宏基因組學(xué)概述

PAGE2北京交通大學(xué)學(xué)報(bào)第卷宏基因組學(xué)概述王瑩，馬伊鳴（北京交通大學(xué)土木建筑工程學(xué)院環(huán)境1402班）摘要：隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展及其在微生物生態(tài)學(xué)和環(huán)境微生物學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用，促進(jìn)了以環(huán)境中未培養(yǎng)微生物為研究對(duì)象的新興學(xué)科——微生物環(huán)境基因組學(xué)(又叫宏基因組學(xué)、元基因組學(xué)，英文名Metagenomics)的產(chǎn)生和快速發(fā)展。宏基因組學(xué)通過直接從環(huán)境樣品中提取全部微生物的DNA，構(gòu)建宏基因組文庫，利用基因組學(xué)的研究策略研究環(huán)境樣品所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能．在短短幾年內(nèi)，宏基因組學(xué)研究已滲透到各個(gè)領(lǐng)域，包括海洋、土壤、熱液口、熱泉、人體口腔及胃腸道等，并在醫(yī)藥、替代能源、環(huán)境修復(fù)、生物技術(shù)，農(nóng)業(yè)、生物防御及倫理學(xué)等各方面顯示了重要的價(jià)值。本文對(duì)宏基因組學(xué)的主要研究方法、熱點(diǎn)內(nèi)容及發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了綜述關(guān)鍵詞：宏基因組宏基因組學(xué)環(huán)境基因組學(xué)基因文庫的構(gòu)建MacrosummaryofMetagenomicsWangYing,MaYi-Ming（BeijingJiaotongUniversity,Instituteofcivilengineering,）Keywords:Metagenome;Metagenomics;Theenvironmentalgenomics宏基因組學(xué)（Metagenomics）又叫微生物環(huán)境基因組學(xué)、元基因組學(xué)。它通過直接從環(huán)境樣品中提取全部微生物的DNA,構(gòu)建宏基因組文庫，利用基因組學(xué)的研究策略研究環(huán)境樣品所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能。它是在微生物基因組學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種研究微生物多樣性、開發(fā)新的生理活性物質(zhì)（或獲得新基因）的新理念和新方法。其主要含義是：對(duì)特定環(huán)境中全部微生物的總DNA（也稱宏基因組，metagenomic）進(jìn)行克隆，并通過構(gòu)建宏基因組文庫和篩選等手段獲得新的生理活性物質(zhì)；或者根據(jù)rDNA數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)引物，通過系統(tǒng)學(xué)分析獲得該環(huán)境中微生物的遺傳多樣性和分子生態(tài)學(xué)信息。1.起源宏基因組學(xué)這一概念最早是在1998年由威斯康辛大學(xué)植物病理學(xué)部門的JoHandelsman等提出的，是源于將來自環(huán)境中基因集可以在某種程度上當(dāng)成一個(gè)單個(gè)基因組研究分析的想法，而宏的英文是"meta-"，具有更高層組織結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化的含義。后來伯克利分校的研究人員KevinChen和LiorPachter將宏基因組定義為"應(yīng)用現(xiàn)代基因組學(xué)的技術(shù)直接研究自然狀態(tài)下的微生物的有機(jī)群落，而不需要在實(shí)驗(yàn)室中分離單一的菌株"的科學(xué)。2研究對(duì)象宏基因組學(xué)(Metagenomics)是將環(huán)境中全部微生物的遺傳信息看作一個(gè)整體自上而下地研究微生物與自然環(huán)境或生物體之間的關(guān)系。