第9章 DNA序列分析課件

第九章DNA序列分析第一節(jié)Maxam-Gilbert化學降解法第二節(jié)Sanger鏈終止法第三節(jié)DNA片段序列測定的策略第四節(jié)核苷酸序列的生物信息分析第9章DNA序列分析DNA測序（DNAsequencing，或譯DNA定序）是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）與鳥嘌呤的（G）排列方式。確定DNA雙股鏈上每一個獨立結構單元或堿基的確切順序。DNA序列的正確測定，是進行基因結構和功能分析，繪制基因圖譜、轉(zhuǎn)基因檢測等方面工作的重要前提。同時DNA測序技術為快速、簡捷分析蛋白序列及結構提供了工具。第9章DNA序列分析DNA測序的發(fā)展：1953年，Watson和Crick推導出DNA雙螺旋結構；1954年，Whitfeld發(fā)明化學降解測序法；1972年，Berg開發(fā)DNA重組技術；1975年，Sanger發(fā)明加減測序法；1977年，Sanger發(fā)明雙脫氧測序法；1986年，第一臺半自動測序儀出現(xiàn)；2000年，Drosophila全基因組測序完成。第9章DNA序列分析DNA序列測定分手工測序和自動測序，手工測序包括sanger雙脫氧鏈終止法和maxam-gilbert化學降解法。20實際80年代中期，測序儀出現(xiàn)。發(fā)展至今，自動化測序已成為當今DNA序列分析的主流。美國peabi公司已生產(chǎn)出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA測序儀，其中310型是臨床檢測實驗室中使用最多的一種型號。第9章DNA序列分析最早的測序技術測序技術最早可以追溯到20世紀50年代，早在1954年就已經(jīng)出現(xiàn)了關于早期測序技術的報導，即Whitfeld等用化學降解的方法測定多聚核糖核苷酸序列。第一代測序技術誕生1977年Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Gilbert等發(fā)明的化學降解法，標志著第一代測序技術的誕生。此后，在Sanger法的基礎上，80年代中期出現(xiàn)了以熒光標記代替放射性同位素標記、以熒光信號接收器和計算機信號分析系統(tǒng)代替放射性自顯影的自動測序儀。另外，90年代中期出現(xiàn)的毛細管電泳技術使得測序的通量大為提高。除此之外，這一時期還出現(xiàn)了一些其他的測序方法，如焦磷酸測序法（pyrosequencing）、連接酶測序法（sequencingbyligation,SBL）、雜交測序法（sequencingbyhybridization,SBH）等。第9章DNA序列分析第二代自動測序技術盡管第一代測序技術已經(jīng)幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類基因組草圖等大量的測序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的測序方法。經(jīng)過不斷的開發(fā)和測試，進入21世紀后，以Roche公司的454技術、Illumina公司的Solexa技術和ABI公司的SOLiD技術為標志的第二代測序技術誕生了。與第一代技術相比，第二代測序技術不僅保持了高準確度，而且大大降低了測序成本并極大地提高了測序速度。使用第一代Sanger的測序技術完成的人類基因組計劃，花費了30億美元巨資，用了三年的時間；然而，使用第二代SOLiD的測序技術，完成一個人的基因組測序現(xiàn)在只需要一周左右的時間。由于第二代測序技術產(chǎn)生的測序結果長度較短，因此比較適合于對已知序列的基因組進行重新測序，而在對全新的基因組進行測序時還需要結合第一代測序技術。第9章DNA序列分析第三代基因組測序技術實現(xiàn)單分子速讀據(jù)《自然》雜志網(wǎng)站2月8日報道，在美國佛羅里達州馬可島召開的“基因組生物學與技術進展大會”上，來自加利福尼亞門洛帕克市的太平洋生物科技公司(PacificBiosciences)介紹了其研制的第三代基因組測序儀，該測序儀實現(xiàn)了一次標記一個分子式的單分子速讀。第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析序列測定的技術

雜交測序法質(zhì)譜法單分子測序法原子探針顯微鏡測序法DNA芯片法經(jīng)典方法:Sanger雙脫氧鏈終止法(Sanger,1977)Maxam-GilbertDNA化學降解法(Maxam&Gilbert,1977)新技術方法:第9章DNA序列分析第一節(jié)Maxam-Gilbert化學降解法

化學降解法：人們用專一性作用于A、T、G、C堿基的化學藥劑分別處理經(jīng)內(nèi)切酶切割而成的一定長度DNA片段，通過控制反應時間，既可獲得分別以A、T、G、C為結尾的四組由所有可能長度核苷酸片段組成的DNA片段群。除了要研究與DNA的高級結構、DNA-蛋白質(zhì)結構相關性采用化學降解法外，對于單純以測序為目的的實驗，普遍采用后面所講的酶促合成法。

