動物細胞融合與單克隆抗體

電影《人獸雜交》劇照2021/3/29星期一1動物細胞融合與單克隆抗體2021/3/29星期一21、定義：兩個或多個不同的細胞融合成一個細胞的過程。也稱細胞雜交一、動物細胞融合雜交細胞：融合后形成的具有原來兩個或多個細胞遺傳信息的單核細胞成為雜交細胞。2021/3/29星期一32、誘導融合的因素生物法：滅活的病毒誘導融合.(病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細胞互相凝聚，使細胞膜上的蛋白質分子和脂質分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。)化學法：聚乙二醇PEG誘導融合.物理法：電激融合病毒顆粒黏附細胞表面細胞膜連接細胞膜被病毒顆粒穿通細胞融合、形成雜種細胞不能，因為不滅活的病毒會感染細胞。2021/3/29星期一4(三)動物細胞融合的應用1.突破有性雜交方法的局限,使遠緣雜交成為可能。(至今種間、屬間、科間，甚至動物與植物之間的細胞融合已獲得成功。)2.成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和生物新品種培育等的重要手段。3.為制造單克隆抗體開辟了新途徑。鼠—雞、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、人—雞、人—蛙、酵母菌—雞、人—胡蘿卜等2021/3/29星期一5二、單克隆抗體

什么是抗體？抗體是機體受抗原刺激后產(chǎn)生的、并能與該抗原發(fā)生特異性結合的具有免疫功能的球蛋白。

B淋巴細胞（漿細胞）能產(chǎn)生抗體。2021/3/29星期一6（一）獲得抗體的傳統(tǒng)方法1、把某種抗原反復注射到動物體內，然后從動物血清中分離出所需的抗體。2、缺點：

產(chǎn)量低，純度低，特異性差。2021/3/29星期一72021/3/29星期一8人們發(fā)現(xiàn)，在動物發(fā)生免疫反應的過程中，體內的B淋巴細胞可以產(chǎn)生多達百萬種以上的特異性抗體，但是每一個B細胞只分泌一種特異性抗體。要想獲得大量的單一抗體，必須克隆單一的B淋巴細胞，形成細胞群。1、請從以上文字資料中找出單克隆抗體的概念用單個B淋巴細胞進行克隆，得到的細胞群能夠分泌一種化學性質單一、特異性強的抗體，這種抗體就叫做單克隆抗體。2021/3/29星期一92、怎樣才能獲得單克隆抗體？提示1：僅用細胞培養(yǎng)技術可行嗎？提示2：我們所學的哪種細胞是可以無限增殖的？提示3：有什么方法能使B細胞產(chǎn)生抗體的能力和腫瘤細胞無限增殖能力同時具備呢？2021/3/29星期一10如何大量生產(chǎn)單克隆抗體？利用B淋巴細胞產(chǎn)生抗體的功能。利用腫瘤細胞無限增殖的特性。利用細胞融合的技術將兩種細胞融合獲得具有B淋巴細胞和腫瘤細胞特性的雜交瘤細胞。利用動物細胞培養(yǎng)技術大量培養(yǎng)雜交瘤細胞。2021/3/29星期一11

注射抗原B淋巴細胞骨髓瘤細胞細胞融合、篩選雜交瘤細胞細胞培養(yǎng)

篩選，繼續(xù)培養(yǎng)足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細胞群體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔單克隆抗體2021/3/29星期一12單克隆抗體的制備2021/3/29星期一13

（二）單克隆抗體的制備2021/3/29星期一14動物特異性免疫分離B淋巴細胞（B）；找到骨髓瘤細胞（G）。注意B淋巴細胞是一個系列。（B1,B2,B3,---Bn）細胞融合——三種融合方式:（BB;BG;GG）第一次篩選：在“選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)”上培養(yǎng)篩選雜交瘤細胞（只有BG雜交瘤細胞存活。但BG雜交瘤細胞也是一個系列：如B1G,B2G---BnG。而BB,GG在此培養(yǎng)基上不能存活。）第二次篩選：在“多孔培養(yǎng)板上”培養(yǎng)雜交瘤細胞系列

，每孔只放一個雜交瘤細胞?！翱寺』囵B(yǎng)”每個雜交瘤細胞，并進行“單一抗體檢測”，“檢測陽性”的孔內即是所需要的雜交瘤細胞。單抗的制備過程要點：2021/3/29星期一152021/3/29星期一162021/3/29星期一172021/3/29星期一18動物特異性免疫分離B淋巴細胞（B）；找到骨髓瘤細胞（G）。注意B淋巴細胞是一個系列。（B1,B2,B3,---Bn）細胞融合——三種融合方式:（BB;BG;GG）第一次篩選：在“選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)”上培養(yǎng)篩選雜交瘤細胞（只有BG雜交瘤細胞存活。但BG雜交瘤細胞也是一個系列：如B1G,B2G---BnG。而BB,GG在此培養(yǎng)基上不能存活。）第二次篩選：在“多孔培養(yǎng)板上”培養(yǎng)雜交瘤細胞系列

