度旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)1小時會產(chǎn)生少量有毒氰化物氣體，現(xiàn)場應(yīng)準(zhǔn)備次氯酸鹽亞硫酸分解的目的是打開胰島素原和二硫鍵，給半胱氨酸加上SO3部分pH9-11，50%w/w(6M)鹽酸胍，0.35%碳酸氫銨，3%硫酸鈉，1.5%過硫酸鈉，反應(yīng)時間12小時，收率95%WFI透析至鹽酸胍濃度為20%w/w共用前面包涵體溶解過程的透析器2021/3/29星期一12反應(yīng)工段—再折疊三個平行陽離子交換層析床純化proinsulin床直徑：140cm床高度：25cm填料：SPSepharoseFF,GE洗脫液：29%w/w尿素，1.5%NaCl,69.5%WFIpH4收率90%再折疊的目的是去除SO3，然后使二硫鍵形成，并再折疊成胰島素原的正確天然結(jié)構(gòu)加入巰基