第9章DNA序列分析堿基特異性化學切割反應：硫酸二甲酯（DMS）：使DNA分子中鳥嘌呤（G）上的N7原子甲基化。肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶環(huán)斷裂；但高鹽條件下，只C斷裂，而不與T反應。哌啶：從修飾甲基處斷裂核苷酸鏈。在不同的酸、堿、高鹽和低鹽條件下，三種化學試劑按不同組合可以特異地切割核苷酸序列中特定的堿基。第9章DNA序列分析G反應：DMS使G在中性和高溫條件下脫落。G+A反應：酸性條件（如甲酸）可使A和G嘌呤環(huán)上的N原子質(zhì)子化，利用哌啶使A、G脫落。T+C反應：肼（低鹽）C反應：肼（高鹽）測定DNA長度~250bp。第9章DNA序列分析化學裂解法測定DNA的核苷酸序列第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析第二節(jié)Sanger鏈終止法1977年Sanger設計了一種通過DNA復制來識別4種堿基的方法，進行DNA序列測定，即雙脫氧鏈終止法。Sanger法獲得諾貝爾化學獎。一、Sanger雙脫氧鏈終止法原理在模板指導下，DNA聚合酶不斷將dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延長，合成出新的互補的DNA鏈，如果加入雙脫氧三磷酸核苷(ddNTP)，由于雙脫氧核糖的3’位置上缺少一個羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，即形成一種全部具有相同5’-引物端和以ddNMP殘基為3’端結尾的一系列長短不一片段的混合物。由于雙脫氧核苷酸在每個DNA分子中摻入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分長度差一個核苷酸的單鏈DNA，從而讀取DNA核苷酸序列。

第9章DNA序列分析與PCR反應類似。反應體系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和測序引物；反應過程：變性－復性－延伸－終止Sanger雙脫氧終止法第9章DNA序列分析Dideoxynucleotides

（雙脫氧核苷酸）ddNTPs是反應終止劑可以當作正常堿基參與復制，一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接。反應體系中dNTPs的濃度遠高于ddNTPs(一般3~4：1)。第9章DNA序列分析*少一個－OH脫氧核甘酸與雙脫氧核甘酸結構比較H第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析二、雙脫氧終止法測序反應體系：DNA聚合酶單鏈DNA模板帶有3-OH末端的單鏈寡核苷酸引物Mg2+4種dNTP(aATP、dGTP、dCTP和dTTP)4種ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP和ddTTP)第9章DNA序列分析Sanger法DNA測序的試劑①引物：通常由20-23個堿基構成，G+C=12，A+T=8到11，Tm=60-68℃，避免形成引物二聚體或形成發(fā)卡樣結構②模板③

DNA聚合酶④

2’,3’-雙脫氧核苷三磷酸（2’,3’-dideoxynucleosidetriphosphate,ddNTP）⑤

dNTP三、測序反應的種類①引物標記法(Dyeprimerreactions)②終止物標記法(Dyeterminatorreactions)第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析Thisfigureshowsthestructureofadideoxynucleotide(noticetheHatomattachedtothe3'carbon).AlsodepictedinthisfigurearetheingredientsforaSangerreaction.Noticethedifferentlengthsoflabeledstrandsproducedinthisreaction.第9章DNA序列分析Thisfigureisarepresentationofanacrylamidesequencinggel.NoticethatthesequenceofthestrandofDNAcomplementarytothesequencedstrandis5'to3'ACGCCCGAGTAGCCCAGATTwhilethesequenceofthesequencedstrand,5'to3',isAATCTGGGCTACTCGGGCGT第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析測序過程:1.模板與引物雜交2.引物的延長和合成阻斷四個試管分別加入：DNA聚合酶、dNTPs、標記引物終止劑不同：ddA、ddG、ddC、ddT四個試管中所有產(chǎn)物是一系列長度只差一個核苷酸的聚合鏈3.電泳：ACGT次序，高壓電泳4.放射自顯影得到直讀圖象第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析Sanger第一步：加入復制終止劑熒光檢測探頭電泳，看誰跑得快第9章DNA序列分析ddNTPs參與下的DNA復制Sanger法測序產(chǎn)物的平均鏈長取決于ddNTP與dNTP的比例，比例高時，得到較短的產(chǎn)物；

第9章DNA序列分析GelElectrophoresis

DNAFragmentSizeDeterminationDNA帶負電DNA在電泳膠中的遷移率與其片段大小有關Sanger第二步：熒光檢測第9章DNA序列分析除核苷酸序列文本文件外，全自動測序儀還提供曲線圖。第9章DNA序列分析DNA片斷序列測定的策略測定未知序列的DNA片斷一次測序結果有長度限制（﹤1000bp)

通用引物指導未知序列的測定引物步移隨機克隆測序缺失克隆測序第9章DNA序列分析通用引物指導未知序列的測定根據(jù)載體序列設計通用引物測定待測DNA片斷第9章DNA序列分析引物步移策略將待測DNA片斷克隆在質(zhì)粒載體上，利用引物步移延伸，從DNA片斷的一端開始逐步進行序列測定，直至另一端為止?？朔锁B槍法的盲目性，并省去亞克隆制備步驟，也減輕了數(shù)據(jù)分析工作量。但由于測定下一段序列前要預先知道上游序列的堿基順序，才能合成適當?shù)囊镞M行測序。定向缺失克隆策略、染色體步查法等。第9章DNA序列分析鳥槍測序法(shotgunsequencing)：隨機克隆測序