，每孔只放一個雜交瘤細胞?！翱寺』囵B(yǎng)”每個雜交瘤細胞，并進行“單一抗體檢測”，“檢測陽性”的孔內即是所需要的雜交瘤細胞。選擇所需要的雜交瘤克隆細胞群，體外培養(yǎng)或注射到小鼠腹腔內增殖。提取單克隆抗體。2021/3/29星期一193）、為何要進行兩次篩選？4）、如何進行第2次篩選？培養(yǎng)在多孔培養(yǎng)板上，每孔只有一個雜交瘤細胞。第1次篩選得到雜交瘤細胞（多種）。第2次篩選得到能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細胞群。問題強化：1）、本過程利用了哪些原理？免疫原理，細胞融合原理和動物細胞培養(yǎng)原理2）、為什么選用小鼠骨髓瘤細胞與B細胞融合？這樣融合成的雜交瘤細胞，繼承了雙親細胞的遺傳物質，不僅具有B細胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領，因而可以獲得大量單克隆抗體2021/3/29星期一201、作為診斷試劑：在臨床生化診斷、病理組織定位、體內腫瘤的定位等,與常規(guī)抗體相比,具有準確、高效、簡易、快速特點.2、單克隆抗體的優(yōu)點：

特異性強，靈敏度高，可大量制備。3、單克隆抗體的應用2021/3/29星期一21單克隆抗體與早孕測試試劑主要成分：抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體原理：定性測定尿液中的人絨毛膜促性腺激素。（孕婦尿中的人絨毛膜促性腺激素能與抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體發(fā)生特異性結合）從免疫學看，孕婦尿中的人絨毛膜促性腺激素是什么？2021/3/29星期一221、作為診斷試劑：在臨床生化診斷、病理組織定位、體內腫瘤的定位等,與常規(guī)抗體相比,具有準確、高效、簡易、快速特點.2、用于治療疾病和運載藥物：主要用于癌癥治療。生物導彈：單克隆抗體：導向。準確找到癌細胞位置，原位殺死癌細胞。2、單克隆抗體的優(yōu)點：

特異性強，靈敏度高，可大量制備。3、單克隆抗體的應用2021/3/29星期一232021/3/29星期一24為什么不用兩個而要用多個細胞進行動物細胞間的融合？就目前常用的細胞融合方法來看，不管是用物理的、化學的方法，還是生物的方法，其融合率都不可能是100%。僅用兩個細胞融合，其效率太低，不一定能得到融合細胞。更重要的是，即使兩個細胞已發(fā)生融合，但并不一定是研究者期望得到的細胞類型。目前動物細胞融合技術最有價值的應用就是單克隆抗體的制備。2021/3/29星期一25主要用于制備單克隆抗體獲得雜種植株用途物理、化學方法（同左）滅活的病毒物理（離心、振動、電激）化學（聚乙二醇）誘導方法使細胞分散后誘導細胞融合去除細胞壁后誘導原生質體融合細胞融合的方法細胞膜的流動性細胞膜的流動性、植物細胞全能性原理動物細胞融合植物體細胞雜交比較項目植物體細胞雜交、動物細胞融合的比較2021/3/29星期一26思考與探究1.植物體細胞雜交技術與動物細胞融合技術有什么不同？植物體細胞雜交技術與動物細胞融合技術基本相同，不同的是植物體細胞融合前需去掉細胞壁，然后再融合；動物細胞融合是兩個體細胞直接融合。2021/3/29星期一27