宏基因組學(xué)不僅克服了微生物難以培養(yǎng)的困難,而且還可以結(jié)合生物信息學(xué)的方法,揭示微生物之間、微生物與環(huán)境之間相互作用的規(guī)律,大大拓展了微生物學(xué)的研究思路與方法,為從群落結(jié)構(gòu)水平上全面認(rèn)識(shí)微生物的生態(tài)特征和功能開辟了新的途徑。目前,微生物宏基因組學(xué)已經(jīng)成為微生物研究的熱點(diǎn)和前沿,廣泛應(yīng)用于氣候變化、水處理工程系統(tǒng)、極端環(huán)境、人體腸道、石油污染、生物冶金等領(lǐng)域,取得了一系列引人矚目的重要成果。3研究方法宏基因組學(xué)的研究過程一般包括樣品和基因(組)的富集；提取特定環(huán)境中的基因組DNA；構(gòu)建宏基因組DNA文庫；篩選目的基因；目的基因活性產(chǎn)物表達(dá)(圖1)五個(gè)步驟。圖1環(huán)境微生物宏基因組學(xué)研究過程Fig.1Generalprocessofmetagenomicstrategie3.1環(huán)境樣品及目的基因組富集在宏基因組文庫篩選過程中目的基因僅占總DNA的一小部分,對(duì)環(huán)境樣品的預(yù)富集可以大大提高目的基因的檢出幾率。目前預(yù)富集技術(shù)主要分為細(xì)胞水平富集和基因組水平富集。其中細(xì)胞水平富集主要是通過利用選擇培養(yǎng)基對(duì)目的微生物進(jìn)行富集培養(yǎng),最常用的方法是底物選擇,此外還包括營(yíng)養(yǎng)選擇及物理化學(xué)指標(biāo)選擇。但是由于富集培養(yǎng)選擇性地富集了具有快速生長(zhǎng)特性的菌群,因此導(dǎo)致大部分物種多樣性信息丟失。目前可以通過先在嚴(yán)格脅迫條件下短期處理,然后改為較溫和的處理?xiàng)l件,可以從一定程度上克服這種方法的局限性。基因組水平富集常用的技術(shù)為穩(wěn)定同位素探針技術(shù)(SIP),原理是采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記底物,其中的“重”原子摻入到具有代謝活性的微生物核酸中,采用密度梯度離心的方法將“重”的DNA與“輕”組分分離,被標(biāo)記的“重”核酸可以作為PCR的模板,用來構(gòu)建宏基因組文庫。例如采用C標(biāo)記的甲醇研究森林土壤宏基因組DNA,結(jié)果鑒定出變形細(xì)菌α-亞綱中所有已知的嗜甲基菌,并在一種嗜酸菌中發(fā)現(xiàn)了新的甲醇還原酶基因。此外,還有報(bào)道利用抑制性消減雜交技術(shù)、差異顯示技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、親和捕獲技術(shù)及DNA微陣技術(shù)等技術(shù)來富集目的基因。3.2宏基因組DNA的提取獲得高濃度、大片段、無偏好的環(huán)境樣品總DNA是宏基因組文庫構(gòu)建的難點(diǎn)之一。近年已有多種宏基因組DNA的提取純化方法陸續(xù)建立起來,大體可分為兩類:一類是直接提取法,又稱原位提取法。這類方法不經(jīng)過樣品中微生物的培養(yǎng)和分離,通過化學(xué)法、酶解法或物理法直接破碎環(huán)境中的微生物細(xì)胞而使DNA得以釋放,并對(duì)DNA進(jìn)行純化。其中以Zhou法和Tsai法最為常用。該法操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、成本低,所獲得DNA具有較好的完整性,并能夠代表某一生境的微生物群落多樣性。但該發(fā)放常會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞裂解不完全或DNA與土壤雜質(zhì)成分產(chǎn)生共沉淀而無法有效地去除等問題,所以一般需要進(jìn)一步的DNA純化處理,同時(shí)所提取獲得的DNA片段較小(1kb~50kb),主要適用于小片段文庫的構(gòu)建;另一類是間接提取法,即異位提取法,是利用離心介質(zhì)或者梯度離心等方法先把微生物從環(huán)境篩選到脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、乙醇氧化酶、木聚糖酶、纖維素酶及脫羧酶等酶制劑,并且在此基礎(chǔ)上獲得新酶的許多特征信息(表1)。所采用的載體種類十分廣泛,包括Fosmid、Cosmid、BAC、λ噬菌體以及各種穿梭載體,所采用的宿主系統(tǒng)為常用的大腸桿菌、鏈霉菌和假單胞菌等。通過宏基因文庫篩選得到的生物分子大多數(shù)與已知的基因產(chǎn)物相似性差或者完全是新的分子,這些新的生物分子主要來源于環(huán)境未培養(yǎng)微生物的基因和其多樣的代謝物。