將待測的DNA片段隨機打斷并構建隨機重疊克隆文庫，然后通過通用引物測定每個克隆中的待測DNA序列。當這些已測序列的數(shù)量達到一定程度后，相當于待測DNA片斷的每一部位的序列也就被測定出來了，通過這些所測序列之間的重疊部分，最終可將整個DNA片斷的序列拼接出來，這樣的測序策略稱為隨機克隆測序。

第9章DNA序列分析將DNA大片段切割成小片段的三種方法：限制性內(nèi)切酶酶切超聲波處理

DNA酶I降解(加Mn2+)第9章DNA序列分析鳥槍法測序的缺點隨著所測基因組總量增大，所需測序的片段大量增加，造成重復測定，也易丟失某些序列，且數(shù)據(jù)處理分析工作量大。高等真核生物（如人類）基因組中有大量重復序列，導致判斷失誤。第9章DNA序列分析完整基因組的測序過程一般包括三個步驟：（1）建立克隆的物理圖譜：如酵母人工染色體YAC（YeastArtificialChromosome）克隆、細菌人工染色體BAC（BacterialArtificialChromosome）克隆等；（2）利用鳥槍法（ShotgunStrategy）測定每個克隆的序列；（3）序列拼裝和注釋：當?shù)玫揭欢蜠NA序列之后，可以利用序列分析工具，進行序列的拼接；繼而通過與數(shù)據(jù)庫序列的比較，得到與該序列相關的信息，如基因、調(diào)控元件、重復區(qū)域等，進而對序列的生物學特性進行注釋。

基因組測序第9章DNA序列分析DNA全序列切成小段小段和載體結合結合后進行測序第9章DNA序列分析MapfragmentsSequenceoverlapping

fragmentsAssembled

sequence基因組DNA序列測定示意圖通過隨機剪切得到的大分子DNA片段克隆到載體上。繪制出這些重疊片段的圖譜，并對重疊片段進行測序，通過“拼裝”得到基因組序列。另一種方法不是根據(jù)片段的染色體位置，而是根據(jù)其重疊部分進行“拼裝”。Sequenceallfragmentsandassemble第9章DNA序列分析四、大規(guī)模DNA測序的趨勢－自動化DNA測序?qū)崿F(xiàn)規(guī)?；闹匾獥l件是自動化和機械化。目前，DNA制備、克隆文庫組建及篩選、DNA測序分析、數(shù)據(jù)的分析獲得、堿基序列閱讀、重疊克隆群順序排定等過程均已平行發(fā)展，自動化操作緊隨其后。隨著DNA測序不斷由半自動化向自動化過渡，原始數(shù)據(jù)積累將不成問題，關鍵是把全基因的散測序組裝起來，以實現(xiàn)DNA測序的完整性。目前，在亞克隆篩選、模板制備、測序反應、堿基閱讀等方面均在一定程度上實現(xiàn)了自動化。第9章DNA序列分析1、克隆篩選從亞克隆文庫中尋找并篩選單一克隆已逐步實現(xiàn)了自動化。2、模板制備現(xiàn)有的機器人被用來自動分離DNA并制備適于傳統(tǒng)操作程度的測序模板。特定用途的DNA分離儀也已采用。3、測序反應由于手工測序不能保證所需的再生產(chǎn)能力、高通量和準確的重復性，所以，DNA測序反應的自動化對大規(guī)模測序是至關重要的。4、自動放射性自顯影閱讀機近幾年來，自動化放射性自顯影閱讀機紛紛上市，并不斷向商業(yè)化及科研應用方向發(fā)展。5、自動測序儀DNA自動測序儀的應用實現(xiàn)了凝膠電泳、初始數(shù)據(jù)獲取、堿基閱讀等步驟自動化。第9章DNA序列分析310型全自動遺傳分析儀DNA全自動分析儀：ABIPrism?3100遺傳分析儀

3700型全自動遺傳分析儀安瑪西亞DNA序列分析系統(tǒng)型號：MegaBACE500/1000/4000

第9章DNA序列分析分析儀器的新發(fā)展：377型遺傳分析儀3730型遺傳分析儀

377型DNA全自動測序儀采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，結合美國應用生物系統(tǒng)(ABI)公司專利的四色熒光標記，激光檢測，一個泳道檢測的方法，一個測序反應保證500bp的準確序列。

3730型DNA全自動測序儀采用毛細管電泳，速度更快，效果更好，通量更大，一個測序反應保證800bp的準確序列，是當前基因測序的主打。第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析優(yōu)點：i.四個反應系統(tǒng)可合并點樣，大大節(jié)省制膠和點樣時間；

ii.可同時讀出多個樣品核苷酸序列，不需干燥凝膠和放射自顯影；