資料：目前世界各國已經(jīng)研制出數(shù)以百計的單克隆抗體。許多缺乏良好診斷手段的傳染病、免疫性疾病、血液病、內分泌疾病和遺傳病，用單克隆抗體作為診斷手段，是一個必然趨勢。另外，用單克隆抗體做體內診斷，借以鑒別和定位體內“病灶”也引起人們的注意，目前，主要用于腫瘤追蹤及心肌梗塞的診斷。2021/3/29星期一282.制備單克隆抗體時，為什么要選用B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞？哺乳動物感染抗原后，其體內會形成相應的B淋巴細胞，B淋巴細胞能分泌相應的抗體凝聚或殺死這些抗原。動物在免疫反應的過程中，每一種B淋巴細胞能分泌一種特異性抗體，要想獲得大量的特異性抗體，必須使能分泌該單一抗體的B淋巴細胞大量增殖。B淋巴細胞具有產(chǎn)生單一抗體的能力，但不能在體外增殖；骨髓瘤細胞是一種癌細胞，它能在體外培養(yǎng)條件下無限增殖，但不能產(chǎn)生抗體。因此，把一種B淋巴細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細胞，它會兼有兩個親本細胞的特性──在體外培養(yǎng)條件下能不斷增殖，同時能產(chǎn)生出某種特異性的抗體。2021/3/29星期一291．在動物細胞融合和植物體細胞雜交的比較中，正確的是（）A．結果是相同的

B．雜種細胞的形成過程基本相同C．操作過程中酶的作用相同D．誘導融合的手段相同Ｂ2021/3/29星期一302.單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細胞和B淋巴細胞誘導融合后，要用特定培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細胞，在這種培養(yǎng)基上不能存活增殖的細胞是（）①淋巴細胞②小鼠骨髓瘤細胞③B淋巴細胞自身融合細胞④小鼠骨髓瘤細胞自身融合細胞⑤雜交瘤細胞

A．②④B．①③⑤

C．①②③④D．②③C2021/3/29星期一31植物體細胞雜交的意義：打破生殖隔離，克服遠緣雜交不親和的障礙，培育作物新品種。2021/3/29星期一32一、動物細胞融合細胞融合是正常的生命活動。

兩個細胞正在融合

受精作用2021/3/29星期一33(一)動物細胞融合的概念

動物細胞融合也稱細胞雜交,是指兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的過程。（二）動物細胞融合的過程與植物原生質體融合原理相同，方法類似。雜交細胞:融合后形成的具有原來兩個或多個細胞遺傳信息的單核細胞。2021/3/29星期一34細胞A細胞B雜種細胞滅活的病毒物理法化學法2021/3/29星期一35用滅活的病毒誘導動物細胞融合過程細胞核病毒顆粒細胞核2021/3/29星期一36（三）單克隆抗體的應用

與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體特異性強，靈敏度高，并可大量制備。應用主要有：1、作為診斷試劑2、用于治療疾病和運載藥物準確、高效、簡易、快速

把抗癌細胞的單克隆抗體與藥物相結合，制成“生物導彈”。2021/3/29星期一37為什么滅活的病毒能作為誘導劑？因為滅活的病毒能使細胞膜上的蛋白質分子和脂質分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。不滅活的病毒能作為誘導劑嗎？不能，因為不滅活的病毒會感染細胞。2021/3/29星期一382021/3/29星期一39如何進行雜交瘤細胞的抗體檢測及克隆化培養(yǎng)？融合后的細胞經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能存活的細胞就是雜交瘤細胞。但這些雜交瘤細胞并非都是能分泌所需抗體的細胞，通常用“有限稀釋法”來選擇。將雜交瘤細胞稀釋，用多孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每孔細胞不超過一個，通過培養(yǎng)讓其增殖。然后檢測各孔上清液中細胞分泌的抗體（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗法），那些上清液可與特定抗原結合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中的細胞還不能保證是來自單個細胞，挑選陽性孔的細胞繼續(xù)進行有限稀釋，一般需進行3～4次，直至確信每個孔中增殖的細胞為單克隆細胞。該過程即為雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)。2021/3/29星期一40在多孔培養(yǎng)板上，在每孔只有一個雜交瘤細胞的情況下，培養(yǎng)得到的細胞群是單個雜交瘤細胞克隆得來的，所以產(chǎn)生的抗體必然是化學性質單一的，特異性強的單克隆抗體。這里的單克隆確有單個細胞克隆的含義，只不過克隆的不是B淋巴細胞，而是雜交瘤細胞。雜交瘤細胞既能迅速大量繁殖，又能產(chǎn)生專一抗體。2021/3/29星期一41整個制備過程為何要經(jīng)過兩次篩選?第一次篩選：用特定的選擇培養(yǎng)基篩選出多種雜交瘤細胞第二次篩選（克隆化培養(yǎng)和抗體檢測）：篩選出能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細胞。2021/3/29星期一42單克隆抗體的概念：

由單個雜交瘤細胞進行無性繁殖,也就是通過克隆，形成細胞群，這一細胞群所產(chǎn)生的化學性質單一、特異性強的抗體稱為單克隆抗體。2021/3/29星期一43單克隆抗體的制備抗原注入小鼠體內骨髓瘤細胞分離B淋