環(huán)境樣品DNA的克隆和篩選只是所有環(huán)境遺傳信息多樣性的一小部分,環(huán)境微生物和宏基因組的多樣性仍舊是發(fā)現(xiàn)新的天然活性產(chǎn)物的豐富廣闊資源,為研究者們探索開發(fā)新的生物催化劑提供了巨大的資源空間。新型催化劑主要是酶。傳統(tǒng)的新型酶的篩選方法限制了篩選的廣泛性和有效性。宏基因組學(xué)則克服了這一限制，有效地提高了新酶的篩選效率，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了抗生素及維生素生物合成相關(guān)基因簇的克隆,以及水解酶類和氧化還原酶類編碼的基因。宏基因組技術(shù)通過對(duì)環(huán)境的直接克隆，為研究和利用占微生物99%以上的非培養(yǎng)微生物提供了新的途徑，為微生物的研究和發(fā)展提供了全新的策略。但此技術(shù)的開發(fā)利用還有許多亟待解決的問題：如上面提及的兩種DNA的提取方法各有其缺陷，使獲得的DNA不能完全代表樣品DNA組成，這就需要進(jìn)一步優(yōu)化樣品DNA的提取方法。另外，應(yīng)根據(jù)篩選目的選用合適的載體和宿主菌。再者，文庫的篩選方法有待進(jìn)一步完善，對(duì)于序列篩選法來說主要是測(cè)序的速度和費(fèi)用問題，功能篩選法則需克服從幾萬到幾十萬個(gè)克隆中只能篩選到幾個(gè)有活性的基因的狀況，應(yīng)建立更為敏感的高通量篩選方法。宏基因組學(xué)技術(shù)克服了傳統(tǒng)新型酶的篩選方法在篩選的廣泛性和有效性不足這一缺點(diǎn),在新型生物酶制劑的開發(fā)應(yīng)用上有著長(zhǎng)足的進(jìn)步。目前已經(jīng)從構(gòu)建的宏基因組文庫(如海底淤泥、溫泉淤泥、動(dòng)物糞便、動(dòng)物瘤胃內(nèi)容物等)成功篩選到蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、纖維素酶、水解酶類和氧化還原酶類等酶制劑。4.3宏基因組學(xué)在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用宏基因組技術(shù)的出現(xiàn)為新藥物的探索和發(fā)現(xiàn)提供了可能的技術(shù)支持,并擴(kuò)大了微生物代謝產(chǎn)物及分子活性物質(zhì)篩選平臺(tái)。例如早在2000年,Wang等構(gòu)建土壤宏基因組文庫,通過文庫篩選獲得TerragineA及其相關(guān)成分,目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)治療領(lǐng)域,證明了自然環(huán)境中的豐富微生物代謝產(chǎn)物可以通過宏基因組技術(shù)為人們所利用;同年Brady等從土壤宏基因組文庫中篩選發(fā)現(xiàn)一種長(zhǎng)鏈N-酰氨基酸抗生素物質(zhì);并在2004年構(gòu)建鳳梨科植物樹莖流出液宏基因組文庫,篩選鑒定獲得了抗菌物質(zhì)PalmitoylPutrescine。2001年Macneil等構(gòu)建了土壤宏基因組BAC文庫,通過序列分析篩選獲得5個(gè)能產(chǎn)生抗菌小分子物質(zhì)靛玉紅并對(duì)其相關(guān)成分進(jìn)行研究;2002年Gillespie等構(gòu)建土壤宏基因組文庫篩選獲得兩種抗菌物質(zhì)TurbomycinA和B,并且發(fā)現(xiàn)TurbomycinA和B對(duì)革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌具有廣譜抗菌活性;2003年DiazTorres等通過構(gòu)建人唾液宏基因組文庫,篩選獲得一種新的四環(huán)素抗性基因Tet(37),該活性物質(zhì)對(duì)四環(huán)素具有很好的抗性;2008年Mori等通過活性污泥宏基因組文庫篩選獲得兩種不同的博來霉素抗性基因,經(jīng)過比對(duì)發(fā)現(xiàn)于來源放射菌類基因差異較大,可能為新的博來霉素抗性基因。國(guó)內(nèi)在利用宏基因組技術(shù)獲取新型藥物的研究較少,尚處于萌芽階段,趙晶等從南極中山站排污口采集污泥,構(gòu)建宏基因組文庫,并通過差異性DNA修復(fù)實(shí)驗(yàn)(DDRT)篩選得到具有抗腫瘤效應(yīng)的物質(zhì)。同時(shí)利用宏基因組技術(shù)研究探討人類腸道中不可培養(yǎng)微生物多樣性也有了很大進(jìn)展。如Kurokawa等利用宏基因組技術(shù)對(duì)13個(gè)處于不同年齡層的健康人體糞便微生物種群進(jìn)行了研究，結(jié)果分析表明未斷奶嬰兒的腸道微生物種群在系統(tǒng)發(fā)育和基因組成上具有較大個(gè)體差異性，而在成人及已斷奶兒童則呈現(xiàn)出高度的功能一致性，并對(duì)成人及嬰兒腸道內(nèi)編碼該生境微生物主要功能的基因家族的特性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的人類腸道微生物基因家族和一個(gè)共扼轉(zhuǎn)座子。2003年Breitbart等通過構(gòu)建宏基因組文庫對(duì)人體排放物中的未培養(yǎng)病毒多樣性進(jìn)行研究，經(jīng)過鳥槍測(cè)序法鑒定,獲得的病毒大約有1200種基因型，結(jié)果比對(duì)表明其基因序列與先前報(bào)道的病毒具有很大的差異性，大多數(shù)為新病毒,并證明這些病毒極有可能與人類的疾病有著密切的關(guān)系。2008年Finkbeiner等通過構(gòu)建12個(gè)腹瀉小孩腸道內(nèi)容物宏基因組文庫，來觀察病人腸道中病毒的生物多樣性，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增得到的病毒序列與GenBank病毒庫中的已知序列同源性很低,并推斷這些病毒極有可能與人類的腹瀉疾病有著密切的關(guān)系。隨著宏基因組技術(shù)的成熟，必將加快宏基因組技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。在人體微生物抗藥性的研究,人體與不可培養(yǎng)病原菌的相互關(guān)系的探索等方面將做出重大貢獻(xiàn)。宏基因組技術(shù)突破了大量微生物無法通過純培養(yǎng)方法而進(jìn)行研究的束縛，為新藥的開發(fā)和利用提供了技術(shù)支持,相信隨著宏基因組技術(shù)的成熟，該技術(shù)在發(fā)現(xiàn)新基因、研究人體微生物抗藥性以及與不可培養(yǎng)病原微生物的相互關(guān)系方面做出重大貢獻(xiàn)。4.4宏基因組學(xué)在氣候變化中的應(yīng)用由人類活動(dòng)引起的全球氣候變化問題一直備受關(guān)注。其中,溫室氣體特別是CO2濃度的上升引起的全球變暖問題尤其受到關(guān)注。氣候變暖將對(duì)地球碳氮等物質(zhì)循環(huán)、陸地及海洋生態(tài)系統(tǒng)功能等產(chǎn)生重大影響。同時(shí),地球化學(xué)物質(zhì)循環(huán)(如碳、氮、磷、硫等)也是生態(tài)系統(tǒng)響應(yīng)氣候變化的關(guān)鍵過程,而微生物是該循環(huán)過程的主要驅(qū)動(dòng)力。近年來,宏基因組學(xué)的運(yùn)用為微生物對(duì)氣候變化響應(yīng)和反饋的研究提供了全新的視角,并取得了相當(dāng)大的進(jìn)展。例如,Danovaro等的研究表明,海洋中病毒的結(jié)構(gòu)、功能以及病毒與宿主的相互作用都受到全球氣候變化的影響,并反作用于全球氣候變化和物質(zhì)循環(huán)。另外,Simister等研究了珊瑚礁微生物群落對(duì)升溫的響應(yīng),發(fā)現(xiàn)處于生長(zhǎng)狀態(tài)的珊瑚礁上的微生物群落不受溫度升高的影響,而壞死珊瑚礁上的微生物的群落結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生了改變。上述研究結(jié)果都說明微生物群落的復(fù)雜性,不同的種群有不同的反應(yīng)機(jī)制,因此微生物群落的結(jié)構(gòu)與功能需要進(jìn)一步深入探討。Zhou等基于功能基因芯片的長(zhǎng)期增溫實(shí)驗(yàn)表明,土壤微生物群落結(jié)構(gòu)在增溫條件下發(fā)生了顯著改變,分解易降解碳的基因變得活躍,而分解難降解碳的基因并沒有顯著改變,保證了土壤碳存儲(chǔ)的相對(duì)穩(wěn)定。通過構(gòu)建微生物的分子生態(tài)學(xué)網(wǎng)絡(luò),Deng等發(fā)現(xiàn)不同氣溫條件下,微生物基因在網(wǎng)絡(luò)中扮演的角色以及相互作用規(guī)律發(fā)生了明顯改變。另外,功能基因芯片也被用于研究CO2濃度升高的效應(yīng)。CO2濃度升高刺激了調(diào)節(jié)重要物質(zhì)循環(huán)過程基因的活性,其中碳固定基因、易降解碳基因以及氮循環(huán)基因的數(shù)量明顯增多。另一方面,He(2012)基于系統(tǒng)發(fā)育芯片的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CO2濃度升高導(dǎo)致微生物可操作分類單元operationaltaxonomicunit，OTU)的豐度顯著增加。將上述兩種芯片分別進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建后發(fā)現(xiàn)微生物基因間的相互作用受到CO2濃度的顯著影響,且不同CO2濃度下發(fā)揮關(guān)鍵作用的特征基因和模塊的核心基因均不同。4.5宏基因組學(xué)在水處理工程系統(tǒng)中的應(yīng)用對(duì)水處理工程系統(tǒng)的微生物群落組成和功能研究,尤其是對(duì)活性污泥中微生物的研究,不僅有助于深入了解反應(yīng)器處理污染物的作用機(jī)理,更可以指示反應(yīng)器的性能,為系統(tǒng)運(yùn)行提供預(yù)警和管理措施。Ye等基于Illumina高通量測(cè)序的研究揭示了不同反應(yīng)器中微生物整體新陳代謝路徑相似,但參與特定糖類代謝和膜運(yùn)輸?shù)幕蝻@著不同。在不同污水處理反應(yīng)器和不同采樣時(shí)間條件下,微生物的降解基因豐度和多樣性有顯著差異,這一結(jié)果為監(jiān)測(cè)和評(píng)估活性污泥降解有機(jī)污染物和凈化廢水能力提供了重要依據(jù)。此外,Illumina技術(shù)的應(yīng)用還包括對(duì)飲用水氯消毒的微生物研究。研究發(fā)現(xiàn),微生物群落結(jié)構(gòu)顯著受到氯消毒的影響,抗性微生物和微生物的抗性基因都得到濃縮,其中變形菌(Proteobacteria)是優(yōu)勢(shì)抗性微生物。Ye和Zhang利用羅氏454測(cè)序技術(shù)也有效揭示了活性污泥中微生物的優(yōu)勢(shì)種群為研究活性污泥中的微生物群落結(jié)構(gòu)組成提供了重要信息。4.6宏基因組學(xué)在石油污染中的應(yīng)用如果原油或其他石油制品在開采、煉制、貯運(yùn)和使用過程中進(jìn)入環(huán)境,則容易造成環(huán)境污染,嚴(yán)重影響土壤和水的生態(tài)環(huán)境和質(zhì)量,甚至危害人類健康。目前,利用微生物降解對(duì)石油污染進(jìn)行生物修復(fù)越來越受到關(guān)注,其主要思路是通過調(diào)控土壤或水體的微生物生態(tài)環(huán)境,改變微生物群落結(jié)構(gòu),以提高微生物降解石油的活性和能力。對(duì)此學(xué)者已開展了對(duì)石油污染的土壤或水體中微生物群落特征的研究,希望能夠找到在降解污染過程中起作用的關(guān)鍵微生物或功能基因。Kostka等利用高通量測(cè)序技術(shù)研究了2010年墨西哥灣石油污染事件對(duì)沿海沙灘的影響,發(fā)現(xiàn)石油污染對(duì)微生物群落的豐度和組成有明顯的擾動(dòng),而γ變形菌(Gamma-proteobacteria)中的食堿菌屬(Alcanivorax)、海桿菌屬(Marinobacter)和α變形菌(Alpha-proteobacteria)中的紅桿菌科(Rhodobacteraceae)中的微生物對(duì)自然清除石油污染起了關(guān)鍵作用。這一成果被DosSantos使用454測(cè)序的工作所部分證實(shí),海細(xì)菌屬(Marinobacterium),海桿菌屬(Marinobacter)和解環(huán)菌屬(Cycloclasticus)微生物種群在石油污染的土壤中豐度增加,因此這些微生物可以用來作為表征石油污染的關(guān)鍵指示類群。5目前遇到的問題樣品的提取方法還有待改進(jìn)，生物信息分析依賴于樣品的復(fù)雜度。6結(jié)論鑒于99%以上的微生物無法通過培養(yǎng)來獲得,而這些微生物中又蘊(yùn)含了大量的有價(jià)值的活性物質(zhì)，所以宏基因組技術(shù)的利用就顯得尤為重要。所幸的是到目前為止已經(jīng)利用宏基因組技術(shù)獲得了許多全新的功能基因和活性物質(zhì)，在藥學(xué)和生物技術(shù)方面都有著重要的應(yīng)用。同時(shí)我們也應(yīng)該看到,作為一種新興的技